4蛋白质研究技术
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由于SDS在电泳条件下是带有负电荷的分子，同时它 有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基 酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是蛋白质分子中 每两个氨基酸残基结合一分子SDS。
加热和SDS使蛋白质变性，还原剂切断蛋白质中的二 硫键。多亚基蛋白质将解离为单亚基。
处理后，肽链都是处于无二硫键连接、分离的状态。
SDS-PAGE过程中，小分子走在前头，大分子滞后
电泳方向
混合样品 电泳后
大分子
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽 链分子量。 未 知 蛋 白
十二烷基磷酸钠侧链与氨基酸残基疏水侧链发生疏水作用
巯基乙醇
十二烷基磷酸钠
巯基乙醇用于切断二硫键
多肽链结合大量SDS后，基本上使多肽链覆盖上了相同密 度的负电荷。由于负电荷量很大，掩盖了不同蛋白质（多肽 链）间原来所带电荷的差别，使得不同的SDS-蛋白质复合物 具有几乎相同的荷质比（电荷/多肽链质量）。而且结合SDS 后蛋白质变性，大多都呈现相似的长椭圆棒形状。
亲和 层析
4.8 蛋白质氨基酸序列的确定
每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列。序列测定包括
确定多肽链的N末端和C末端氨基酸残基、测定氨基酸组成、 测定肽段氨基酸序列和确定二硫键位置等步骤。
洗脱
洗脱
洗脱
洗脱
4.4 凝胶层析
凝胶层析是按照蛋白质分子量 大小进行分离的技术，又称之凝胶过 滤、分子筛层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身是带有交联网状 的珠，像个“筛子”，不同类型凝胶 的筛孔的大小不同。
不同型号的凝胶都有一个分级分离 范围。Sephadex G-75的范围为3-70K， 只能分离分子量介于之间的分子
到30％，离心取上清 向上清继续加硫酸铵，直至浓度达到50％，离心收集沉淀
（含肌酸激酶），沉淀溶解于适当磷酸缓冲液溶液。
靶蛋白与 杂蛋白混 合溶液
加盐先使杂 蛋白沉淀
再向离心后的 上清继续加盐 使靶蛋白沉淀
盐析
经用的盐是硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等
• 硫酸铵：温度系数小而溶解度大,蛋白不易变性 25oC 4.1M =767g/L; 0oC 3.9M=676g/L 对蛋白氮的测定有干扰、缓冲力弱
被分离样品中各个成分受溶液pH影响，有的带正电荷，有 的带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。
象氨基酸、蛋白质那样在溶液中带电状况直接受到溶液pH 影响的样品，就可以利用离子交换层析进行分离。但要看杂蛋白 在该溶液中的带电状况决定用什么样的离子交换层析。
离子交换层析的固相是离子交换体，如离子交换树脂、 离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。
双向电泳后的凝胶经染 色后蛋白呈现二维分布图：
水平方向反映出蛋白在 pI上的差异，
垂直方向反映出它们在 分子量上的差别。
聚焦后凝 胶放置在 SDS凝胶 上，进行 第二向电 泳
第二向电泳： SDS-PAGE
pH9
pH9
pH3
分子量大 分子 量小
pH3
（＋） 高pH
等 电 聚 焦 电 泳 进 行 过 程 中
○ 曲线表示有活性部分
熊猫脑肌酸激酶纯化：G－100凝胶层析曲线
柱子尺寸：1.6cm×80cm
天花粉毒蛋白 天花粉毒蛋白纯化：G50凝胶过滤层析（1.8cm×100cm）
4. 5 离子交换层析
离子交换层析是利用在一定pH下不同蛋白质带电种类和电 荷量的差异进行分离的技术。柱基质是合成的结合了带电基团的 聚合物。离子交换层析分为阴离子交换层析和阳离子交换层析。
低pH
（－）
（＋）
高pH
等 电 聚 焦 电 泳 结 束 后
（－）
低pH
双向电泳可以将分 子量相同而等电点 不同的蛋白质以及 等电点相同而分子 量不同的蛋白质分 开。
大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳图
一种目的 蛋白经5个纯 化步骤（分 别取样）的 凝胶电泳图
组织 匀浆
硫酸 铵分级
离子 交换
凝胶 过滤
一般电泳缓冲液的pH维持在碱性区，蛋白质带负电荷，向阳 极迁移。
电泳所用的介质通常是凝胶：淀粉凝胶、琼脂凝胶、聚丙烯 酰胺凝胶，蛋白质电泳通常是在聚丙烯酰胺凝胶中进行的。
1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂巯基乙醇的 样品处理液对蛋白质样品进行处理（煮沸3～5分钟）。
• SDS和巯基乙醇处理消除了蛋白质原有电荷和形状对电泳的影 响，电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白 质原有电荷和形状的影响，而主要取决于多肽链相对分子质 量，所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白 质的相对分子质量
• 在SDS-PAGE中，蛋白质通过凝胶的速率与它们分子量的对数 成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，它们的迁移速度比 小的蛋白质慢，这实际上是一种分子筛效应。
• 硫酸钠： 30oC以上溶解度太低， 盐析IgG
• 硫酸铵、硫酸钠含少量硫酸，浓溶液pH<4.5, 常需调pH
通过盐析制备的粗提液中盐的浓度都很高，不利于进一步 使用其他方法进行纯化，所以都要通过透析将盐浓度降低。
4.2 透 析
按照分子大
透析袋
小进行分离。
分离取决于 透析袋截留
浓缩的蛋白 混合样品
带有SO3－ 或COO－基团，以SO3－Na＋ 或COO－H＋形式 出现的叫做阳离子交换基，交换的是阳离子（Na＋或H+）， 使用阳离子交换基作为固相的称为阳离子交换层析。
带有N＋（C2H5）基团以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴 离子交换基，交换的是阴离子（ Cl－），使用阴离子交换基 作为固相的称为阴离子交换层析。
因此凝胶层析按照大分子先出来，小分子后出来将不同大小 的分子洗脱下来。
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
在一定条件下，被分离的蛋 白质的分子量的对数与其洗 脱时间（或洗脱体积）成线 性关系，利用分子量已知的 一组蛋白可做标准曲线。
未知蛋白也在同一条件下过 柱，根据得到的洗脱时间或 洗脱体积可从标准曲线求其 分子量
然后用起始液冲洗，冲洗掉没有结合在柱子 上的蛋白质，只有蛋白X和与它等电点相近的杂 蛋白吸附在柱上。
然后通过盐梯度洗脱，或提高pH的阶段洗 脱或梯度洗脱，获得目的蛋白级分
如果利用阳离子交换树脂从上述混合样品中 纯化目的蛋白，将如何设计实验呢？同学们可以 自己想想，该怎么进行实验。
加 样
阳 离 子 交 换 层 析 过 程
特异结合在基质上的目的蛋白最后可以用含有高浓度的游 离配体的溶剂洗下。有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提 高成百上千倍。
混合蛋白样 品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
Gal：半乳糖
天花粉 凝集素
天花粉凝集素的亲和层析分离
天花粉凝集素是对半乳糖专一的凝集素，用含半乳糖作配 体的琼脂糖交联产物胶进行亲和层析
的分子量。
透析液
开始透析
处于平衡状态
透析装置
透析过程
透析原理是依据分子大小进行分离。常用于用于脱盐, 将盐离子浓度调整到合适浓度，或置换为其它的盐离子溶 液。
透析用透析袋是一种赛璐玢(cellophane) 材料制成的具 有一定通透性的袋，不同规格的透析袋截留的分子量不同。
要透析的样品装入透析袋中，袋中留有一定空间后将 袋两端夹死。
然后置于事先加有透析液的烧杯中，进行透析，隔一段 时间更换一次透析液，一直达到透析要求为止。
经透析后的样品一般须用层析、电泳等方法进一步分级分离
4.3 层析原理
层析也称之色谱，常用于溶液中蛋白质混合物的分级分 离，通常都是在装有不同固相介质的柱子中进行的。
基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，样品中的各 个成分与固相相互作用不同，样品中的各个成分通过固相的速 率产生差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。
4.7 电泳
水平纸电泳示意图
样品加在滤纸中间
（凝胶）电泳
电泳能够告诉两个信息：蛋白质亚基的大小及其浓度
电泳的原理：利用不同蛋白质在电场中迁移率的差别达到分 离目的。 一方面不同蛋白质分子在特定电泳缓冲液中因其氨 基酸组成不同，其携带的静电荷不尽相同，致使它们在电场 中的迁移率各异，从而达到分理的目的，另一方面电泳所用 的介质通常是凝胶，凝胶有很多的孔，因此，蛋白质的迁移 速率不仅和它所带的电荷有关还与它的大小相关。
电泳
pI值沿着pH
梯度分布
（＋） 高pH
等 电 聚 焦 电 泳 进 行 过 程 中
低pH （－）
（＋）
高pH
等 电 聚 焦 电 泳 结 束 后
（－）
低pH
3.双向电泳
是一种将等电聚焦电泳 与SDS-PAGE结合的分辨率更 高的一种电泳
第一向电 泳：等电 聚焦电泳
第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS-PAGE
相对迁移率
2. 等电聚焦电 泳（ IFE）
利用聚丙烯酰 胺凝胶内的缓冲液 在电场作用下沿电 场方向在凝胶内制 造一个pH梯度。
每种蛋白质都 将迁移至与它的pI 相一致的pH处。
凝胶中加有 两性电解质 （pH9-3）
加电场后 在凝胶内形 成一个稳定 pH梯度
加样品， 凝胶染色wk.baidu.com明
然后继续 样品按照各自
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶层析原理
比凝胶珠孔径大的蛋白质分子由于不能进入珠内移动得快， 直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。
比凝胶珠孔径小的分子由于可进入凝胶珠的内部，走的路径 长，移动较慢，后被洗脱下来。
平 衡 液 洗
蛋白质
离子交 换树脂
高离子 强度洗 脱液洗
高离子 强度洗 脱液洗
收集
4.6 亲和层析
亲和层析是一种最有选择性的柱层析，是根据蛋白质和它 的配体之间的相互作用进行分离。配体先通过共价键与柱基质 结合，配体可以是酶底物，或是一种抗目的蛋白的抗体。
当含有目的蛋白的混合物通过装有连接了配体的柱基质的 亲和层析柱时，只有目的蛋白可以特异地与配体结合，而其它 没有结合的蛋白质直接被洗脱下来。
• 但这种分子筛效应不同于凝胶过滤层析中的分子筛效应。在 凝胶过滤层析中，大分子被排出在凝胶的孔径之外，因此移 动很快; 在SDS-PAGE中，所有分子都穿过凝胶，很显然大分 子的迁移是最慢的。
• 凝胶通过考马斯亮蓝染色出现不同的蓝色蛋白带。
SDS-PAGE 一般用垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
层析因固相介质不同又分为凝胶层析（分子筛层析）、离 子交换层析和亲和层析等各种层析。
➢ 将固相成分，例如 葡聚糖凝胶、纤维素、 树脂填充到柱子中， 用平衡液平衡。
固相 介质
➢ 然后加样品，再用 适当的溶剂洗脱。
➢ 样品中各种成分以 不同速率被洗脱出来。
➢柱子的排出液，又称 洗脱液，被分成很多 份收集起来。每份蛋 白质浓度可用280nm 的光吸收来确定。
4 蛋白质研究技术
大多蛋白分离纯化在 0-4oC的低温下进行
4.1 蛋白质的初步纯化：
依据不同蛋白质在不同盐浓度中溶解度不同, 用盐析方法可 对蛋白质进行初步纯化。
盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低 而析出的过程，常用于蛋白质的分级分离。
例如从猪骨骼肌提取肌酸激酶： 将新鲜猪肉与磷酸缓冲液混合，用匀浆器进行匀浆 匀浆液离心分为上清和沉淀，肌酸激酶在上清，取上清 上清通过盐析进行分级， 向上清中加硫酸铵粉末，使浓度达
举一例子：
已知蛋白质 X 等电点为6，设计一个利用阴离子交 换柱从混有该蛋白的样品中纯化该蛋白的实验。（假设 混合样品中含有的杂蛋白的pI与目的蛋白的pI绝对值都 相差1以上）。
答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5 的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH7.0以上的缓冲 液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混 合液上样，
阳离子交换基
强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂
阴离子交换基
强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨乙基纤维素
时刻要记住：
蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以 蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带 电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。
当蛋白质pH > pI时，蛋白质带净负电荷； 当蛋白质pH < pI时， 蛋白质带净正电荷。
加热和SDS使蛋白质变性，还原剂切断蛋白质中的二 硫键。多亚基蛋白质将解离为单亚基。
处理后，肽链都是处于无二硫键连接、分离的状态。
SDS-PAGE过程中，小分子走在前头，大分子滞后
电泳方向
混合样品 电泳后
大分子
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
电泳 缓冲液
加在槽中的经 SDS处理的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片
标准蛋白分子量
在一定的凝胶浓度下， 多肽链分子量的对数与 多肽链的相对迁移率成 线性关系，所以可以通 过标准曲线求未知多肽 链分子量。 未 知 蛋 白
十二烷基磷酸钠侧链与氨基酸残基疏水侧链发生疏水作用
巯基乙醇
十二烷基磷酸钠
巯基乙醇用于切断二硫键
多肽链结合大量SDS后，基本上使多肽链覆盖上了相同密 度的负电荷。由于负电荷量很大，掩盖了不同蛋白质（多肽 链）间原来所带电荷的差别，使得不同的SDS-蛋白质复合物 具有几乎相同的荷质比（电荷/多肽链质量）。而且结合SDS 后蛋白质变性，大多都呈现相似的长椭圆棒形状。
亲和 层析
4.8 蛋白质氨基酸序列的确定
每一种蛋白质都具有唯一的氨基酸序列。序列测定包括
确定多肽链的N末端和C末端氨基酸残基、测定氨基酸组成、 测定肽段氨基酸序列和确定二硫键位置等步骤。
洗脱
洗脱
洗脱
洗脱
4.4 凝胶层析
凝胶层析是按照蛋白质分子量 大小进行分离的技术，又称之凝胶过 滤、分子筛层析或排阻层析。
单个凝胶珠本身是带有交联网状 的珠，像个“筛子”，不同类型凝胶 的筛孔的大小不同。
不同型号的凝胶都有一个分级分离 范围。Sephadex G-75的范围为3-70K， 只能分离分子量介于之间的分子
到30％，离心取上清 向上清继续加硫酸铵，直至浓度达到50％，离心收集沉淀
（含肌酸激酶），沉淀溶解于适当磷酸缓冲液溶液。
靶蛋白与 杂蛋白混 合溶液
加盐先使杂 蛋白沉淀
再向离心后的 上清继续加盐 使靶蛋白沉淀
盐析
经用的盐是硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等
• 硫酸铵：温度系数小而溶解度大,蛋白不易变性 25oC 4.1M =767g/L; 0oC 3.9M=676g/L 对蛋白氮的测定有干扰、缓冲力弱
被分离样品中各个成分受溶液pH影响，有的带正电荷，有 的带负电荷，此时就可利用离子交换层析方法进行样品的分离。
象氨基酸、蛋白质那样在溶液中带电状况直接受到溶液pH 影响的样品，就可以利用离子交换层析进行分离。但要看杂蛋白 在该溶液中的带电状况决定用什么样的离子交换层析。
离子交换层析的固相是离子交换体，如离子交换树脂、 离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。
双向电泳后的凝胶经染 色后蛋白呈现二维分布图：
水平方向反映出蛋白在 pI上的差异，
垂直方向反映出它们在 分子量上的差别。
聚焦后凝 胶放置在 SDS凝胶 上，进行 第二向电 泳
第二向电泳： SDS-PAGE
pH9
pH9
pH3
分子量大 分子 量小
pH3
（＋） 高pH
等 电 聚 焦 电 泳 进 行 过 程 中
○ 曲线表示有活性部分
熊猫脑肌酸激酶纯化：G－100凝胶层析曲线
柱子尺寸：1.6cm×80cm
天花粉毒蛋白 天花粉毒蛋白纯化：G50凝胶过滤层析（1.8cm×100cm）
4. 5 离子交换层析
离子交换层析是利用在一定pH下不同蛋白质带电种类和电 荷量的差异进行分离的技术。柱基质是合成的结合了带电基团的 聚合物。离子交换层析分为阴离子交换层析和阳离子交换层析。
低pH
（－）
（＋）
高pH
等 电 聚 焦 电 泳 结 束 后
（－）
低pH
双向电泳可以将分 子量相同而等电点 不同的蛋白质以及 等电点相同而分子 量不同的蛋白质分 开。
大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳图
一种目的 蛋白经5个纯 化步骤（分 别取样）的 凝胶电泳图
组织 匀浆
硫酸 铵分级
离子 交换
凝胶 过滤
一般电泳缓冲液的pH维持在碱性区，蛋白质带负电荷，向阳 极迁移。
电泳所用的介质通常是凝胶：淀粉凝胶、琼脂凝胶、聚丙烯 酰胺凝胶，蛋白质电泳通常是在聚丙烯酰胺凝胶中进行的。
1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂巯基乙醇的 样品处理液对蛋白质样品进行处理（煮沸3～5分钟）。
• SDS和巯基乙醇处理消除了蛋白质原有电荷和形状对电泳的影 响，电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白 质原有电荷和形状的影响，而主要取决于多肽链相对分子质 量，所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白 质的相对分子质量
• 在SDS-PAGE中，蛋白质通过凝胶的速率与它们分子量的对数 成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，它们的迁移速度比 小的蛋白质慢，这实际上是一种分子筛效应。
• 硫酸钠： 30oC以上溶解度太低， 盐析IgG
• 硫酸铵、硫酸钠含少量硫酸，浓溶液pH<4.5, 常需调pH
通过盐析制备的粗提液中盐的浓度都很高，不利于进一步 使用其他方法进行纯化，所以都要通过透析将盐浓度降低。
4.2 透 析
按照分子大
透析袋
小进行分离。
分离取决于 透析袋截留
浓缩的蛋白 混合样品
带有SO3－ 或COO－基团，以SO3－Na＋ 或COO－H＋形式 出现的叫做阳离子交换基，交换的是阳离子（Na＋或H+）， 使用阳离子交换基作为固相的称为阳离子交换层析。
带有N＋（C2H5）基团以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做阴 离子交换基，交换的是阴离子（ Cl－），使用阴离子交换基 作为固相的称为阴离子交换层析。
因此凝胶层析按照大分子先出来，小分子后出来将不同大小 的分子洗脱下来。
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
在一定条件下，被分离的蛋 白质的分子量的对数与其洗 脱时间（或洗脱体积）成线 性关系，利用分子量已知的 一组蛋白可做标准曲线。
未知蛋白也在同一条件下过 柱，根据得到的洗脱时间或 洗脱体积可从标准曲线求其 分子量
然后用起始液冲洗，冲洗掉没有结合在柱子 上的蛋白质，只有蛋白X和与它等电点相近的杂 蛋白吸附在柱上。
然后通过盐梯度洗脱，或提高pH的阶段洗 脱或梯度洗脱，获得目的蛋白级分
如果利用阳离子交换树脂从上述混合样品中 纯化目的蛋白，将如何设计实验呢？同学们可以 自己想想，该怎么进行实验。
加 样
阳 离 子 交 换 层 析 过 程
特异结合在基质上的目的蛋白最后可以用含有高浓度的游 离配体的溶剂洗下。有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提 高成百上千倍。
混合蛋白样 品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
Gal：半乳糖
天花粉 凝集素
天花粉凝集素的亲和层析分离
天花粉凝集素是对半乳糖专一的凝集素，用含半乳糖作配 体的琼脂糖交联产物胶进行亲和层析
的分子量。
透析液
开始透析
处于平衡状态
透析装置
透析过程
透析原理是依据分子大小进行分离。常用于用于脱盐, 将盐离子浓度调整到合适浓度，或置换为其它的盐离子溶 液。
透析用透析袋是一种赛璐玢(cellophane) 材料制成的具 有一定通透性的袋，不同规格的透析袋截留的分子量不同。
要透析的样品装入透析袋中，袋中留有一定空间后将 袋两端夹死。
然后置于事先加有透析液的烧杯中，进行透析，隔一段 时间更换一次透析液，一直达到透析要求为止。
经透析后的样品一般须用层析、电泳等方法进一步分级分离
4.3 层析原理
层析也称之色谱，常用于溶液中蛋白质混合物的分级分 离，通常都是在装有不同固相介质的柱子中进行的。
基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，样品中的各 个成分与固相相互作用不同，样品中的各个成分通过固相的速 率产生差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。
4.7 电泳
水平纸电泳示意图
样品加在滤纸中间
（凝胶）电泳
电泳能够告诉两个信息：蛋白质亚基的大小及其浓度
电泳的原理：利用不同蛋白质在电场中迁移率的差别达到分 离目的。 一方面不同蛋白质分子在特定电泳缓冲液中因其氨 基酸组成不同，其携带的静电荷不尽相同，致使它们在电场 中的迁移率各异，从而达到分理的目的，另一方面电泳所用 的介质通常是凝胶，凝胶有很多的孔，因此，蛋白质的迁移 速率不仅和它所带的电荷有关还与它的大小相关。
电泳
pI值沿着pH
梯度分布
（＋） 高pH
等 电 聚 焦 电 泳 进 行 过 程 中
低pH （－）
（＋）
高pH
等 电 聚 焦 电 泳 结 束 后
（－）
低pH
3.双向电泳
是一种将等电聚焦电泳 与SDS-PAGE结合的分辨率更 高的一种电泳
第一向电 泳：等电 聚焦电泳
第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS-PAGE
相对迁移率
2. 等电聚焦电 泳（ IFE）
利用聚丙烯酰 胺凝胶内的缓冲液 在电场作用下沿电 场方向在凝胶内制 造一个pH梯度。
每种蛋白质都 将迁移至与它的pI 相一致的pH处。
凝胶中加有 两性电解质 （pH9-3）
加电场后 在凝胶内形 成一个稳定 pH梯度
加样品， 凝胶染色wk.baidu.com明
然后继续 样品按照各自
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶层析原理
比凝胶珠孔径大的蛋白质分子由于不能进入珠内移动得快， 直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。
比凝胶珠孔径小的分子由于可进入凝胶珠的内部，走的路径 长，移动较慢，后被洗脱下来。
平 衡 液 洗
蛋白质
离子交 换树脂
高离子 强度洗 脱液洗
高离子 强度洗 脱液洗
收集
4.6 亲和层析
亲和层析是一种最有选择性的柱层析，是根据蛋白质和它 的配体之间的相互作用进行分离。配体先通过共价键与柱基质 结合，配体可以是酶底物，或是一种抗目的蛋白的抗体。
当含有目的蛋白的混合物通过装有连接了配体的柱基质的 亲和层析柱时，只有目的蛋白可以特异地与配体结合，而其它 没有结合的蛋白质直接被洗脱下来。
• 但这种分子筛效应不同于凝胶过滤层析中的分子筛效应。在 凝胶过滤层析中，大分子被排出在凝胶的孔径之外，因此移 动很快; 在SDS-PAGE中，所有分子都穿过凝胶，很显然大分 子的迁移是最慢的。
• 凝胶通过考马斯亮蓝染色出现不同的蓝色蛋白带。
SDS-PAGE 一般用垂直板 电泳装置
加样
样品迁 移方向
层析因固相介质不同又分为凝胶层析（分子筛层析）、离 子交换层析和亲和层析等各种层析。
➢ 将固相成分，例如 葡聚糖凝胶、纤维素、 树脂填充到柱子中， 用平衡液平衡。
固相 介质
➢ 然后加样品，再用 适当的溶剂洗脱。
➢ 样品中各种成分以 不同速率被洗脱出来。
➢柱子的排出液，又称 洗脱液，被分成很多 份收集起来。每份蛋 白质浓度可用280nm 的光吸收来确定。
4 蛋白质研究技术
大多蛋白分离纯化在 0-4oC的低温下进行
4.1 蛋白质的初步纯化：
依据不同蛋白质在不同盐浓度中溶解度不同, 用盐析方法可 对蛋白质进行初步纯化。
盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低 而析出的过程，常用于蛋白质的分级分离。
例如从猪骨骼肌提取肌酸激酶： 将新鲜猪肉与磷酸缓冲液混合，用匀浆器进行匀浆 匀浆液离心分为上清和沉淀，肌酸激酶在上清，取上清 上清通过盐析进行分级， 向上清中加硫酸铵粉末，使浓度达
举一例子：
已知蛋白质 X 等电点为6，设计一个利用阴离子交 换柱从混有该蛋白的样品中纯化该蛋白的实验。（假设 混合样品中含有的杂蛋白的pI与目的蛋白的pI绝对值都 相差1以上）。
答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5 的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH7.0以上的缓冲 液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混 合液上样，
阳离子交换基
强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂
阴离子交换基
强碱性，聚苯乙烯树脂 弱碱性，二乙氨乙基纤维素
时刻要记住：
蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以 蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带 电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。
当蛋白质pH > pI时，蛋白质带净负电荷； 当蛋白质pH < pI时， 蛋白质带净正电荷。