生物固氮的15N2同位素示踪直接测定方法

（N a N non） E sample N a E atomsphere
则，样品中的N来自大气标记N的比例为
Patm
Na
Na Nnon
Esample E a tom she re
固氮的N量为
Na
N total
E sam ple E atomshere
在整个固氮暴露过程中，也许由于系统外大 气的泄入或土壤N2的发射对气相标记15N2的稀释 作用，使得Eatomshere并不恒定，而是随时间减少 的，因此计算时应取算术或积分平均值。
打开活塞b、c 、d、e 和f, 关闭活塞g, 从活 塞f处对Y和Z抽真空, 关闭活塞c , 打开活塞a , 小 心地打开活塞b 使X瓶中15N2的进入Y,待分液漏斗 中的水完全置换出X瓶中的15N2 气体后, 关闭活塞 b。关闭活塞e并打开活塞c, 从处放水进入Y中， 置换15N2气体使其转至烧瓶Z , 关紧活塞d, 由活栓 f连通Z和V, 并打开活塞c和g，从处加水至Z中。
装置
制备装置如图所示。各玻璃部分间是通过涂 抹硅油的磨口接合并用耐压管道连结。图中Y和Z 分别为KMnO4-KOH和Na2SO4-H2SO4吸存器，15N2气贮 存瓶（V）与另一只瓶子（W）连结, 可以防止空 气回流到V。选用大小不同的圆底烧瓶, 可以使X、 Y 和Z部分的容积, 比试剂在一个大气压下产生的 15N2 的总体积稍微大一些，这时装置内部的气压 应该小于大气压。
表.在原位条件下水稻根际大气固氮与固定氮的植物吸收
4.举例
参见：Atmospheric dinitrogen fixation in the flooded rice rhizosphere as determined by the N-15 isotope technique. Soil Sci. Plant Nutr., 16 (4), 551-559, 1980
2.固氮测定装置和流程
固氮生长箱的室C与A和B通过涂抹硅油的磨 砂平边接合在一起，在D、E、F、G和H管口有聚 四 依氟次乙通烯过栓碱塞性阀高，锰整酸个钾容溶器液保和持酸气性密硫状酸态钠溶。液15N并2 F用口真引空入泵玻抽璃真容空器，。当在水15下N2的引泥入土前中，由气于密负容压器冒先出 气 容泡器时中，的继压续力且达保 到持 大几 气分 压钟 。后 为， 了然保后持作引物入的15N生2 使理 条件，使用空气泵通过二氧化碳缓冲溶液循环密 封室上端的（进口D和出口E）的大气相。缓冲溶 液 缓 度由冲维混液持合的在物构80组成0p成比pmK例。2C可O3以（调1/节20，M）以-便KH顶CO部3（的1/C1O02浓M），
步骤
在烧瓶X中放入(15NH4)2SO4，分液漏斗中加 入相应数量的次嗅酸盐一碘溶液。在Y和Z中分别 加入KMnO4-KOH溶液和Na2SO4-H2SO4溶液, 约到其 容积的1/10即可。用真空泵从处抽气, 使X的真 空度达到大约10-2-10-3托，关闭活栓a ，然后打 开分液漏斗的活栓, 将次嗅酸盐一碘溶液滴入X中 , 产生15N2气，在产气过程结束后， 将蒸馏水加 入分液漏斗, 并使蒸馏水滴入烧瓶X中，当瓶中 15N2的压力稍大于大气压力时, 滴漏过程便自动停 止。
这样纯化后的15N2气体就被转移至事先装满水的 贮存瓶V中, 从V 排水至W瓶, 这种布置可阻止空气 从活栓h 处回流 15N2气完全转移到瓶V中之后, 将 它和瓶W一起, 从活栓f和g之间, 与整个装置系统 开。
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图.制备15N2的装置。X， 15N2发生器；Y，KMnO4（5%，w/v）-KOH（2.5%） 吸存器；Z，Na2SO4（20%）-H2SO4（5%,v/v）吸存器；V， 15N2 存储瓶；W， 排水存储瓶。1.蒸馏水，2.次溴酸盐-碘溶液；3（15NH4）2SO4；4. KMnO4 KOH溶液;5. Na2SO4-H2SO4 。
用15N同位素测定生物固氮的方法可分为间
接和直接两种方法，间接测定又包括15N富集同位 素示踪法和用15N自然丰度变异法，该两种方法均 需要参比作物或已知参比值以确定生物的固氮量， 因此一般有很大的不确定性，固氮量的确定只能 是半定量的；直接测定法是将联合固氮系统暴露 在15N2气氛围中，通过直接测定15N吸收同化而确 定其固氮的方法，这种方法是一种定量测定生物 固氮的方法，但需要将固氮系统封闭在一个气密 的固氮暴露箱内，操作比较复杂，另外标记同位 素花费较高，因此长期以来在研究应用并不十分 广泛，然而随着DNA或RNA探针技术的发展，直接 固氮测定法在测定固氮和确定固氮微生物的基础 研究方面将展示广阔的应用前景。
1.15N2的制备、纯化和存储
制得，15N即2可由15N标记铵盐在碱性条件下和次溴酸盐反应
试剂
15
NH
4
2OBr
- 15 N 2
Br2
2H 2O
用Bremner法制备次溴酸盐一碘溶液。将400克NaOH 溶解到60毫升水中，将此NaOH溶液的一半加入带有温度 计并以碎冰冷却的一公升Ernlemeyer烧瓶中，将120毫 升Br2缓慢地、逐滴地加入, 猛烈搅拌, 使温度保持在5 ℃ 以下，再加入另一半NaOH溶液，将此混合液搅拌几分钟， 在冰箱中贮存一个星期之后, 将沉淀的NaBr结晶与上清 液分开，用等体积的KI溶液（0.2%，w/v）稀释上清液。 1 毫升这种溶液可以使5-6毫克NH3+氧化成N2。 K2M0N克O1N40-a0KS毫OOH4升,溶得水液到中，N依1a0S次0O毫4溶–升解H2硫5S克O酸4溶K溶M液n液4和。（2.55%克，KvO/Hv,）制中成溶解
图.15N2暴露气密性生长室。A茎室；B，中间室；C，根室；D
大气循环进口；E，大气循环出口；F， 15N2 气体入口；G， 气体采样器附件；H，排水孔。
3.同位素化学计量关系
设样品中N来自大气标记Natm和非大气非标记 Nnon两部分组成，其15N原子百分超为Esample，且 大气标记15N的原子百分超为Eatomsphere，则由 同位素质量平衡，有