westernblot详细图解
WESTERNBLOT操作步骤图PPT课件
1
图中绿色的是夹玻璃片的架子
2
玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠 外，长玻璃靠内。
3
然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以 免漏胶。 图示两块玻璃板放在一个架子上。
4
配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸 取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层 水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要 放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液
33
将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中
34
室温下脱色摇床上摇动封闭1h。 35
按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4℃ 过夜或37℃ 3h。
36
第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min，然后加 入TBS液中，按稀释浓度滴加二抗。室温孵育1h,再用 TBST洗三次每次10min。最后DAB显色或者化学发光法 显影。
封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
5
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可 灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
6
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电泳时间一般1-2 h，电压为100V较好，也可用60V。电
泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。
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取出转移槽
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2020/3/6
可编辑修改
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取下玻璃板
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两块玻璃板都已经取下
westernblot详细图解
westernblot详细图解Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示
B-5 上样与电泳 每孔上样量为 20-40 μg 蛋白，使用 10 微升枪头或注射针头，勿溢出加样孔
C 转膜与显色（Western Blot）
清 无色蛋白条带清晰，（膜也可以用 TBST 或水重新洗后再进行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用 TBST 洗后进行封闭。
C-4 膜的封闭 为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，传统上有 两种封闭液：脱脂奶粉或 BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白， 该蛋白 本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）图示
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot ,WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转 移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行蛋白质分 析最流行和成熟的技术之一。
培养细胞总蛋白提取试剂 哺乳动物组织总蛋白提取试剂
配制 5%脱脂奶粉或 BSA 溶液：每 100 ml TBST 中加入 5 g 脱脂奶粉或 BSA，混匀后过滤，如不过滤会导 致使膜污染上细微黑颗粒。 封闭时，4°C 摇动，封闭 1 hour ，再用 TBST 洗 5 秒，进入下一步抗体的孵育。
C-5 一抗的孵育 孵育 Buffer：按抗体说明书建议的稀释倍数，用 TBST 稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参 照 一般推荐的稀释倍数(1:100-1:3000)，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。 C-6 二抗的孵育 一抗孵育结束后，用 TBST 摇动洗膜数次，每次 5min 或更长，去除残留的一抗。 孵育 Buffer 和稀释倍数：用 TBST 按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常 规 的倍数稀释(1:1000- 1:20,000)预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。室温、1-2 hours, 摇动 二抗连接物：推荐使用二抗连接 HRP，不建议连接 AP 碱性磷酸酶，因其不够灵敏。
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
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上样缓冲液 Loading buffer
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一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
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3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
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3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
westernblot详细图解
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心0 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
四、SDS－PAGE电泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3. 电泳
电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
《westernblot讲解》PPT课件
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精选课件ppt
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 中文名字是N,N,N',N'-四甲基二乙胺。 用于配制PAGE胶等。TEMED可以催化过硫酸铵
从而产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚 合。 注意事项： 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 易挥发，使用后请盖紧瓶盖。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性 手套,戴口罩操作。
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精选课件ppt 25
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图像分析
精选课件ppt
将胶片扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析 目标带的分子量和净光密度值。
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注释
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SDS为十二烷基硫酸钠，它是一种阴离子表面 活性剂，与蛋白质结合成复合物，使不同的蛋 白质带上相同离子的负电荷，从而消除蛋白质 之间原有的电荷差异。SDS为一种变性剂，能 破坏蛋白质分之中的氢键和疏水键、巯基乙醇 能打开二硫键。蛋白质在电泳中的迁移率D和 分子量M成对数关系。IgM=K-ɑde/do=K-ɑD
试剂。
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仪器：电转移装置（实验室为Bio-Rad公司装 置） 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分 光光度仪、-20℃低温冰箱、垂直板电泳转移 装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
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样品制备
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样品制备包括单层贴壁细胞总蛋白的提取、组 织总蛋白的提取、加药物处理的贴壁细胞总蛋 白的提取。
含量测定
电泳
转膜
免疫反应
化学发光
图像分析
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试剂及仪器准备
《westernblot精华》PPT课件
3.大部分抗体收到后40C短暂保存1-2周对抗体活性是没有影 响的。
任何时候，绝对避免反复冻融！
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Western Blot常见问题分析
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SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
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封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深 )
5％脱脂奶粉封闭1h，置于摇床上。 封闭前，要用双蒸水洗3-5min,
剪膜
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一抗、二抗孵育
把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料盒中，根据滤膜面积以 0.1ml/cm2的量加入一抗溶液与滤膜温育（抗体浓度过高会导 致背景较深，过低会导致和抗原结合不充分，出现假阴性 ）。室温 不少于7小时，4 ℃时过夜。（一般）
10%-SDS
150ul
50ul
10%-APS
150ul
50ul
TEMED
15ul
10ul
精选课件pp
3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 30.0
分离范围（KD)
100-2000 80-500 60-400 40-200 25-150 6-100 6以下
精选课件ppt
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质和SDS结合
蛋白质印迹法westernblot应用介绍幻灯片PPT
(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到
SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。
转膜(Transfer)
半干转移法 将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 －|纸|胶|膜|纸|＋
凝胶浓度（％） 6 8 10 12 15
最佳分离范围（KD) 50-150 30-90 20-80 12-60 10-40
(1) SDS-PAGE凝胶配制 1、配制下层胶〔别离胶〕
静置1h后制上层胶〔浓缩胶〕 2、配制上层胶〔浓缩胶〕
加完后插上梳子，静置1h
制胶
制胶过程本卷须知：
➢操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 ➢加完别离胶后胶，加水液封时要很慢，否那么胶会 被冲变型。 ➢灌胶时开场可快一些，胶面快到所需高度时要放慢 速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不 会有气泡。 ➢别离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 ➢插梳子时要使梳子保持水平。
Western Blot流 程
收集蛋白样品
(Protein sample preparation)
〔1〕贴壁细胞蛋白样品收集
分屡次将细 胞收至一个 管中
A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。
B 参加PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心
收集细胞。
C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心
Western Blot 介 绍
蛋白质印迹的创造者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯 塔克〔George Stark〕。在尼尔·伯奈特〔Neal Burnette〕于 1981年所著的?分析生物化学?〔Analytical Biochemistry〕中首 次被称为Western Blot。
Western blot胶的制备——凝胶标志图解
Western blot胶的制备——凝胶标志图解
初次涉及该实验，往往不知道胶什么时候就凝好了，有什么样的标志？现将该过程，图解如下：
分离胶凝胶前
分离胶凝胶后标志：有明显的“界面”，该过程约20-30min。
分离胶凝胶后，竖立放置胶架，倒出酒精，并用滤纸吸干。
加入浓缩胶，并插入梳子
下图为完好的梳子和一侧小齿断掉的梳子
浓缩胶凝胶前凝胶后
浓缩胶凝胶标志：胶体回缩与梳子明显分离，该过程约40-60min。
以下是梳子两侧小齿完好与否，浓缩胶凝胶后的差别。
浓缩胶凝胶前 凝胶后
浓缩胶凝胶前 凝胶后
可以看到一侧没有小齿的梳子，会导致浓缩胶最外侧的胶体过分回缩，导致泳道无法使用。
因此，制胶时的操作过程中，要有意识地保护梳子两侧的小齿不被损坏。
western blot原理及操作方法ppt课件
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
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Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺0.1 ml；H2021.0 μl。
二、蛋白样品制备1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS （0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。
（提前开离心机预冷）（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：（1）将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
三、蛋白含量的测定1. 制作标准曲线（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
（4）混匀后，室温放置2 min。
在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2. 检测样品蛋白含量（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。
室温放置30 min后即可用于测蛋白。
（2）取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl 溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。
可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。
测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
四、SDS－PAGE电泳1. 清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4）按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
）（6）测完蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5 ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。
）上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3. 电泳电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
五、转膜1. 转一张膜需准备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。
（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
（撬时一定要小心，玻板很易裂。
）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
）5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。
6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用。
六、免疫反应1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。