蛋白质的研究方法与原理.

高效液相层析法（High Performance Liquid
Chromatography ，HPLC） 又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以 液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性 的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相 泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后， 进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
离子交换层析法
*原理：阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）
填充在层析柱内，由于阴（阳）离子交换树 脂颗粒上带正（负）电荷，能吸引溶液中的 阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态 1. 避免一切过激因素--如过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。 2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。
第二节 蛋白质的分离与纯化技术
一、蛋白质沉淀与结晶
（一）盐析法
概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和
各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时， 这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。
层析技术的种类 按两相状态来分
气相层析 液相层析 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 薄层层析 纸层析
亲和层析法
原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一
分子可逆结合的特性。 如，酶的活性部位能和底物\抑制剂\辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除. [酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间]。 这些被作用的对象物质称之为配基（ligand) 。
K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+ 常用的中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。
硫酸铵（常用盐析剂） 优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。 缺点：缓冲能力较差 PH难控制
（2）PH和温度
S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度
除取决于Pr的种类，还受PH及温度影响: • • PH=PI时，S。的数值极小 S。随温度增加而减低。
若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGE中进 行电泳，由于分子筛效应， u 仅取决于分子的大小。 因此 SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其 分开。 这时，若以分子量的对数（logM）对相对于染料前沿 的迁移率（Rf）作图，呈现线性关系。
（2）有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也
促使Pr变得不稳定而聚集析出.
常用的有机溶剂：乙醇和丙酮
（三）选择性沉淀法
选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标 蛋白质的分离方法。例如，将提取液加热至一定温度 并维持一段时间，是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等。 应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去的及欲提纯 的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。
第十章 蛋白质的研究方法与原理
第一节
概 述
直接从生物组织中提纯蛋白——
蛋白质的分离纯化包括以下过程：
1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂法） 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；
4.蛋白质结晶；
5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。
按层析机理来分
按操作方式来分
（一）凝胶过滤层析
又称分子筛或凝胶过滤（gel filtration） 原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分 子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔 径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流 出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕 道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分 子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而 达到相互分离的目的。
四、电泳技术分离蛋白质
电泳（electrophoresis）是指带电粒子在电场 中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS– (十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q u = （迁移率）6πrη u 与 Q、 r有关
盐析过程中，若增高温度，有助于Pr的析出。
（3）蛋白质浓度 [Pr]较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。 [Pr]较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。
（二）有机溶剂沉淀法
分辨力比盐析方法高，提纯效果好
1.基本原理பைடு நூலகம்
（1）在PI附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，增强了 中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。
离心技术是利用物体 告诉旋转时产生强大的离 心力，使置于旋转体中的 悬浮颗粒发生沉降或漂浮， 从而使某些颗粒达到浓缩 或与其它颗粒分离之目的。
三、层析技术分离纯化蛋白质
层析技术（chromatography）又称色谱技术，是利 用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。 最基本的特征： 固定相 流动相
（四）蛋白质结晶
蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有 规则排列状态的固体，常用语分析研究其结构。 蛋白质结晶是一个有序化过程，当蛋白质溶液达到过 饱和状态，能够形成一定大小的晶核，溶液中的分子 失去自由运动的能量，不断地结合到形成的晶核上， 长成适合于X线衍射分析的晶体。
二、离心技术分离蛋白质
电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析
所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐
可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。 优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低
（1）盐的种类 对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析能力 也愈强:
PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞ AC－＞CL－＞NO3-＞Br -＞I-＞CNS-