矮牵牛组织培养

矮牵牛愈伤组织的生根诱导一、实验原理本实验为矮牵牛愈伤组织的生根诱导培养，在总结前人研究的基础上选择在培养基中加入IBA和NAA两种生长因子。

研究了IBA和NAA两种生长因子对及其不同浓度组合对生根的影响。

选取生长良好的愈伤组织接种到灭菌的1/2MS和不同浓度组合的生长因子的培养基中，在25±1℃，光照2000lx环境中培养，结果表明1/2MS+0.4mg/LIBA+0.1mg/LNAA诱导效果良好，生根率为100%。

愈伤组织的平均生根数最大，根最长，易于移植。

前言组织培养兴起于上个世纪初，是一种高效快捷的植物无性繁殖技术。

并于上个世纪的70年代后期，广泛用于针叶树种的快速繁殖，并取得了较大的进展[1]。

矮牵牛（petunia hybrida vilm）又名“碧冬茄”、“灵芝牡丹”，为茄科矮牵牛属多年生生草本，通常作一年生栽培。

原产南美，为矮牵牛（pviolacea）与腋花矮牵牛（p.axillaries）的杂种，喜光照,不耐阴，喜温畏寒[2]。

矮牵牛花大，花色丰富，花期长，6～10月整个夏、秋季节花开不断，栽培管理省工，园林绿化上需求量大。

但由于重瓣或大花品种常不易结实或实生苗不易保存母本的优良性状，常采用扦插繁殖，但扦插繁殖速度太慢，满足不了生产发展的需要，而组织培养可在短时期内获得大量的优良种苗[3]。

由此看来，生根培养基的生根培养技术，可有望解决组培苗生产中瓶苗移栽成活率低和生产成本高问题，从而建立起快速、高效、优质的种苗产业化生产体系[4]。

这既是矮牵牛研究者的迫切需要，也是市场的需要。

在培养基中有浓度较高的营养元素，特别是糖能满足的情况下，试管苗产生依赖性而不易生根，减少培养基中营养成分和糖的含量可以刺激生根，因此经常采用1／2MS作为生根的基本培养基[5]。

生根培养基在以1/2MS为基本培养基基础上添加IBA和NAA是目前最流行的根生根培养基。

大部分研究者认为,NAA和IBA对生根有促进作用,但也有这两种激素对生根有抑止作用的研究结果。

IBA和NAA使用浓度不一,0.03～2.0mg/L都有人使用,对不同的基因型所需浓度不一定相同，以及对材料的前处理不一样结果也有所不同[6]。

该试验以矮牵牛愈伤组织为材料，探讨不同种激素组合对诱导愈伤组织生根的影响。

筛选出适合矮牵牛愈伤组织诱导及植株再生的最佳配方，为其快繁提供参考。

二、实验材料、药品和仪器1、材料矮牵牛无菌苗2、药品大量元素I (扩大10倍)：KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4大量元素II (扩大40倍)：CaCL2微量元素I(扩大100倍)：MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI微量元素II(扩大200倍)：NaMoO4·2H2O、CuSO4·2H2O、CoCL2·6H2O铁元素(扩大100倍)：Na2-EDTA、FeSO4·7H2O有机元素(扩大100倍)：甘氨酸、盐酸硫胺素VB1、盐酸吡哆醇VB6、烟酸VB3、肌醇（单独配置）生长因子：0.2mg/ml NAA、0.5mg/ml IBA琼脂蔗糖等均为分析纯 1mol/L NaOH溶液（注：以上MS培养基母液以及生长因子由实验室配置好）3、仪器电子天平、冰箱、PH试纸、烧杯、玻璃棒、量筒、试剂瓶、三角瓶、洗耳球、微量加样器、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、培养瓶、超净工作台、各种接种器具。

三、实验步骤：1．生根培养基的配制称取琼脂1.5g，放置于250mL烧杯中，加入120mL蒸馏水，放入微波炉中加热至溶解。

取用另一只烧杯，按照表1所需求的量配制1/2MS培养基，并向其中分别添加0.2mg/ml IBA和0.5mg/ml NAA量如表2所示，然后再加入蔗糖6g。

将稀释的母液与琼脂溶化液混合，定容至需要的容积至200mL，待温度降至50--60℃，调节pH至5.8，以30—40ml/瓶分装在培养瓶中，用封口膜封口，并在该培养瓶上标注组号。

元素大量I 大量II 微量I 微量II 铁元素有机元素母液（ml）10 2.5 1 0.5 1 1表1 1/2MS用的元素量瓶号 1 2 3 4 5 6MS的量1/2MS 1/2MS 1/2MS 1/2MS 1/2MS 1/2MS NAA体积0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 (ml)0.2 0.16 0.12 0.08 0.04 0IBA体积(ml)表2 生长因子的用量2．培养基和接种工具灭菌首先将内层锅取出，在向外层锅中加入适量水，使水面与三脚架向平，加水量不能过少，以防止灭菌锅底烧干而引起炸裂事故。

放回内层锅，并装入培养基和接种工具，不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通过而影响灭菌效果。

三角瓶与试管口不要与筒壁接触，防止冷凝水淋湿包口的纸而透入棉底。

加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

插上电源，同时打开放气阀，使水沸腾以排尽锅内的空气，待冷空气排尽后，关上放气阀，让锅内的压力升到所需压力0.1MPa。

（121.5℃），控制热源，维持压力至所需时间20min。

达到灭菌时间后，切断电源，让灭菌锅内的温度自然下降，当压力将至0时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

将取出的灭菌培养基在室温下放置一周，经检查没有杂菌生长即可使用。

3．外植体的接种、培养和观察记录3.1接种将培养瓶在超净工作台内，打开紫外灯并且关掉日光灯，进行灭菌15min。

然后酒精灯旁，小心从培养瓶中挑出矮牵牛无菌愈伤组织，切成大小均匀，约为0.5—1cm2的块状，接入诱导培养基，每瓶接四块，盖上封口膜后写上日期，处理号。

3.2培养在培养室中培养，培养条件：温度25±1℃，光照800-1200lx。

3.4观察记录四周后观察污染状况，根的长势、粗细、长度以及其他现象，生长块数和生根的总数。

统计组织生根情况，计算培养的生根率和污染率，如下：⑴记录不定根的发生情况，计算生根率生根率(%)=生根组织块数/接种总组织块数×100(2）记录生根的污染率污染率=污染的组织块数/接种的总块数×100%四实验结果与分析1. 结果记录生长物质的浓度总根数（根）生长块数（块）总块数（块）（mg/L）1组0.5 IBA + 0.0 NAA 142 14 202组0.4 IBA + 0.1 NAA 248 19 203组0.3 IBA + 0.2 NAA 120 15 164组0.2 IBA + 0.3 NAA 120 12 165组0.1 IBA + 0.4 NAA 91 14 20对照组0.0 IBA + 0.5 NAA 76 8 8表3 生根统计表2. 数据处理根数/块（根）成活率污染率（%）性状表现(%)1组10 70 0 根较多、细、长，有较多须根2组13 95 0 根多、粗、较长，状况好，须根3组8 93.75 0 生根较少，细，有须根4组10 75 0 生根较多、较粗、短，有须根5组 6 70 0 少，基部有白点出现，少量须根对照组9 100 0 根较多，较好，少量须根表4 根的成活率、污染率、生长状况3. 结果分析在培养基中有浓度较高的营养元素，特别是糖能满足的情况下，试管苗产生依赖性而不易生根，减少培养基中营养成分和糖的含量可以刺激生根，因此经常采用1／2MS作为生根的基本培养基。

矮牵牛生根较为容易，一般形成根原基2周后即能长成明显的根，开始根米白色的，不易进行计数，三周以后根逐渐老化，颜色逐渐变成深，较易观察计数。

由表4可得，对照组的成活率为100%,其次为处理2的成活率为95%，成活率最低的是处理1和处理5均为70%。

造成这样的结果的外界因素可能有如下几点：一是接种块茎的大小不同和接入培养基的深度不同，以至于部分块茎不能正常进行生命活动；二是在配制培养基时pH值的调节使不同组有所差异。

本实验操作比较好，在培养过程中未出现被污染现象，即污染率为0%。

生根数最好的是处理2，达到每块平均13个根；并且生根多，主根粗壮，较长，有须根，状况好。

其次是处理1和4都是每块10个根，处理1生根较多、细、长，有较多须根；而处理4生根较多、较粗、短，有须根。

接着是对照组有9个根每块；根较多，生长较好，存在少量须根。

处理3较对照组，根数较少，细，有须根。

最差的是处理5，每块只有6个根；根少，基部有白点出现，有少量须根。

综上所述，在生根诱导的6个处理中，IBA、NAA、NAA与IBA组合都能诱导出不定根，NAA诱导率最高达100%，但其根数较少。

生根培养基处理2培养的块茎，不仅其成活率高达95%，而且生根数为实验中最高的处理；其中的瓶苗具有根生长较快、较为粗壮，叶绿、坚挺等特点。

相比之下，其余4种生根培养基以及对照组不如养基2适合生根培养(表2)。

因此认为试管苗比较适宜适生根培养基为1/2 MS+0.4mg/L IBA+0.1mg/L NAA+6.0g蔗糖+1.5g琼脂。

五、实验结论生根诱导培养的发生发育是不同生物化学、生理和组织反应共同作用的结果受许多物理和化学因素控制，如光、酶、植物生长调节剂、营养、多胺、碳水化合物和酚类化合物。

这些因素直接或间接地影响了不定根的生根率和根系质量，而根系质量又直接影响再生苗移植后的表现IBA和NAA对大多数植物不定根的形成有积极的促进作用，对矮牵牛愈伤组织生根培养的作用较为明显。

通过实验结果显示，试管苗比较适宜适生根培养基为1/2 MS+0.4mg/L IBA+0.1mg/L NAA+6.0g蔗糖+1.5g琼脂。

参考文献：[1] 共亚芹,赵东升,陈秀莉．花卉栽培隹产技术[M]．北京：化学工业出版社.2006[2] 王虹, 张金凤, 董建生. 针叶树组织培养繁殖技术研究进展[J]. 河北林业科技. 2004, (2): 14-18[3]付彦秋,于树军,张乃勇.矮牵牛组培快繁技术研究[4] 陈银龙,赖小芳,王伯诚,刘守坎.植物组织培养中液体生根培养基的研究与应用植物生理学通讯第42卷第3期，2006.6[5] 庞海峰.矮牵牛花药培养再生体系的建立[6]崔广荣,梁继田,崔海.重瓣矮牵牛叶片的组织培养[7] Legesse Negash. Vegetative propagation of the threatened African wild olive [Olea europaea L. subsp. cuspidate(Wall. ex DC) Ciffieri] [J]. New Forests, 2003, 26: 137-146[8] Geert-Jan De Klerk, Jolanda Ter Brugge. Effectiveness of indoleacetic acid, indolebutyric acid and naphthaleneacetic acid during adventitious root formation in vitro in malus‘Jork 9’ [J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1997, 49: 39-44[9] Mrr-sook kim, Ned B Klopfenstein and Bert M. In vitro and ex vitro rooting of micropropagated shoots using three green ash (Fraxinus pennsylvanica) clones[J]. New Forests, 1998, 16: 43-57[10] El Euch C, C Jay-Allemand, M Pastuglia, et al. Expression of antisense chalcone synthase RNA in transgenic hybrid walnut microcuttings. Effect on flavonoid content and rooting ability[J]. Plant Molecular Biology, 1998, 38: 467-479。