矮牵牛组织培养

矮牵牛愈伤组织的生根诱导

一、实验原理

本实验为矮牵牛愈伤组织的生根诱导培养，在总结前人研究的基础上选择在培养基中加入IBA和NAA两种生长因子。研究了IBA和NAA两种生长因子对及其不同浓度组合对生根的影响。选取生长良好的愈伤组织接种到灭菌的1/2MS和不同浓度组合的生长因子的培养基中，在25±1℃，光照2000lx环境中培养，结果表明1/2MS+0.4mg/LIBA+0.1mg/LNAA诱导效果良好，生根率为100%。愈伤组织的平均生根数最大，根最长，易于移植。

前言

组织培养兴起于上个世纪初，是一种高效快捷的植物无性繁殖技术。并于上个世纪的70年代后期，广泛用于针叶树种的快速繁殖，并取得了较大的进展[1]。矮牵牛（petunia hybrida vilm）又名“碧冬茄”、“灵芝牡丹”，为茄科矮牵牛属多年生生草本，通常作一年生栽培。原产南美，为矮牵牛（pviolacea）与腋花矮牵牛（p.axillaries）的杂种，喜光照,不耐阴，喜温畏寒[2]。矮牵牛花大，花色丰富，花期长，6～10月整个夏、秋季节花开不断，栽培管理省工，园林绿化上需求量大。但由于重瓣或大花品种常不易结实或实生苗不易保存母本的优良性状，常采用扦插繁殖，但扦插繁殖速度太慢，满足不了生产发展的需要，而组织培养可在短时期内获得大量的优良种苗[3]。由此看来，生根培养基的生根培养技术，可有望解决组培苗生产中瓶苗移栽成活率低和生产成本高问题，从而建立起快速、高效、优质的种苗产业化生产体系[4]。这既是矮牵牛研究者的迫切需要，也是市场的需要。

在培养基中有浓度较高的营养元素，特别是糖能满足的情况下，试管苗产生依赖性而不易生根，减少培养基中营养成分和糖的含量可以刺激生根，因此经常采用1／2MS作为生根的基本培养基[5]。生根培养基在以1/2MS为基本培养基基础上添加IBA和NAA是目前最流行的根生根培养基。大部分研究者认为,NAA和IBA对生根有促进作用,但也有这两种激素对生根有抑止作用的研究结果。IBA和

NAA使用浓度不一,0.03～2.0mg/L都有人使用,对不同的基因型所需浓度不一定相同，以及对材料的前处理不一样结果也有所不同[6]。该试验以矮牵牛愈伤组织为材料，探讨不同种激素组合对诱导愈伤组织生根的影响。筛选出适合矮牵牛愈伤组织诱导及植株再生的最佳配方，为其快繁提供参考。

二、实验材料、药品和仪器

1、材料

矮牵牛无菌苗

2、药品

大量元素I (扩大10倍)：KNO

3、NH

4

NO

3

、MgSO

4

·7H

2

O、KH

2

PO

4

大量元素II (扩大40倍)：CaCL

2

微量元素I(扩大100倍)：MnSO

4·H

2

O、ZnSO

4

·7H

2

O、H

3

BO

3

、KI

微量元素II(扩大200倍)：NaMoO

4·2H

2

O、CuSO

4

·2H

2

O、CoCL

2

·6H

2

O

铁元素(扩大100倍)：Na

2-EDTA、FeSO

4

·7H

2

O

有机元素(扩大100倍)：甘氨酸、盐酸硫胺素VB

1、盐酸吡哆醇VB

6

、烟酸VB

3

、

肌醇（单独配置）

生长因子：0.2mg/ml NAA、0.5mg/ml IBA

琼脂蔗糖等均为分析纯 1mol/L NaOH溶液

（注：以上MS培养基母液以及生长因子由实验室配置好）

3、仪器

电子天平、冰箱、PH试纸、烧杯、玻璃棒、量筒、试剂瓶、三角瓶、洗耳球、微量加样器、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、培养瓶、超净工作台、各种接种器具。

三、实验步骤：

1．生根培养基的配制

称取琼脂1.5g，放置于250mL烧杯中，加入120mL蒸馏水，放入微波炉中加热至溶解。取用另一只烧杯，按照表1所需求的量配制1/2MS培养基，并向其中分别添加0.2mg/ml IBA和0.5mg/ml NAA量如表2所示，然后再加入蔗糖6g。将稀释的母液与琼脂溶化液混合，定容至需要的容积至200mL，待温度降至

50--60℃，调节pH至5.8，以30—40ml/瓶分装在培养瓶中，用封口膜封口，并在该培养瓶上标注组号。

元素大量I 大量II 微量I 微量II 铁元素有机元素母液（ml）10 2.5 1 0.5 1 1

表1 1/2MS用的元素量

瓶号 1 2 3 4 5 6

MS的量1/2MS 1/2MS 1/2MS 1/2MS 1/2MS 1/2MS NAA体积

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 (ml)

0.2 0.16 0.12 0.08 0.04 0

IBA体积

(ml)

表2 生长因子的用量

2．培养基和接种工具灭菌

首先将内层锅取出，在向外层锅中加入适量水，使水面与三脚架向平，加水量不能过少，以防止灭菌锅底烧干而引起炸裂事故。放回内层锅，并装入培养基和接种工具，不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通过而影响灭菌效果。三角瓶与试管口不要与筒壁接触，防止冷凝水淋湿包口的纸而透入棉底。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，

使螺栓松紧一致，勿使漏气。插上电源，同时打开放气阀，使水沸腾以排尽锅内

的空气，待冷空气排尽后，关上放气阀，让锅内的压力升到所需压力0.1MPa。（121.5℃），控制热源，维持压力至所需时间20min。达到灭菌时间后，切断电源，让灭菌锅内的温度自然下降，当压力将至0时，打开放气阀，旋松螺栓，打

开盖子，取出灭菌物品。将取出的灭菌培养基在室温下放置一周，经检查没有杂

菌生长即可使用。

3．外植体的接种、培养和观察记录

3.1接种

将培养瓶在超净工作台内，打开紫外灯并且关掉日光灯，进行灭菌15min。

然后酒精灯旁，小心从培养瓶中挑出矮牵牛无菌愈伤组织，切成大小均匀，约为

0.5—1cm2的块状，接入诱导培养基，每瓶接四块，盖上封口膜后写上日期，处

理号。

3.2培养

在培养室中培养，培养条件：温度25±1℃，光照800-1200lx。

3.4观察记录

四周后观察污染状况，根的长势、粗细、长度以及其他现象，生长块数和生

根的总数。统计组织生根情况，计算培养的生根率和污染率，如下：

⑴记录不定根的发生情况，计算生根率

生根率(%)=生根组织块数/接种总组织块数×100

(2）记录生根的污染率

污染率=污染的组织块数/接种的总块数×100%

四实验结果与分析

1. 结果记录

生长物质的浓度总根数（根）生长块数（块）总块数（块）