第12章体外试验与新生物技术在毒理学中的应用
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 分子毒理学（molucular toxicology）：在毒理学的发 展过程中，受到分子生物学理论和技术的促进二发展起 来的，它是从分子水平上研究外源性化合物与生物机体 相互作用的一门学科
4
Food Toxicology
• 细胞毒理学的研究内容 • 1. 研究外源性有害因子对浸提的细胞毒性作用及特异
细胞毒作用 • 2. 研究细胞毒物代谢 • 3. 研究毒物的细胞度效应作用机制 • 4. 研究外源性有害因子的致癌作用 • 5. 进行药物筛选
5
• 分子毒理学研究现状 • 1. 毒物代谢酶遗传多态性研究 • 2. 毒物对基因，蛋白表达影响的研究 • 3. 毒物与细胞凋亡的研究 • 4. 化学致癌机制的研究 • 5. 分子生物标志物及其应用的研究
Food Toxicology
• （七）细胞培养在食品毒理学中应用
一般毒性： ✓ 主要为急性细胞毒性 器官特异性毒性： ✓ 利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及
心肌细胞等
毒作用机理：
✓
生物转化、毒性代谢产物的形成
✓
遗传毒性，如程序外DNA合成测定
✓
繁殖毒性
✓
联合毒性
✓
不同物种间的比较毒性
Learning Objectives
Food Toxicology
1．熟悉体外试验。概述、体外试验系统。
2．了解细胞毒理学。哺乳动物细胞制备和培养。概 述、基本技术、培养细胞的定量、污染鉴定、生 存指标、细胞特性鉴定、细胞培养在食品毒理学 中应用。
3．了解分子生物学技术在毒理学中的应用。
2
Learning Contents
• （三）mRNA定性与定量的测定方法 • 原理：很成两组引物，通过随机组合，使每个细胞中表
达的15000种mRNA均有扩增机会，并使所有mRNA通过电 泳带表现出来 在毒理学研究中的应用： 用于外源性因素作用机制的研究 疾病相关基因的研究 营养学方面的研究
19
Food Toxicology
• （五）基因芯片技术 • 基因芯片（Genechip），又称DNA芯片，DNA微阵列
（DNA microarray），包括寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）及cDNA microarray。是指利用大规模集 成电路的手段控制固相合成成千上万个靶基因或寡核苷 酸探针，并把它们有序地高密度地排列在玻璃或硅片等 不同载体上 • 在毒理学研究中的应用： 毒物的筛选及毒作用机制的研究 确定单独的或混合的毒性物质的遗传毒性并测定低剂量 下的毒性影响
22
• 在毒理学中的应用： 淋巴细胞分型及鉴定 T细胞活化性息传递研究 DNA含量与细胞周期分析 细胞凋亡检测技术
23
Food Toxicology
胞器等 • 3. 试验间的误差较少 • 4. 可同时和／或反复多次取样 • 5. 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培
养等 • 6. 较为快速和经济 • 7. 需要较小量的受试化合物 • 8. 产生较小量的有毒废物 • 9. 可以利用人体细胞 9• 10. 减少整体动物的使用
• 哺乳细胞培养的基本技术： （一）细胞分离和原代培养
21
Food Toxicology
• （六）流式细胞术 • 流式细胞仪（flow cytometer，FCM）：是一项集激光
技术、电子物理技术、光电侧技术以及细胞荧光化学技 术、单克隆技术为一体的新型高科技仪器 • 流式细胞术（flow cytometry）：就是对于处在快速直 线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定 量分析和分选的技术 • 流式细胞仪工作原理：把根据目的细胞特有的表面标记 后的悬液中单细胞一次通过测量去，当每个细胞通过测 量区时产生电信号，这些信号可以代表荧光，散射光， 光吸收或细胞的光阻抗，遇事细胞的一系列重要的物理 特性和化学特性就被快速的，大量地测定
Food Toxicology
1．体外试验。概述、体外试验系统。
2．细胞毒理学。哺乳动物细胞制备和培 养。概述、基本技术、培养细胞的定量、 污染鉴定、生存指标、细胞特性鉴定、 细胞培养在食品毒理学中应用。
3．分子生物学技术在毒理学中的应用。 PCR技术、细胞程序性死亡及其检测方 法、毒理学中的mRNA定性与定量的测 定方法、转基因动物、基因芯片技术、 流失细胞术。
Applications of in vitro tests and novel biotechnology in toxicology
Food Toxicology Instructor: GU BING, Ph.D. Jiangxi Science and Technology Normal of University
17
Food Toxicology
• （二）细胞程序性死亡及其检测方法 • 细胞程序性死亡又称细胞凋亡，由基因编程控制的细胞
主动参与的自杀过程没事一种生理性调节机制，与细胞 坏死的死亡机制是完全不同 • 检测方法： • 亚G1峰检测法 • Ho/PI染色法 • 磷脂酰丝氨酸外翻分析
18
Food Toxicology
3
第一节 概念
Food Toxicology
• 毒理学（toxicology）是研究外源性物质对生命有机体 损伤作用规律及其机制的一门学科
• 细胞毒理学（cytotoxicology）：研究外源性有害因子 包括，物理（电离辐射）、化学和生物（病毒）因子对 生命细胞损害作用规律，探讨毒作用机制，并对其作出 危险评估的一门方法学
细胞悬液：离心收集
组织块 1. 机械分散 2. 剪切分离 3. 消化分离 胰蛋白酶法 胶原酶法
10
Food Toxicology
Food Toxicology
（二）培养细胞的传代 • 原代培养的首次传代（数量、纯度） • 细胞传代方法 贴壁细胞的传代 悬浮细胞的传代 • 细胞系的维持
11
Food Toxicology
7
Food Toxicology
• 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物 和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内 某一分子靶部位作用的结果能控制环境因素
8
Food Toxicology
• 体外试验的特点 : • 1. 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系
统的影响 • 2. 每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细
Food Toxicology
6
Food Toxicology
第二节 哺乳动物细胞制备和培养
• 细胞培养 (cell culture) 的含义： 简单地说即是把 来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内 的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以 观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养技 术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等 领域已得到广泛的应用
• （四）转基因动物 • 转基因动物是指一类动物的基因组中整合有外源目的基
因。通过转基因技术，将改建后的目的基因或基因片段 导入实验动物的受精卵，使其与受精卵DNA发生螯合。 然后将次受精卵转移到磁性受体的输卵管或子宫中，使 其顺利完成胚胎发育 • 在毒理学研究的应用：主要为制备转基因动物模型
20
Food Toxicology
13
• （五）生存指标
• 1.台盼蓝排斥试验
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 2. 酶漏出的检测
• 其它方法,如，铬的释放
•
贴壁效率
•
ATP含量
14
Food Toxicology
• （六）细胞特性鉴定 ： 形态学检查 生长特性的检查 染色体的数目和结构 DNA、RNA和蛋白质的含量测定
Food Toxicology
15
1✓6
光敏毒性
Food Toxicology
第三节 分子生物学技术在毒理学中的应用
• （一）PCR-SSCP技术 • PCR（polymerase chain reaction）技术：称聚合酶链
反应技术，又称无细胞克隆技术（“freebacterria” cloning technique），是一种对特定的DNA片段在体外 进行快速扩增的新方法 • PCR-SSCP：即聚合酶链反应-单链构象多态性分析， 原理是单链DNA分子在变性的聚丙烯酰胺电泳（PAGE） 中电泳迁移率随其构象的变化而变化，而单链DNA分 子的构象变化可由DNA多态性引起，因而可根据电泳 迁移率判断DNA的多态性或基因有无突变，加以比较 并区别开来
（三）观察 • 培养液 • 细胞生长概况 • 细胞形态变化 • 微生物污染 • 细胞活力检测 （0.4% trypan blue 拒染）
12
Food Toxicology
• （四）鉴定方法：真菌或细菌的污染可用肉眼或低倍光 学显微镜观察，支原体仅能用特别的荧光染料如 Hoechst 33258染色后在光学显微镜下，或用扫描电子 显微镜观察。由于用肉眼无法发现支原体的污染，在细 胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。最简便 和最可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微 镜下观察。
4
Food Toxicology
• 细胞毒理学的研究内容 • 1. 研究外源性有害因子对浸提的细胞毒性作用及特异
细胞毒作用 • 2. 研究细胞毒物代谢 • 3. 研究毒物的细胞度效应作用机制 • 4. 研究外源性有害因子的致癌作用 • 5. 进行药物筛选
5
• 分子毒理学研究现状 • 1. 毒物代谢酶遗传多态性研究 • 2. 毒物对基因，蛋白表达影响的研究 • 3. 毒物与细胞凋亡的研究 • 4. 化学致癌机制的研究 • 5. 分子生物标志物及其应用的研究
Food Toxicology
• （七）细胞培养在食品毒理学中应用
一般毒性： ✓ 主要为急性细胞毒性 器官特异性毒性： ✓ 利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及
心肌细胞等
毒作用机理：
✓
生物转化、毒性代谢产物的形成
✓
遗传毒性，如程序外DNA合成测定
✓
繁殖毒性
✓
联合毒性
✓
不同物种间的比较毒性
Learning Objectives
Food Toxicology
1．熟悉体外试验。概述、体外试验系统。
2．了解细胞毒理学。哺乳动物细胞制备和培养。概 述、基本技术、培养细胞的定量、污染鉴定、生 存指标、细胞特性鉴定、细胞培养在食品毒理学 中应用。
3．了解分子生物学技术在毒理学中的应用。
2
Learning Contents
• （三）mRNA定性与定量的测定方法 • 原理：很成两组引物，通过随机组合，使每个细胞中表
达的15000种mRNA均有扩增机会，并使所有mRNA通过电 泳带表现出来 在毒理学研究中的应用： 用于外源性因素作用机制的研究 疾病相关基因的研究 营养学方面的研究
19
Food Toxicology
• （五）基因芯片技术 • 基因芯片（Genechip），又称DNA芯片，DNA微阵列
（DNA microarray），包括寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）及cDNA microarray。是指利用大规模集 成电路的手段控制固相合成成千上万个靶基因或寡核苷 酸探针，并把它们有序地高密度地排列在玻璃或硅片等 不同载体上 • 在毒理学研究中的应用： 毒物的筛选及毒作用机制的研究 确定单独的或混合的毒性物质的遗传毒性并测定低剂量 下的毒性影响
22
• 在毒理学中的应用： 淋巴细胞分型及鉴定 T细胞活化性息传递研究 DNA含量与细胞周期分析 细胞凋亡检测技术
23
Food Toxicology
胞器等 • 3. 试验间的误差较少 • 4. 可同时和／或反复多次取样 • 5. 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培
养等 • 6. 较为快速和经济 • 7. 需要较小量的受试化合物 • 8. 产生较小量的有毒废物 • 9. 可以利用人体细胞 9• 10. 减少整体动物的使用
• 哺乳细胞培养的基本技术： （一）细胞分离和原代培养
21
Food Toxicology
• （六）流式细胞术 • 流式细胞仪（flow cytometer，FCM）：是一项集激光
技术、电子物理技术、光电侧技术以及细胞荧光化学技 术、单克隆技术为一体的新型高科技仪器 • 流式细胞术（flow cytometry）：就是对于处在快速直 线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定 量分析和分选的技术 • 流式细胞仪工作原理：把根据目的细胞特有的表面标记 后的悬液中单细胞一次通过测量去，当每个细胞通过测 量区时产生电信号，这些信号可以代表荧光，散射光， 光吸收或细胞的光阻抗，遇事细胞的一系列重要的物理 特性和化学特性就被快速的，大量地测定
Food Toxicology
1．体外试验。概述、体外试验系统。
2．细胞毒理学。哺乳动物细胞制备和培 养。概述、基本技术、培养细胞的定量、 污染鉴定、生存指标、细胞特性鉴定、 细胞培养在食品毒理学中应用。
3．分子生物学技术在毒理学中的应用。 PCR技术、细胞程序性死亡及其检测方 法、毒理学中的mRNA定性与定量的测 定方法、转基因动物、基因芯片技术、 流失细胞术。
Applications of in vitro tests and novel biotechnology in toxicology
Food Toxicology Instructor: GU BING, Ph.D. Jiangxi Science and Technology Normal of University
17
Food Toxicology
• （二）细胞程序性死亡及其检测方法 • 细胞程序性死亡又称细胞凋亡，由基因编程控制的细胞
主动参与的自杀过程没事一种生理性调节机制，与细胞 坏死的死亡机制是完全不同 • 检测方法： • 亚G1峰检测法 • Ho/PI染色法 • 磷脂酰丝氨酸外翻分析
18
Food Toxicology
3
第一节 概念
Food Toxicology
• 毒理学（toxicology）是研究外源性物质对生命有机体 损伤作用规律及其机制的一门学科
• 细胞毒理学（cytotoxicology）：研究外源性有害因子 包括，物理（电离辐射）、化学和生物（病毒）因子对 生命细胞损害作用规律，探讨毒作用机制，并对其作出 危险评估的一门方法学
细胞悬液：离心收集
组织块 1. 机械分散 2. 剪切分离 3. 消化分离 胰蛋白酶法 胶原酶法
10
Food Toxicology
Food Toxicology
（二）培养细胞的传代 • 原代培养的首次传代（数量、纯度） • 细胞传代方法 贴壁细胞的传代 悬浮细胞的传代 • 细胞系的维持
11
Food Toxicology
7
Food Toxicology
• 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物 和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内 某一分子靶部位作用的结果能控制环境因素
8
Food Toxicology
• 体外试验的特点 : • 1. 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系
统的影响 • 2. 每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细
Food Toxicology
6
Food Toxicology
第二节 哺乳动物细胞制备和培养
• 细胞培养 (cell culture) 的含义： 简单地说即是把 来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内 的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以 观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养技 术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等 领域已得到广泛的应用
• （四）转基因动物 • 转基因动物是指一类动物的基因组中整合有外源目的基
因。通过转基因技术，将改建后的目的基因或基因片段 导入实验动物的受精卵，使其与受精卵DNA发生螯合。 然后将次受精卵转移到磁性受体的输卵管或子宫中，使 其顺利完成胚胎发育 • 在毒理学研究的应用：主要为制备转基因动物模型
20
Food Toxicology
13
• （五）生存指标
• 1.台盼蓝排斥试验
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 2. 酶漏出的检测
• 其它方法,如，铬的释放
•
贴壁效率
•
ATP含量
14
Food Toxicology
• （六）细胞特性鉴定 ： 形态学检查 生长特性的检查 染色体的数目和结构 DNA、RNA和蛋白质的含量测定
Food Toxicology
15
1✓6
光敏毒性
Food Toxicology
第三节 分子生物学技术在毒理学中的应用
• （一）PCR-SSCP技术 • PCR（polymerase chain reaction）技术：称聚合酶链
反应技术，又称无细胞克隆技术（“freebacterria” cloning technique），是一种对特定的DNA片段在体外 进行快速扩增的新方法 • PCR-SSCP：即聚合酶链反应-单链构象多态性分析， 原理是单链DNA分子在变性的聚丙烯酰胺电泳（PAGE） 中电泳迁移率随其构象的变化而变化，而单链DNA分 子的构象变化可由DNA多态性引起，因而可根据电泳 迁移率判断DNA的多态性或基因有无突变，加以比较 并区别开来
（三）观察 • 培养液 • 细胞生长概况 • 细胞形态变化 • 微生物污染 • 细胞活力检测 （0.4% trypan blue 拒染）
12
Food Toxicology
• （四）鉴定方法：真菌或细菌的污染可用肉眼或低倍光 学显微镜观察，支原体仅能用特别的荧光染料如 Hoechst 33258染色后在光学显微镜下，或用扫描电子 显微镜观察。由于用肉眼无法发现支原体的污染，在细 胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。最简便 和最可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微 镜下观察。