快速诊断产品研发指南 GE

Michael Walther博士 生命科学技术市场经理
Andrea Friße博士 诊断产品经理
目录
Whatman® Part of GE Healthcare
免疫层析检测
1
侧向流免疫层析
1
反应膜
1
膜的选择
2
样品垫，样品制备和吸收介质
3
样品垫
4
样品制备
5
吸收垫
6
样品垫和吸收垫的选择
7
结合物释放垫
膜物理学
侧向流免疫层析
在侧向流免疫层析中，一份样品在检测装置的毛细管作用的带动下流经由捕获分子固定后形成的捕 获线，并在流经捕获线时捕获分子与样品中的待测分子形成复合物。利用该原理可进行一些改变。 三明治检测法是检测大分子待测物（如孕激素hCG）的经典方法，而检测小分子待测物如毒品则需 要竞争性或抑制检测（图2）。一项免疫检测需要具备好几项功能，通过不同的组件来实现检测目的 （图1）。一个侧向流装置通常包括一个样品垫，一个结合物释放垫、一个反应膜和一个吸收垫。部 分应用还需特定的全血分离膜。以下章节就检测设计和材料选择方面进行详细阐述。
4
膜化学
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NC膜的生产原材料是呈纤维束状的硝酸纤维素。制造该膜的硝酸化程度通常为每个糖单体上包含 1.8-2.3个硝酸基团（主要由硝酸纤维素构成）。因此初略地计算每份硝酸纤维素膜其氮的含量仅为 12%。正因如此，加上NC物质的低密度特性（一张膜空气含量>70%），NC膜没被划分为易爆物。 用NO2替代其上的羟基可增加材料疏水性。硝化的程度不仅会改变最终膜的结合特性，对制造过程 也有影响。
8
结合物释放垫的选择
9
侧向流免疫检测其它组分——结合物检测、背衬和外壳
10
建立和优化侧向流检测
11
Biblioteka Baidu
结合物沉淀和释放的优化
12
膜流动性的优化
13
问题解答
14
渗滤法
15
反应膜
15
膜的选择
20
吸收层
2
吸收层的选择
23
渗滤法的其他组分
24
渗滤法的建立和优化
38
蛋白印迹和条带分析
40
反应膜
41
膜的选择
45
条带分析检测的建立和优化
1=大分子待检测物， 2=结合物， 3=捕获抗体（根据分析物情况而定）， 4=对照线抗体（如anti-IgG）， 5=小分子待测物， 6=竞争剂。
反应膜
最重要的侧向流免疫层析组件恐怕就属反应膜了。检测的热力学和动力学特性很大程度上取决于蛋 白吸附和毛细管作用。而这些都与膜片的物理和化学性质密切相关。正因为如此，我们需要花费一 些时间对膜化学和膜结构的基础知识进行一定的了解。
标称孔径 [μm]
3 5 8 12
比表面积率(SAR)
110 98 66 63
表1.Whatman硝酸纤维素膜的比表 面积率。数据采用氮吸附BET比表 面测定法获得。
毛细管流动
毛细管流速具有非常重要的地位，不仅因为其决定了检测时间的长短，还因为其对整个检测的动力 学和敏感度也有决定作用。由相同化学组分制成的膜，毛细管流速取决于三维结构、理论孔径、孔 分布以及孔密度。除了径迹蚀刻聚碳酸酯膜和Anopore®无机膜外，其他膜上的孔都不是非连续、边 界清楚的孔（图4）。对膜生产过程的简单描述可以帮助理解NC膜复杂的微孔结构是如何形成以及 生产过程是如何进行控制的。
GE Healthcare
快速诊断产品研发指南
为您建立卓越的快诊产品而提供解决方案 • 快速诊断 • 样品制备 • 样品收集
第二版：2009年11月 Andrea Friße博士. Michael Walther博士编写
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亲爱的读者： 以前诊断总是和疾病捆绑在一块。当他或她出现某个症状时往往选择找医生进行咨询。诊断学往往 被用来判断某个疾病以及决定对该疾病采取何种治疗措施。现在这种传统的基于症状的疾病处理模 式开始向疾病预测和预防的方向转变。通过实验室诊断能力的增加以及在位快速检测技术的出现使 这种转变成为可能。其中应用最为广泛的诊断分析技术是免疫检测。和一些依赖仪器设备的技术如 ELISA，免疫组化计数以及流式细胞仪等相比，快速诊断正受到越来越多的关注。尤以免疫层析检测 最为突出。 Whatman-现为通用电气医疗集团的一部分-已经连续数十载为客户提供高质量的层析和过滤产品。 在免疫层析技术初兴伊始，我们的滤膜包括纤维素和玻璃纤维材料即被应用在层析装置当中。如 今，从最高毛细管流速到最大蛋白吸附量，Whatman滤膜产品系列给予客户最大范围的选择。作为 唯一的供应商，Whatman提供全套用于生产免疫层析装置其他组件。 本指南可作为辅助材料，用于帮助初步涉猎快速诊断检测开发领域的客户。同时，本指南以产品应 用为焦点对整个Whatman诊断检测组件产品情况进行了概括。结合问题解答章节的描述，使得该书 对该领域已有经验的诊断试验开发和设计人员而言也颇具价值。
市场上基于滤膜的免疫层析检测产品数量正在快速持续上升。导致这一上升势头的主要原因在于滤 膜组件出色的性价比以及可以在现场护理和诊断方面的开放市场中能方便地进行使用。在免疫层析 发展初期，检测多用来提供定性的结果以及用于某些结果只是简单回答是和否的试验检测中。而现 在免疫层析检测还需经常提供给客户半定量或定量的结果，这些结果的完成常常需要将检测装置和 电子识别装置整合在一起。尽管这些检测装置设计上具有多样化，可选择不同的外壳类型，但实际 上大多数商业化检测装置还是基于两种简单款型中的一种进行设计。最常见的款型是侧向流设计。 这一设计在许多非处方产品如妊娠诊断试剂盒上都有应用，因此为大家所熟知。另一款型即渗滤或 垂直流设计，这些检测通常需要一步以上的处理操作并需要较高的操作技巧。通常这些检测都用在 一些专业领域如传染病诊断。
不同的生产商往往采用不同的方法进行测量，即使采用恒定的技术进行比较时，相同标称孔径的两 张膜差异仍非常明显（图3）。
3
测量孔径 [μm]
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图3：当采用恒定技术对相 同标称孔径的膜进行比较 时膜之间差异非常明显。 这次比较中所有被测量的 孔径都采用同样的仪器— 库尔特仪进行测定。数据A 到数据D为来自不同膜生产 商的产品。
标称孔径 [μm]
能吸附到设定表面积上的实际蛋白量与蛋白分子大小密切相关。不同的资料来源显示，IgG分子可认 为是一种直径约15nm，厚度约为3nm的透镜样的凹球形分子。由于吸附的方向是随机的，因此最大 表面单层IgG吸附量为0.4μg/cm2（Esser 1997）。对于球状蛋白而言，分子量大小和体积成正比， 其他蛋白的吸附量也基本类似。对于SAR在63到110之间，宽1mm，长1cm（0.1 cm2）的检测线而 言，其IgG蛋白吸附量在2.52μg到4.4μg之间。这一吸附量远远超过了实际检测中捕获抗体的总量。
图4：Whatman AE 100膜 的电镜扫描图。标称孔径 12μm。
对于膜的制造，需要将聚合物溶解在二元溶剂系统。其中一种溶剂可以溶解聚合物，而另一种溶剂 （非溶解剂）对NC的溶解能力非常局限。在控制环境湿度和温度的条件下，将原材料混合物（类似 涂漆）以薄薄一层均匀散布在连续滚动的钢带或其他连续缓慢移动的表面。此时易挥发的NC溶剂便 开始蒸发。最关键的孔形成过程正是发生在这个蒸发阶段。在这个过程中，溶解在溶剂中的聚合物 沉淀在较慢挥发的液体（非溶解剂）周边的固体基质上，形成了孔。从而最终形成了一个海绵状聚 合物网架结构。接下来将膜置于滚筒上进行干燥，干燥的温度应足够高，以保证残留的溶剂能够完 全挥发并进一步“硬化”NC聚合物。当较慢挥发的非溶解剂完全挥发干净以后便形成微孔膜。微孔 膜的空体积（孔密度）为70%-80%。这时，膜的水含量保持在5%-10%。这些水存在于聚合物基质 间，而不是在膜空隙中。
46
蛋白结合的优化
47
封闭
48
1
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试纸检测法
43
纤维素试纸的选择
44
样品制备介绍
45
样品收集介绍
56
附录
60
逐步解析如何建立侧向流检测
60
参考文献
60
订购信息
60
如何申请样品
60
调查表
60
2
免疫层析检测
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蛋白吸附能力
与分子吸附机制不同，膜的吸附能力取决于与蛋白发生吸附作用的聚合物表面积大小。通过查阅每 种材料的比表面积率（SAR）可对不同孔径的膜的表面积进行近似估计。SAR是膜表面孔隙的实际表 面积与膜面积的比值（表1）。它取决于膜的厚度，孔径和孔隙度。内在的表面积很显然与厚度呈 线性递增关系，而厚度的增加可以简单地从体积增加来进行判断。孔径和内在表面积的关系表现为 表面积与孔径的平方根呈反比。这就意味着10μm孔径的膜其表面积仅为0.1μm孔径膜的十分之一。 内在表面积与孔密度呈非线性增加关系。孔密度是指膜上未填充聚合材料的部分所占比例（如干燥 膜上空气填充空间）。孔密度也被描述为膜上的空腔。了解孔径和孔密度是完全不相关的参数非常 重要。一张膜如果孔的数目较少，即使有大孔径的孔也只有非常低的孔密度。孔径更多地被解读为 “标称孔径”，因为这个参数值会因为孔径检测方法的不同而发生改变。
图1 ：典型的侧向流免疫层析试纸条
1=样品垫，2=结合物释放垫，3=检测线， 4=反应膜，5=对照线，6=吸收垫，7=背衬
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图2：由于三明治型的侧向流检测需要 检测物至少提供两个抗原表位，因此通 常只用于大分子待测物的检测。阳性检 测会显示两条线，而阴性检测只出现一 条线（对照线）。竞争性检测用于不具 备有两个独立的抗体结合位点的小分子 待测物的检测。在这种检测中，用于捕 获待测物的抗体被固定化的竞争剂（待 检测物质的类似物）取代。当样品中存 在待检测分子，识别抗体的结合位点被 这些分子占据，这使得结合物与检测线 的结合不复存在（如待分析物质和竞争 剂争夺吸附结合物）。
膜的功能是通过在检测线和控制线（以抗体为典型）对特定目的分子的吸附特性将其固定，同时样 品和检测结合物被引导流向反应区域。要达到这样的目的，膜必需具有统一的蛋白高吸附能力同时 还需具备一定的孔隙度和润湿性以保证水性样品的毛细流动。许多聚合物多孔膜的特性能满足部分 乃至全部的要求。硝酸纤维素（NC）正是这样一种聚合物，因此适合大多数情况的检测应用。虽然 尼龙和PVDF也具有相似的蛋白吸附能力，然而它们都存在导致它们不能用于免疫层析检测的缺点。 这两类材料都会导致蛋白吸附相对困难且不可靠，并且PVDF需要甲醇进行预润湿才能用于水性样品 的检测。因此大多数免疫层析应用时还是采用NC作为选择材料。
2
蛋白吸附力
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如何持续敏感地将活性捕获分子吸附于检测和控制线上是生产一个灵敏可靠的免疫检测试剂的关 键。尽管自从NC膜被首次用于蛋白吸附膜开始，就已开展了大量的研究工作，然而其吸附的真实本 质仍不知晓。现在广泛认同的是硝酸酯强偶极和肽键偶极之间的疏水作用，氢键结合以及静电作用 起了决定作用。然而，究竟何种作用起决定因素仍存在分歧。目前存在两种合理的模型。第一种模 型提出蛋白最初通过静电作用吸附到膜表面，而后氢键结合和疏水作用的联合作用用于维系膜和蛋 白的长时间结合。虽然这一点很难证实，然而这一模型和已经公布的实验数据非常吻合，所以这种 模型被广泛认同（Wallis 等人，1979，Presswood 1981，Farrah等人，1981, Batteiger等人， 1982， Tijssen 1993）。另一模型则指出最初的蛋白吸附是通过疏水作用介导的，而静电力则维系了蛋白的 长时间吸附。这一点也和许多的发表数据相吻合。然而，静电隔离机制并不能完全解释为什么通过 干燥或使用乙醇固定操作（参考Harlow和Lane）时蛋白粘附仍可保持长时间的稳定。硝酸纤维素聚 合物不存在任何碱性和酸性基团。pH对膜吸附的影响主要通过改变蛋白特性来实现，而并非改变膜 的属性。不管这种作用力的联合对蛋白吸附的作用有多大，有一点已经被广泛认同的是检测研发人 员一旦尝试优化NC膜的蛋白吸附作用，这些因素都必须纳入考虑范畴。这一点在“优化蛋白吸附” 一章中有详细说明。