高效液相色谱法测定邻苯二甲酸酯实验报告

高效液相色谱法测定邻苯二甲酸酯
1553607 胡艺蕾
实验时间：2017年4月1日实验温度：19.0℃
一、实验目的
1、了解高效液相色谱仪的组成及其工作原理和基本操作。

2、对邻苯二甲酸酯进行分离和测定。

3、探究不同流动相及不同流动相比例对流速、柱压、保留时间及分离度的影响。

4、了解液相色谱法定量测定的原理。

二、实验原理
1、实验采用的反相液固吸附色谱法，其分离机理是：当流动相通过吸附剂时，在吸附剂（固体相）表面发生了溶质分子取代吸附剂上的溶剂分子的吸附作用。

固体相为非极性分子，如十八烷基键合相，流动相为极性分子。

2、组分分子与吸附剂之间作用力的强弱决定它的保留时间。

溶质分子官能团的性质和分子结构的空间效应都会影响其出峰的顺序。

本次实验为邻苯二甲酸酯，其分子官能团都相同，但由于DMP其官能团相邻的烷基较小，导致其保留值最小，因此出峰顺序为：DMP(邻苯二甲酸二甲酯)>DEP(邻苯二甲酸二乙酯)>DBP.(邻苯二甲酸二丁酯)。

3、在吸附色谱中，流动相的洗脱能力与溶剂的极性有关，极性越大，洗脱强度也越大。

本次实验使用的三个流动相的极性大小为：水>乙腈>甲醇。

通常选择二元混合溶剂作为流动相。

4、定量分析中，定量峰与其他峰之间的分离程度称为分离度R:
通常用塔板数n来描述色谱的柱效：
三、实验仪器与试剂
1、仪器
Agilent1260高效液相色谱仪：
脱气机：真空室内半透膜管路，对流动相进行脱气
四元泵：二元泵各控制一种溶剂
可设置的流速范围：0.001–10 mL/min 0.001 mL/min步进
UV检测器：用于检测通过样品后的紫外光
类型：双光束光路设计
光源：氘灯波长范围：190 –600 nm
手动进样器：进样20μL
色谱柱：填料:十八烷（适合中性、弱酸碱）
4.6 ×100mm, 3.5µm
2、试剂
流动相：纯水、甲醇、乙腈
样品：DMP、DEP、DBP
四、实验步骤
1、开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动软件。

2、预先脱气（直到导管中无气泡），设定波长：220nm。

3、设定流速、流动相比例等参数，选择合适的流动相。

4、进样阀柄置于“LOAD”，进样针用乙醇洗涤2-3次，取样，进样，将进样阀扳至“INJECT”。

5、保存并处理数据。

五、实验结果
1、样品：DMP1:20水溶液20μL 流动相的比例为：高纯水：30% 乙腈：70% 流速：1.00ml/min
2、样品：DMP1:10水溶液20μL流动相的比例为：高纯水：30% 乙腈：70% 流速：1.00ml/min
3、样品：DMP1:20水溶液10μL 流动相的比例为：高纯水：30% 乙腈：70% 流速：1.00ml/min
比较1和2的峰面积和峰高可以发现，在进量一定时，峰面积和峰高与样品的浓度成正比。

比较1和3可发现，在样品浓度相同时，峰面积和峰高与样品的进量成正比。

因此我们可以得出结论，峰面积和峰高与加入样品的物质的量成正比，这也是液相色谱法进行定量分析的依据。

对这三组数据画出标准曲线：
由标准曲线可以看出：
峰面积和峰高与样品的量基本成线性关系，且峰面积的相关性比峰高的相关性要高，更适合用于定量分析。

4、样品：混合样品1:10水溶液20μL 流动相的比例为：高纯水：30% 甲醇：70% 流速：1.00ml/min
计算分离度和塔板数
R12=2.292-1.519/(0.0995+0.1174)/2=7.128 R23=11.259-2.292/(0.3067+0.1174)/2=42.29
n DMP=16*(1.519/0.0995)^2=3.729E3 n DEP=16*(2.292/0.1174)^2=6.098E3
n DBP=16*(11.259/0.3067)^2=2.156E4
5、样品：混合样品1:10水溶液20μL 流动相的比例为：高纯水：30% 乙腈：70% 流速：1.00ml/min
计算分离度和塔板数
R12=5.087 R23=33.59
n DMP=2.415E3 n DEP=1.052E4 n DBP=2.408E4
6、样品：混合样品1:10水溶液20μL 流动相的比例为：高纯水：30% 乙腈：70% 流速：0.70ml/min
计算分离度和塔板数
R DMP=2.781-2.088/(0.1200+0.0993)/2=6.320 R DEP=8.004-2.781/(0.0993+0.2087)/2=33.92
n DMP=16*(2.088/0.1200)^2=3.633E3 n DEP=16*(2.781/0.0993)^2=1.255E4
n DBP=16*(8.004/0.2087)^2=2.353E4
7、样品：混合样品1:10水溶液20μL 流动相的比例为：高纯水：10% 乙腈：90% 流速：
1.00ml/min
计算分离度和塔板数
R12=1.680 R23=9.123
n DMP=1.454E3 n DEP=2.815E3 n DBP=1.353E4
根据上述结果我们可以发现，DMP和DEP的分离度比DEP和DBP的分离度要小。

比较结果4和5可以发现，使用乙腈的保留时间较甲醇短，这说明洗脱能力乙腈>甲醇。

但是使用甲醇的分离度较使用乙腈的分离度高。

比较结果5和6可以发现，减小流速会增加保留时间，但同时分离度会增加，塔板数也会增加。

比较结果5和7可以发现，增加二元流动相中乙腈的比例，会使得保留时间缩短，但由于对DEP和DBP的影响要大于对DMP的影响，因此DMP和DEP的峰发生了重叠，导致分离度下降
六、思考与讨论
1、为什么要预先脱气？
①输液量能够均匀准确，压力波动小；②保留时间及色谱峰面积的重现性会更好；③气泡会在谱图中出现尖峰，脱气后能使基线稳定；④保护色谱柱，防止填料氧化；
2、为什么使用二元溶液作为流动相？
利用不同比例流动相对分离度和出峰时间的影响（往往是相反的作用）进行梯度洗脱。

通过程序设定，不同时间（不同物质）来设定流动相中甲醇和水的比例，既达到较好的分离度，又能缩短不必要的时间
4、为什么会前伸/拖尾？
1、色谱柱被污染
2、样品过载
3、样品溶剂过强
5、操作注意：
1.本实验采用紫外来做检测器，由于查阅资料可知邻苯二甲酸酯的最大吸收波长位于220nm 左右，故设定的光波长为220nm，但由于短波长对杂质敏感，220nm图中容易出现小的峰和波动。

2.实验开始前需要用流动相来冲气泡。

3.用50uL注射器抽取液体时，要保证没有气泡（影响峰的大小和理论含量），同时每次最好抽取过量再排出液体至20uL。

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