【CN110042087A】一种重组狂犬病病毒rHEP△GEGFP及其应用【专利】
一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP及其应用[发明专利]
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专利名称：一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP及其应用专利类型：发明专利
发明人：罗永文,毕水莲,梁嘉琪,曾小玲,龙家慧,潘雨晴,郭霄峰
申请号：CN201910206785.0
申请日：20190319
公开号：CN110042087A
公开日：
20190723
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一种重组狂犬病病毒rHEP‑△G‑EGFP及其应用。
所述重组狂犬病病毒rHEP‑△G‑EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。
利用该重组狂犬病病毒rHEP‑△G‑EGFP建立的狂犬病病毒中和抗体水平检测方法具备以下优点：一、该病毒不能在细胞和活体中传代繁殖，因此更安全；
二、该检测方法以直接荧光显微镜下观察，更加经济便捷；三、该检测方法的测定结果相对于利用弱毒株的方法更加可靠。
申请人：华南农业大学
地址：510642 广东省广州市天河区五山路483号
国籍：CN
代理机构：广东广信君达律师事务所
代理人：杨晓松
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携带GFP基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究
中国畜牧兽医2018,45(7) :19K5-1971China Animal Husbandry &Veterinary Medicinedoi：10.16431/j.c n ki.1671-7236. 2018. 07.030携带G fT基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究刘翠，殷相平"(中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州730046)摘要：本研究旨在构建一株携带绿色荧光蛋白（G F P)的重组病毒，以便更快速、准确地检测疫苗效价。
利用基因重组技术构建含有G F P基因的重组质粒，并利用反向遗传学操作进行重组病毒的拯救，在V e t o细胞进行病毒感染并收集蛋白样品进行WestembOtt-g试验，检测外源蛋白G F P的表达情况，测定一步法生长曲线，比较与原始毒株的生物学特性差异。
结果显示，本试验成功拯救出携带G F P基因的重组狂犬病病毒毒株SAI>G F P;W e s--emblott-g试验结果显示，重组病毒可表达G F P，且随着病毒感染时间的延长，蛋白表达增多；病毒结构蛋白G蛋白表达并未受外源蛋白表达的影响，重组毒株与原始毒株的生长并无明显差异&专代后G F P仍可在病毒中稳定表达。
在连续传代过程中，本试验成功拯救出SAI-G F P重组毒株，G P T基因并未丢失，且蛋白表达量并未降低，证明该位点表达的外源蛋白在病毒传代过程中可持续稳定表达，且对病毒生长特性并未产生影响。
关键词：狂犬病病毒；反向遗传；G F P中图分类号：S852.65文献标识码：B文章编号：1671-7236(2018)07-1965-07Rescue a n d Biological Characteristics Analysis of R e c o m b i n a n t RabiesVirus Containing GFP G e n eL I U C u i，Y I NXiangping"{State Key Labrratrry o f Veterinary Etiological Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy o f Agricultural Sciences，Lanzhou 730046, China)Abstract ：T h e aim of this study was to construct a recombinant virus carrying green fluorescent protein (G F P) protein,and detect vaccine titer more rapidly and accurately. Recombinant plasmids containing GFP gene were constructed by gene recombination technology and rescued by reverse genetics. T h e viral infection in Vero cells and protein samples were collected for Western blotting assay to detect the e x pression of foreign protein GFP. One-step growth curve was compared with the biological characteristics of t he original strain. T h e results showed that w e successfully rescued the recombinant G F P-e x pressing recombinant rabies virus S A D-G F P using the constructed recombinant plasmids. Western blotting resutt showed that the recombinant virus could e x pressG F P,and the e x pression of G F P increased with the time of virus infection. T h e e x pression ofstructural protein G was not affected by the e x pression of foreign proteins. There was no significant difference between the recombinant strains and the original strains. After passage,GFP could stably e x press in the virus. In this e x periment,the recombinant S A D-G F P strain was successfully rescued. In the continuous passage, the GFP gene was not lost, and the protein e x pression level *收稿日期：2017-12-15基金项目：国家重点研发计划（2016Y F E0204100)作者筒介：刘翠（1991-)，女，河北沧州人，硕士生，研究方向：动物疫苗与分子免疫学，E-m a i l:2286140151®q q. c o m*通信作者：殷相平（1972-)，男，甘肃通渭人，副研究员，研究方向：动物传染病及分子流行病学，E-m a i l:y i n x i a I l gp i I l g@c a a s c ndid not decrease,which proved that the foreign protein expressed at this site could sustainedly and stablly express in the course of virus passage,and did not affect the growth c中国畜牧兽医45卷virus.Key words： rabies virus；reverse genetic；G F P狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，R V)感染 引起的以侵犯中枢神经为主的致死性人畜共患病传 染病[1]。
一种表达狂犬病病毒G蛋白的重组假型杆状病毒及应用[发明专利]
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专利名称：一种表达狂犬病病毒G蛋白的重组假型杆状病毒及应用
专利类型：发明专利
发明人：方六荣,吴群峰,肖少波,于福来,傅振芳,陈焕春
申请号：CN201110349009.X
申请日：20111104
公开号：CN103088063A
公开日：
20130508
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于病毒学和基因工程技术领域，具体涉及一种表达狂犬病病毒主要免疫原性糖蛋白(RVG)的重组假型杆状病毒的构建、疫苗制备及应用。
本发明得到的重组假型杆状病毒含有双表达盒，既含P启动子驱动RVG表达并使其展示在病毒粒子囊膜表面的昆虫细胞表达盒，又含CMV启动子驱动RVG在哺乳动物细胞中高效表达的哺乳动物细胞表达盒。
用该重组杆状病毒制备的狂犬病疫苗具有亚单位疫苗和活病毒载体疫苗的双重特性。
免疫小鼠后，能刺激机体产生高水平的狂犬病病毒特异性ELISA抗体、中和抗体以及IFN-γ，具有潜在的疫苗应用价值。
该重组杆状病毒BV-RVG/RVG保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：V201022。
本发明还包含了该重组杆状病毒疫苗的制备及应用。
申请人：华中农业大学
地址：430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：张红兵
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一种表达狂犬病毒g蛋白的重组乳酸菌、构建方法及应用[发明专利]
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专利名称：一种表达狂犬病毒g蛋白的重组乳酸菌、构建方法及应用
专利类型：发明专利
发明人：崔晓辰,马凤龙,曹雷,李光伟,郑建楠,申识川,邢洪强申请号：CN202111336759.3
申请日：20211112
公开号：CN114085860A
公开日：
20220225
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种表达狂犬病毒g蛋白的重组乳酸菌、构建方法及应用，属于生物工程技术领域，本发明的重组表达载体为食品级狂犬病毒g蛋白重组表达载体；将该重组载体电转进食品级乳酸乳球菌MG1363中获得可菌体表面展示表达狂犬病毒g蛋白的食品级重组乳酸乳球菌。
将其制成疫苗，可以通过口服途径免疫机体产生抗狂犬病毒中和抗体。
本发明将pgsA基因进一步构建到重组载体上，可以使表达的狂犬病毒g蛋白锚定在乳酸菌表面。
本发明可以实现新一代的口服狂犬疫苗，完成狂犬疫苗从注射到口服的完美转型，为实现消除由狗引发的人类狂犬病的全球目标有力保障。
口服疫苗安全，可通过胃肠黏膜进行抗原递呈，刺激机体产生中和性抗体，较传统注射途径免疫效果好。
申请人：青岛国脉生物科技有限公司
地址：266000 山东省青岛市崂山区株洲路153号601室
国籍：CN
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一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用[发明专利]
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专利名称：一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用
专利类型：发明专利
发明人：逯光文,杨凡力,叶飞,林升,杨婧
申请号：CN201811631304.2
申请日：20181229
公开号：CN109627294A
公开日：
20190416
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种正确折叠的重组狂犬病毒G蛋白胞外段及其潜在应用，属于蛋白质工程和生物制品技术领域。
本发明将狂犬病毒G蛋白胞外段中的融合环替换为柔性的连接肽，实现了狂犬病毒G蛋白胞外段的可溶和分泌表达，并成功制备得到了溶液中性质均一的蛋白，该方法在疫苗制备、中和抗体筛选以及用作诊断试剂盒和疫苗抗原含量标定的标准品等方面均具有重要的潜在应用价值。
申请人：四川大学
地址：610000 四川省成都市一环路南一段24号
国籍：CN
代理机构：哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司
代理人：张勇
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一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒及其应用[发明专利]
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专利名称：一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒及其应用
专利类型：发明专利
发明人：郭霄峰,施赫赫,罗均,牛学锋
申请号：CN201610703671.3
申请日：20160822
公开号：CN106244602A
公开日：
20161221
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种携带两个G基因和VP2基因的重组狂犬病病毒rHEP‑Flury(dG‑VP2)。
该重组病毒是以狂犬病病毒HEP‑Flury株为骨架，将将SEQ ID NO.1所示的VP2基因插入HEP‑Flury，再插入额外一个狂犬病毒的G基因，得到携带两个G基因和VP2基因的重组质粒
pHEP‑Flury(dG‑VP2)，最后拯救筛选获得重组狂犬病病毒株r HEP‑Flury(dG‑VP2)。
该重组病毒rHEP‑Flury(dG‑VP2)携带两个G基因且表达VP2蛋白，能够免疫诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬细小病毒VP2抗体水平，还可以降低犬用疫苗的成本，具有很好的推广应用前景。
申请人：华南农业大学
地址：510642 广东省广州市天河区五山路483号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：林丽明
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一种重组人腺病毒抗狂犬病疫苗
一种重组人腺病毒抗狂犬病疫苗
Prev.,L;姚坤
【期刊名称】《中国兽药杂志》
【年(卷),期】1990(000)004
【摘要】由于狂犬病病毒的宿主为野生动物,使狂犬病在发达国家和发展中国家仍为严重问题。
控制和世界范围内根除狂犬病需要开发安全、有效、经济且可用于人或动物在暴露前进行免疫接种的疫苗。
为此构建并试验了一种含有狂犬病糖蛋白基因的传染性人腺病毒5型重组病毒,该病毒可做为新一代抗狂犬病疫苗的原型。
这重组毒如以肠胃外途经或口鼻途经使用,可高效地刺激狗和小白鼠产生较高水平的抗狂犬病中和抗体。
用此重组毒免疫的小白鼠能抵抗致死剂量的狂犬病病毒脑内攻击而获得保护。
【总页数】4页(P53-56)
【作者】Prev.,L;姚坤
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S859.797
【相关文献】
1.人抗黏液病毒A基因重组腺病毒体外抗乙型肝炎病毒的作用 [J], 毛国强;彭明利;赵瑞秋;黄琴;刘爱平;任红;许红梅
2.比格犬注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测 [J],
哈小琴;赵治华;吕同德;劳妙芬;吴丹莉;吴祖泽
3.大鼠注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体的检测 [J], 哈小琴; 赵治华; 吕同德; 劳妙芬; 吴祖泽
4.大鼠注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体的检测 [J], 哈小琴; 赵治华; 吕同德; 劳妙芬; 吴祖泽
5.腹腔内注射IL-2重组腺病毒、IL-3重组腺病毒增强化疗药物抗白血病作用的研究 [J], 于敏;杨建民;孟沛霖;曹雪涛;章卫平
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910206785.0
(22)申请日 2019.03.19
(71)申请人 华南农业大学
地址 510642 广东省广州市天河区五山路
483号
(72)发明人 罗永文 毕水莲 梁嘉琪 曾小玲
龙家慧 潘雨晴 郭霄峰
(74)专利代理机构 广东广信君达律师事务所
44329
代理人 杨晓松
(51)Int.Cl.
C12N 7/01(2006.01)
C12N 15/65(2006.01)
G01N 33/569(2006.01)
(54)发明名称一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP及其应用(57)摘要本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一种重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP及其应用。
所述重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。
利用该重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP建立的狂犬病病毒中和抗体水平检测方法具备以下优点：一、该病毒不能在细胞和活体中传代繁殖，因此更安全；二、该检测方法以直接荧光显微镜下观察，更加经济便捷；三、该检测方法的测定结
果相对于利用弱毒株的方法更加可靠。
权利要求书1页 说明书8页序列表1页 附图4页CN 110042087 A 2019.07.23
C N 110042087
A
权 利 要 求 书1/1页CN 110042087 A
1.一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP，其特征在于，所述重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：
a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；
b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；
c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。
2.一种制备重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP的方法，其特征在于，利用基因工程技术在稳定表达狂犬病病毒CVS-11毒株糖蛋白的BHK-21细胞上构建并拯救出一种将糖蛋白基因替换成绿色荧光蛋白基因的狂犬病病毒重组毒株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：筛选稳定表达CVS-11糖蛋白的BHK-21细胞系；
S2：构建重组质粒pHEP-△G-EGFP；
S3：拯救及筛选重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2包括：
S21：PCR扩增EGFP和载体pHEP-△G(缺失糖蛋白基因)片段；
S22：将质粒进行无缝连接，将连接产物转化至感受态细胞后进行筛选得到阳性克隆菌；
S23：提取阳性克隆菌的质粒后进行鉴定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S21包括：
S211：以质粒pEGFP-N1为模板，利用引物EGFP-F和引物EGFP-R进行PCR扩增，所述引物EGFP-F和引物EGFP-R的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和SEQ NO：2所示；
S212：以质粒pHEP-3.0为模板，利用引物pHEP-△G-F和引物pHEP-△G-R进行PCR扩增；所述引物pHEP-△G-F和引物pHEP-△G-R的核苷酸序列分别如SEQ NO：3和SEQ NO：4所示。
6.根据权利要求2-5所述的方法得到的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。
7.根据权利要求1或6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP在检测抗体水平中的应用。
8.一种利用权利要求1或者6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP检测血清中的中和抗体水平的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将待测血清进行灭活处理；
S2：加入重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP进行孵育中和反应；
S3：加入BHK-21细胞悬液，培养24-48小时后直接在荧光显微镜下观察统计。
9.根据权利要求8所述的方法在评价疫苗免疫效果中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。
2。