RACE cDNA反转录说明书

RACE试验流程

RACE一．第一链合成，总RNA 10ng—1ug 反转录1．准备如下5’和3’—RACE-Ready cDNA反应管，量多加1管，以下10ul体系。

2．5×First-strand Buffer 2.0ulDTT 1.0ulDNTP Mix 1.0ulTotal V olume 4.0ul2.另外管准备如下5’和3’反应液5’RACE Ready cDNA 3’RACE Ready cDNA1.0-2.75ul RNA1.0-3.75ul RNA1.0ul 5’-CDS PrimerA1.0ul 3’-CDS PrimerA3.在第二步中加灭菌水（ddH2O）使5’RACE Ready cDNA 终体积为3.75ul，3’RACE Ready cDNA终体积为4.75ul4.混匀及短暂离心5.在PCR仪上72℃温育3min，42℃2min，冷却后14000离心20s，收集下部液体（这部可预备step7：Marster Mix）6.5’RACE Ready cDNA加1ulSMATⅡoligo7.准备足够Master Mix为5’ 3’RACE合成，室温顺序混匀以下反应液：Buffer Mix （from step1）4.0ulRNA inhibitor（400V/ul）0.25ul SMARTseribe TM Reverse Transcriptase（100V） 1.0ulTotal V olume 5.25ul8.将step7的Master Mix加到step5的3’—RACE—Ready cDNA和step6的5’终体积10ul9.移液枪吸打混匀，短暂离心收集与管底10．42℃温育90min（热盖PCR仪）11.70℃，10min12.用Tricine-EDTA Buffer稀释第一链反应产物总RNA≤200ng，加20ul Tricine—EDTA bufferRNA≥200ng，加100ulPolyA RNA，加250ul13.-20℃≤3 months。

RACE2说明书

bd smart? race cdna amplification kit user manual i. 简要概述ii. 成分列表control human placental total rna 和 bd smart ii a oligonucleotide在–70°c下保存。

nucleotrap gel extraction kit 室温下保存。

其余试剂–20°c下保存。

随bd smart race cdna amplification kit 同时免费提供bd powerscript reversetranscriptase和bd advantage 2 pcr kit。

所有试剂可以满足7 次cdna 合成反应和30次pcr反应。

first-strand cdna 合成?7μl bd smart ii? a oligonucleotide (12 μm) 5–aagcagtggtatcaacgcagagtacgcggg–3 ? 7μl 3-race cds primer a (3-cds; 12 μm) 5–aagcagtggtatcaacgcagagtac(t)30v n–3 (n = a, c, g, or t; v = a, g, or c) ? 7μl 5-race cds primer (5-cds; 12 μm) 5–(t)25v n–3 (n = a, c, g, or t; v = a, g, or c) ? 7μl bd powerscript? reverse transcriptase ? 200 μl 5x first-strand buffer 250 mm tris-hcl (ph 8.3)375 mm kcl30 mm mgcl2 ? 200 μl dithiothreitol (dtt; 20 mm) ? 1ml deionized h2o5- & 3-race pcr? 400 μl 10x universal primer a mix (upm) long (0.4 μm):5–ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagag t–3short (2 μm):5–ctaatacgactcactatagggc–3 ? 50 μl nested universal primer a (nup; 10 μm) 5–aagcagtggtatcaacgcagagt–3 control reagents? 5μl control human placental total rna (1 μg/μl) ? 25 μl control 5-race tfr primer (10 μm) ? 25 μl control 3-race tfr primer (10 μm) general reagents? 70 μl dntp mix (datp, dctp, dgtp, and dttp, each at 10 mm) ? 2 x 1 ml tricine-edta buffer 10 mm tricine-koh (ph 8.5) 1.0 mm edtanucleotrap? gel extraction kit (cat. no. 636053 or k3070-y) ? 100 μl nucleotrap suspension? 3 ml nt1 buffer? 10 ml nt2 buffer? 2ml nt3 buffer? user manual (pt3169-1) free trial-size bd advantage? 2 pcr kit (cat. no. 639207 or k1910-y) the bd advantage 2 kit provides sufficient reagents for 30 pcr reactions. ` ` ? 30 μl 50x bd advantage 2 polymerase mix ? 200 μl 10x bd advantage 2 pcr buffer ? 50 μl 50x dntp mix (10 mm each) ? 30 μl control dna template (100 ng/μl) ? 30 μl control primer mix (10 μm each) ? 1 ml pcr-grade water ? user manual (pt3281-1) iii. 另备物品下列试剂需另外准备：? 0.5-ml pcr 反应管，推荐使用 perkinelmer geneamp 0.5-ml reaction tubes (cat.no. n801-0737 or n801-0180).? mineral oil (e.g., sigma cat. no. m-3516) iv. bd smart race的要点使用前请全面阅读?所有参数均经过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。

cDNA末端快速扩增技术RACE

基本RACE原理
♥ 技术背景 ♥ 基本RACE 原理和方法 ♥ 样品要求 ♥ RACE 产物的鉴定和全长
cDNA 的获得
技术背景
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法列标签(express
sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。是多聚酶链式反应即PCR。用cDRNNAa末se 端保快护速、扩S1增核(R酸A酶C谱E)和技引术物。延
3′端。
RACE流程
（1）
GSP 与 cDNA 模板的关系
cDNA 末端快速扩增(RACE) 技术。
cDNA RACE cDNA synthesis Kit原理 poly(C)替代poly(A) 增加模板中有效双链丰度
RNase H
5′-RACE法
利5′-用RAOCli（Ego法2(d）T) 对mRNA 进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ，
利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。
用RNase 保护、S1 核酸酶谱和引物延
RACE 产物的3′和5′
得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法：
SMART RACE cDNA synthesis Kit
SMART RACE cDNA synthesis Kit
基本RACE 原理和方法
与通用引（物4的）3’-末端不互补
样品要求：
◇ 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。
◇ Total RNA无降解，OD260/280=1.8 ~ 2.0。
◇ 提供尽量多的实验材料：3′ RACE Total RNA＞ 15 μg；5′RACE Total RNA＞25 μg。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。

RACE

RACE第一RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。

尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。

近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长cDNA提供了一个便捷的途径。

cDNA 末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA 反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。

简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。

因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。

第二RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。

3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。

这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。

再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。

三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。

扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。

Mei5bio M5 HIPER

Mei5Biotechnology,Co.,Ltd:(86)-010-********,*****************,Mei5bio Inc. All rights reserved.M5 HIPER ™ RACE cDNA Synthesis Kit 使用手册（请使用低吸附枪头）Cat.# MF670-01 10T （12.5ul 体系）完整的5‘和3’c D N A 末端简便的一管两步法程序低至50 n g 总R N A或25 n gp o l y A + R N ARACE cDNA Synthesis Kit使用手册目录I.简介 (2)II.HIPER™ cDNA 合成技术 (2)III.操作简述 (4)IV.HIPER™试剂盒组分 (6)V.注意事项 (7)VI.引物设计 (8)VII. 总RNA和m RNA制备与处理 (10)VIII. 第一链cDNA合成 (11)IX. 快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE) (13)X. RACE产物鉴定 (15)XI. 常见问题及解决方案 (17)XII. 参考文献 (23)I.简介HIPER™ RACE cDNA合成试剂盒通过扩增基因的5'和3'末端精细、有效地完整克隆基因。

HIPER™ RACE方法可有效地在样品cDNA 5 '和3 '末端加入人工接头，尽可能地形成最完整的RACE产物。

反转录步骤后合成的第一链cDNA可直接用于5'和3' RACE PCR反应，无需再进行繁复的第二链cDNA合成和接头连接的过程。

其他RACE方法均因扩增的高背景和截短的5 '末端而存在明显的劣势。

优化后的方法既便是在样本很小的情况下，也可以显著降低非特异性的扩增，且只需单一PCR管和两步法的程序就可使您的RNA样品合成cDNA。

此外，HIPER™技术由于避免了接头连接的步骤，在RACE PCR过程中直接使用cDNA作为模板，从而降低了RACE的过程的复杂性，并使其更快捷（Chenchik et al，1998），操作时间更缩短至4个小时。

TAKARA公司的5' full RACE说明书

400 μl 100 μl 100 μl
For Control Reactions（5 次量）：
Control HL60 Total RNA（1 μg /μl）*2 5′RACE Control Outer Primer（10 μM）*2 5′RACE Control Inner Primer（10 μM）*2
引物序列（5’→ 3’） CATGGCTACATGCTGACAGCCTA CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG AGGTAGGTGATGTTCCGAGAGCGT TTGGAGTCGCCCTCAGCAGAGAT
长度 23 mers 34 mers 24 mers 23 mers
团。 3. 使用 T4 RNA Ligase 将 5′RACE Adaptor 连接到去帽后的 mRNA 上。 4. 以上述 3 的mRNA作为模板，使用Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-），Random 9 mers
进行反转录反应合成cDNA。 5. 使用下游外侧特异性引物 GSP1 和 5′RACE Outer Primer 进行 Outer PCR 反应，再使用下游内侧
行 5′RACE 实验。 3．高特异性的 5′RACE 扩增。套式 PCR 法的使用，大大提高了 5′RACE DNA 片段扩增的特异性。
4．长片段 5′RACE扩增。试剂盒中使用了本公司特殊改良的M-MLV（RNase H-）反转录酶，反转录性
能良好，使长片段的RT-PCR扩增成为了可能。
●制品内容（10 次量）
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读！
1．进行 5′RACE 实验时，为提高 RACE 结果的可信度，应同时进行 TAP（-）和 M-MLV（-）的负对照实验。TAP（-）即：RNA 经去磷酸化反应后不进行 TAP 处理，直接进行 5′RACE Adaptor 的连接及后续实验，以验证 RNA 去磷酸化是否充分。如果充分，RT-PCR 将不能扩增。但是，真正进行 TAP（-）负对照实验时，由于不能保证 100%的去磷酸化，往往会有 RT-PCR 扩增结果，但其扩增片段长度一般不同于目的片段。M-MLV（-）即：5′RACE Adaptor 连接反应后进行 RT 反应时不添加 M-MLV，以排除基因组 DNA 污染造成的假阳性结果。如果 M-MLV（-）的负对照实验没有特异性扩增，说明 5′RACE 结果来源于 mRNA。

RACE说明

TaKaRa Code：D3155’-Full RACE Kit(10次量)目录内容页码●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●试剂盒原理 2 ●特异性引物的设计要求 3 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 3 ●试剂盒使用注意 4 ●使用Control HL60 Total RNA时的5′RACE实验例 4 ●实验样品的5′RACE操作方法 8 ●实验例 11 ●Q&A 11●制品说明本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA 5′末端全长的试剂盒。

使用RT-PCR方法扩增目的DNA时，一般很难得到全长的cDNA片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列十分重要。

RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效解决这一问题。

TaKaRa 5′-Full RACE Kit能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5′末端的全长序列。

本试剂盒应用了“去帽法”原理，Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）可以去掉mRNA的5′帽子结构，使用T4 RNA Ligase将5′RACE Adaptor连接到mRNA的5′端后，可以使用5′RACE Adaptor 上的引物与已知序列部分的引物进行RT-PCR反应，高特异性地扩增cDNA 5′末端的全长序列。

本试剂盒中含有完成5′RACE操作的主要试剂。

试剂盒中使用的Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNase H活性，大大增加了反转录性能。

结合使用TaKaRa LA Taq®（TaKaRa Code：DRR02AM）进行PCR扩增时，其5′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。

本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行5′RACE实验，并且对长片段的5′RACE扩增具有明显优势。

CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介

CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。

这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。

RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。

3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。

然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。

3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。

•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。

•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。

•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。

5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。

利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。

然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。

race法获得全长cdna序列的过程

race法获得全长cdna序列的过程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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RACE中文说明书

SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual l^ibk or Contents内容页码L概要简介II•成分m •另备物品IV. BD SMART RA€E AmpliRcaLn 基本康理 "引物设计VL Poly A* † RNA和总RNA的制备vn. cDNA的弟一密的舍成vm pat阳性对豐_____________________________QC3N碌端的快速扩ifl(RACE)lX. RACE产物鉴定XL疑难解答501 •参考文献xm •相关产吕附录加5 -RACE流程图示附录皿3-RACE 图示PH 录C; SupprffiHoa PCR and StetMJiH PCR 39I•简要概述II.成分列表Comral Hunun PLicenialTolal RNA 和BD SMART IIA 01ig3nuLlcoddott-70fi CT保存。

NudeoTrap Gel Extraction Kit 2ST保存.其条试笊-20临下保存.fig BD SMART RACE <DNA Amplified lion Kit 同时免费提供BD PowerScript Reveise Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kiu所有试刑可以淞足7次cONA含成反应和30次PCR反应.Fint->btr«ind cDNA 含成•7jil BD SMART IT™ A OUgonueleotide (12 pM)5-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGTACGCGG (T†7pl 3f-HACE CDS Primer A (3^05; 12 pM)5-AAGCAGTGGI7VTG.^AGG GAGAGTACfTJJOV N-3*arT V = A, G, or C)•7pl 5f-RACE CDS Primer (5'«CDS; 12 pM)茴小5TD25VN-3*(N = A,C,G 曲戸V = A, C,orC)•7pl BD PoiverScrlpl™ Reverse I^-anscriptaM•200 pl 5X FirabSLrdnd Buffer250mMTHs-HCI (pH 83)375 mM KC130 niM Mgpl2•200 pl DJthiothreitol (DTT; 20 mM),二硫苏權醉•1ml Deianitzecl H2O5••& 3 -RACE PCR•400 pl 10X Universal Primer A Mix (UPM)Long (0.4 pM):5,-CIAAIACGA€TGACTXrAGGGCAAG-CAGTCGIATGAACGCAGAGT-3, Short (2 pM):5,-^.4ATACGACTCACTATAGGCC^•50 pl Nested Unh ersal Primer A (NUP; 10 pM>5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT7Control Reagents•5pl Coatrol Human Phcental (胎盘)Total RNA (1 pg/pl)■ 25 pl Control 5 -RACE T¥R Primer (10 pM)•25 pl Control 3'RACE IVR Primer (10M)PGeneral Reagents•70 pl dNTP Mix (dAl£ dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)•2Xlml l¥kine-EDTA Buffer10 mM Tricine-KOH (pH 8.5)1.0 mM EDTANudeoIYap® Gei Extraction Kit (CaL No 636053 or K3070-y)•100 pl NudeoTrap Suspension•3 ml NT1 Buffer•10 ml NT2 Buffer•2ml N13 Buffer•User Manual (PT3l6d-l)Free Lrial-size BD Advantage™ 2 PCR Kh (Cat No. 639207or K19l0-y)Tho BD Advanuge 2 kit provider suf fie ieni roagenls for 30 PC R reactions.The following a)m|X>nenls are included:•30 pl SOX BD Advantage 2 Polymerase Mix•200 pl 1 OX BD Advance 2 PCR Buffer•30 pl SOX dNTP Mix (10 mM S)•30 pl Control DNA Template (100 n^/pl)•30 pl Control Primer Mix (10 pM each)• 1 ml PCR-Grade Wator•User Manual (PT3281-1)III.另备物品下列试刑襦另外准笛；•0.5-1 nl PCR 反应管.推荐使用PerkinElnier GeiwAmp O.S-ml fXMClion tubes (dl. No. N8ai-O737ufN0Ol-O18O).•Mineral oil («.g., Sigma CdL Na M-3516)俺小IV BD SMART RACE的要点使全面闻读•所有妙锻均经过优彳匕但可能因所使用的辭、根版、引物和然循环仪而不同•因此应使用Control Human Pldceeiul T OLI I RNA5R]Cantrol T- anil 31- RACE TF*R Prinwns进行烦实•RACE PCR的效率取决于试腌样品RNA中mRNA的丰盛•另外ig火温愷和延伸遍廈也依引韧不同而变化.诗参照第X节的侵议优彳匕PCR的条弁•丑进行5f-RACE and 3--RACE PCRK必别便用热启动。

RACE技术的原理和操作

RACE技术的原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种用于扩增cDNA末端序列的方法，广泛应用于克隆和鉴定未知基因的研究中。

下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。

一、原理：RACE技术是通过逆转录反应将RNA转录成cDNA，然后利用特殊的引物设计，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最终得到所需的cDNA末端序列。

RACE技术主要包括5'-RACE和3'-RACE两个步骤。

5'-RACE：用于扩增未知序列的5'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行逆转录反应，得到第一链cDNA。

2.利用聚dT载体和逆转录酶进行第二链合成。

3.利用内源引物（如具有较高表达的基因的已知序列）和外源引物A 进行PCR扩增。

4. 应用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。

5.得到扩增的特异性产物后，纯化PCR产物并进行测序分析，获得5'端的未知序列。

3'-RACE：用于扩增未知序列的3'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行反转录反应。

2.利用特异性引物（如基因的已知3'端序列）和逆转录酶进行第一轮PCR扩增。

3. 利用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。

4.纯化PCR产物并进行测序分析，获得3'端的未知序列。

二、操作：1. 提取总RNA：一般使用RNAiso Plus试剂或类似试剂从细胞或组织中提取总RNA。

2. 逆转录反应：利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。

逆转录酶一般有M-MLV逆转录酶和SuperScript III等。

3.第一链合成：利用聚克隆酶将逆转录的cDNA合成第一链，即得到第一链cDNA。

4.第二链合成：利用特殊的引物和逆转录酶将第一链cDNA合成第二链。

cDNA末端快速扩增技术RACE

SMART RACE cDNA
碱基互补配对原则
AT之间之间形成两个氢键 GC之间之间形成三个氢键
poly(C)替代替代poly(A) 替代增加5′ 接头与cDNA 第一链的结合牢固性增加接头与
增加模板中有效双链丰度
提高目的基因获取几率
SMARTer RACE流程流程

SMARTTM 3'-RACE的原理的原理
• 利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作利用mRNA的3'末端的poly（ mRNA 末端的poly 为一个引物结合位点，以连有SMART SMART寡为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo dT） Oligo（核营酸序列通用接头引物的Oligo（dT） 30MN作为锁定引物反转录合成标准第 30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA. cDNA.然后用一个基因特异引物一链cDNA.然后用一个基因特异引物 GSP1（ primer，GSP） GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM UPM（序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物， primer，UPM）作为下游引物，以cDNA 第一链为模板，进行PCR循环， PCR循环第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。 DNA片段扩增出来基因3' 末端的DNA片段扩增出来。
5′-RACE法 5′-RACE法原理图
RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得
3′或5′双链或双链双链cDNA
限制性内切酶酶切

race技术原理和操作

RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术的原理和操作近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。

但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。

cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5' 和3' 端，包括单边PCR和锚定PCR。

该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等11999）。

对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个简并的核苷酸[5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C；N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5' 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA 聚合酶可能在高温（60℃~70℃）有效地逆转录mRNA，从而消除了5' 端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR（hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。

逆转录技术手册说明书

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目录逆转录 | iii仅供科学研究使用1 逆转录 (1)1.1 发现 (1)1.2 发展 (1)1.3 应用...........................................................22 建立逆转录反应 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32.1 步骤 (3)2.1.1 RNA 模板制备 (3)2.1.2 基因组DNA 去除 (6)2.1.3 选择引物 (6)2.1.4 进行逆转录 (8)2.1.5 基因组DNA 去除 (9)2.2 常见逆转录酶及性质 (9)2.2.1 DNA 聚合酶活性 (9)2.2.2 RNase H 活性 (10)2.2.3 热稳定性 (11)2.2.4 持续合成能力 (12)2.2.5 保真度 (14)2.2.6 末端转移酶（TdT ）活性 (14)2.3 常见问题及解决建议 (15)2.3.1 RT -(q)PCR 扩增量低或未扩增 (15)2.3.2 RT -(q)PCR 非特异性扩增 (16)2.3.3 cDNA 截短 (17)2.3.4 cDNA pool 覆盖率低 (18)2.3.5 cDNA 测序错误 (19)3 应用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1 逆转录聚合酶链式反应（RT -PCR ）. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1.1 RT -PCR (20)3.1.2 定量RT -PCR (27)3.1.3 直接RT -qPCR (28)3 .2 cDNA克隆和文库构建 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .293.3 cDNA末端快速扩增 (32)3.4 基因表达芯片 (34)3.5 RNA测序 (36)3.6 逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP） (38)iv | 逆转录仅供科学研究使用1 逆转录本章内容涵盖逆转录基础、cDNA合成、酶选择、常见问题处理技巧以及cDNA在分子生物学研究中的应用，是适用于各种层级研究人员的学习资源。

SMARTerRACEcDNA扩增实验流程（clontech）

SMARTerRACEcDNA扩增实验流程（clontech）SMARTer? RACE cDNA 扩增试剂盒操作⼀览(PT4096-2)本操作⼀览仅为实验流程，对于初⽤者，请在使⽤操作⼀览前仔细阅读SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒(Cat. Nos. 634923 & 634924) 的说明书。

⼀、RACE-Ready cDNA的准备为了获得RACE-Ready cDNA (说明书的Section V)，请准备5’- & 3’-RACE-Ready cDNA 合成反应体系，共需要4个反应管，每管均为10µl反应体系。

1. 混匀以下试剂，并瞬时离⼼。

在进⾏Step 7前，将反应管室温放置:2.0 µl 5X First-Strand Buffer1.0 µl DTT (20 mM)1.0 µl dNTP Mix (10 mM)4.0 µl 总体积2. 分别向这些管中加⼊对应的以下试剂：准备5'-RACE-Ready cDNA 准备3'-RACE-Ready cDNA1.0–2.75 µl RNA* 1.0–3.75 µl RNA*1.0 µl 5'-CDS Primer A 1.0 µl 3'-CDS Primer A*使⽤1 µl 对照⼩⿏⼼脏总RNA(1 µg/µl)。

3. 将step2中的5'-RACE-Ready cDNA 定容⾄3.75 µl；将3'-RACE-Ready cDNA 定容⾄4.75µl。

4. 混匀试剂，瞬时离⼼。

5. 72°C 孵育3 min，然后42°C冷却2 min。

最后14,000rpm离⼼10sec。

注意: 此步骤在PCR仪中进⾏，在孵育时，准备step7。

RACE的技术原理和操作

RACE的技术原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种用于扩增cDNA末端的技术，主要用于确定基因的结构和转录起始位点。

RACE技术的关键步骤包括cDNA合成、RNA末端修饰、RACE PCR、校正反应和测序。

下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。

首先，RACE技术需要提取待研究的组织或细胞中的总RNA，使用反转录酶通过逆转录反应合成第一链cDNA。

反转录反应的关键是引入适配器序列（adaptor sequence）到cDNA末端，这样可以提供引物（primer）结合的位点。

接下来，使用指定酶（比如TdT）对合成的cDNA末端进行修饰。

修饰反应通常使用非模板化的端粒酶，这样可以在cDNA的3'末端添加poly-A尾。

添加poly-A尾的目的是为了提高引物的亲和性和特异性，同时也是为了提高RT-PCR的反应效率。

然后，在修饰的cDNA末端使用逆转录引物（gene-specific primer，GSP）和转录启动座位引物（TSP）进行PCR扩增。

逆转录引物是根据已知基因序列的3'末端设计的，它与cDNA的修饰末端具有互补性。

转录启动座位引物是根据已知基因序列的5'末端设计的，它也与cDNA的修饰末端具有互补性。

PCR反应的条件和步骤与常规PCR相似，但使用了增长温度梯度，以优化反应条件。

PCR反应通常包括初步扩增和内部扩增。

初步扩增通过扩增初始cDNA的末端，避免其它非特异性产物的扩增。

内部扩增是针对初步扩增产物进行的，目的是获得特异性较强的产品。

在内部扩增中，逆转录引物和转录启动座位引物的使用与初步扩增相同。

完成PCR反应后，需要验证PCR产物的特异性。

通常，可以通过凝胶电泳分析PCR产物来确定其大小和特异性。

如果PCR产物存在多个带或杂带，可能需要优化PCR反应的条件。

对于RACE技术最关键的一步是校正反应（nested PCR）。

RACE原理及实验步骤

RACE原理及实验步骤RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增和克隆未知DNA序列的两端。

通过RACE技术，研究人员可以对未知基因的序列进行扩增和鉴定，从而了解该基因的结构和功能。

RACE技术主要包含两个步骤：首先是逆转录，将RNA转录为cDNA，然后是扩增，利用特定的引物扩增未知序列。

下面将详细介绍RACE技术的步骤和操作方法。

实验步骤：1.RNA提取：首先需要从组织或细胞中提取RNA。

可以使用常见的RNA提取试剂盒，按照厂家提供的操作指南进行操作。

2.逆转录：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。

逆转录可以选择两种方法：随机引物逆转录和基因特异引物逆转录。

-随机引物逆转录：在反应体系中添加随机引物，以确保逆转录反应能逆转录所有RNA分子。

将RNA与随机引物一起孵育，使得引物能够与RNA序列互相结合，并成为逆转录反应的起始点。

逆转录反应通常在37-42°C进行，持续1-2小时。

-基因特异引物逆转录：如果已知目标基因的部分序列，可以使用基因特异引物逆转录。

在逆转录反应系统中添加特异引物，使其与目标基因序列互补结合。

该方法提高了逆转录的特异性，从而只逆转录目标基因。

3.RACE扩增：使用扩增反应将目标序列扩增出来。

扩增过程通常使用PCR技术。

-5'RACE：首先进行5'RACE，即扩增未知基因序列的5'端。

为了扩增未知基因的5'端，需要将cDNA的3'端进行特定的修饰，以便进行扩增。

修饰通常包括尾修饰和连接转录片段引物。

然后使用尾修饰的cDNA和一个基因特异引物进行PCR扩增。

PCR反应条件根据实际情况进行优化，反应体系中应包括模板cDNA、引物、dNTPs和热稳定DNA聚合酶等。

- 3' RACE：进行3' RACE，即扩增未知序列的3'端。

在逆转录反应中添加一段poly(A)尾修饰，将逆转录产物转录为cDNA。

RACEcDNA反转录说明书

RACEcDNA反转录说明书RACE cDNA反转录说明书1.准备cDNA合成反应液2.0 ul 5×First-Strand Buffer1.0 ul DTT (20uM)1.0 ul dNTP Mix (10mM)总共体积：4ul2.准备以下试剂：5’-RACE-cDNA: 1.0—2.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A 3’-RACE-cDNA: 1.0—3.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A Control-cDNA: 只需要1ul mouse heart total RNA（1ug/ul）3.加入H2O于上一步反应液至5’-RACE为3.75ul，3’-RACE 为4.75ul，然后轻轻吸打混匀。

4.放入PCR仪反应：72℃3min,42℃2min然后14000g离心10s。

5.对于5’-RACE-cDNA的合成，加入1ul SMART erⅡA oligo至4.75ul。

6.配混合液： 4.0ul Buffer mix from step 10.25ul RNase inhibitor (40U/ul)1.0ul SMARTScribe reverse transcriptase (100U)总体积：5.25ul7.将第6步混合液加入第2步微离心管中，使总体积达到10ul。

用枪轻轻吸打混匀。

8.42℃反应90min，然后70℃反应10min。

9.用Tricine-EDTA buffer稀释反应产物：如果：起始RNA<200ng,加入20ul；起始RNA>200ng,加入100ul；Poly A+ RNA，加入250ul。

10. 将稀释好的cDNA模板保存于-20℃，最长时间达3个月。

迈标准RACE重构同源性CDNA及配件说明书

(PA32516)5' and 3' cDNA fragments of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) genewere amplified using the Marathon RACE procedure and the Advantage ® 2 Polymerase Mix (Cat. No. 639201). 5'-RACE was primed with the AP1 Primer and the Control 5'-RACE G3PDH Primer; 3'-RACE was primed with the AP1 Primer and the Control 3'-RACE G3PDH Primer. Following 20 cycles of amplification, a single 5'-RACE product of 1.09 kb and a single 3'-RACE product of 1.2 kb were observed on a 1.2% agarose/EtBr gel.United States/Canada 800.662.2566Asia Paciﬁc+1.650.919.7300Europe+33.(0)1.3904.6880Japan+81.(0)77.543.6116Clontech Laboratories, Inc.A T akara Bio Company 1290 T erra Bella Ave.Mountain View, CA 94043Technical Support (US)E-mail:*****************CATALOG NO.639336NOTICE TO PURCHASER:Our products are to be used for research purposes only. They may not be used for any other purpose, including, but not limited to, use in drugs, in vitro diagnostic purposes, therapeutics, or in humans. Our products may not betransferred to third parties, resold, modified for resale, or used to manufacture commercial products or to provide a service to third parties without prior written approval of Clontech Laboratories, Inc.Your use of this product is also subject to compliance with the licensing requirements listed below and described onthe product´s web page at . It is your responsibility to review, understand and adhere to any restrictions imposed by these statements.TRADEMARKS:Clontech, the Clontech logo , Advantage and Marathon are trademarks of Clontech Laboratories, Inc.All other marks are the property of their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions. Clontech is a Takara Bio Company. ©2016 Clontech Laboratories, Inc. This document has been reviewed and approved by the Clontech Quality Assurance Department.。