RACE cDNA反转录说明书

RACE cDNA反转录说明书

1.准备cDNA合成反应液

2.0 ul 5×First-Strand Buffer

1.0 ul DTT (20uM)

1.0 ul dNTP Mix (10mM)

总共体积：4ul

2.准备以下试剂：

5’-RACE-cDNA: 1.0—2.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A

3’-RACE-cDNA: 1.0—3.75ul RNA, 1.0ul 5’-CDS Primer A

Control-cDNA: 只需要1ul mouse heart total RNA（1ug/ul）

3.加入H2O于上一步反应液至5’-RACE为3.75ul，3’-RACE为

4.75ul，然后轻轻吸打混匀。

4.放入PCR仪反应：72℃3min,

42℃2min

然后14000g离心10s。

5.对于5’-RACE-cDNA的合成，加入1ul SMARTerⅡA oligo至4.75ul。

6.配混合液： 4.0ul Buffer mix from step 1

0.25ul RNase inhibitor (40U/ul)

1.0ul SMARTScribe reverse transcriptase (100U)

总体积：5.25ul

7.将第6步混合液加入第2步微离心管中，使总体积达到10ul。用枪轻轻吸打混匀。

8.42℃反应90min，然后70℃反应10min。

9.用Tricine-EDTA buffer稀释反应产物：

如果：起始RNA<200ng,加入20ul；

起始RNA>200ng,加入100ul；

Poly A+ RNA，加入250ul。

10. 将稀释好的cDNA模板保存于-20℃，最长时间达3个月。