免疫学常用实验方法共63页
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最新免疫实验免疫学及免疫检测技术试验
二、实验方法：
1、包被抗体： 包被抗体浓度为：用包被液稀释（包被聚苯乙烯要
在偏碱性条件下进行，所以该包被液用pH9.6的碳酸盐 缓冲溶液）抗体至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔
18孔的安排：
ELISA
套上包装袋，
4℃过夜，
弃上清，以
洗涤液(200ul) 空
洗涤三次，甩 干。
三、结果处理： 于荧光显微镜下观察荧光，并照相，于实验报告上 附上你获得的荧
附一张样板
结束语
谢谢大家聆听！！！
20
•荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用 200ng/ml，500ng/ml
37℃，1hr，洗涤液洗涤三次
3、加酶标抗体、荧光标记抗体：
•所有ELISA各孔均加100ul（已稀释好,稀释倍数：2000
•各荧光孔不加酶标抗体，加荧光标记抗体100ul,(已稀释 好，稀释倍数：50)
•！！！注意！！！ 荧光怕见光，注意避光，加液、保温时都要避光
37℃，45min，取出后保温平衡10分钟,洗涤液洗涤三次， 荧光各孔可不洗
4、观察荧光、ELISA各孔加底物：
一组同学观察荧光、一组同学加酶底物。 酶底物溶液要现配，由老师或同学代表配制一份即可。 各孔加100ul，37℃保温15min。
一、实验原理
本实验不用夹心法，直接加抗原，再加金标抗体。
二、实验操作：
1. 点加抗原：（人IgG）： 在硝酸纤维素膜下垫吸水材料（卫生纸），用微量移 液器取3ul抗原溶液点于硝酸纤维素膜上，注意点样 时要逐次点于膜上，待前次所点液体渗入后再继续点， 不要使斑点太大，同时注意不要太用力将膜点破，致 使斑点太大。 烤干或吹干，保证抗原能够吸附到膜上， 给蛋白质一定吸附时间，否则下步的洗涤有可能将蛋 白洗掉！）。
免疫学实验方法
可通过以下三种方法检测。
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
三. 制备SDS－PAGE胶
四. 转移电泳及免疫印迹
五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件
imageJ或Quantity One
免疫学三大工具比较
• 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧 光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行
定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组
• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
假阴性结果。
• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大
分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位点夹心 。
间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
受检抗体，故称为间接法。
☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，
用于临床检验的ELISA主要有以下几 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
三. 制备SDS－PAGE胶
四. 转移电泳及免疫印迹
五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件
imageJ或Quantity One
免疫学三大工具比较
• 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧 光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行
定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组
• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
假阴性结果。
• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大
分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位点夹心 。
间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
受检抗体，故称为间接法。
☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，
用于临床检验的ELISA主要有以下几 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
免疫学常用实验方法-PPT资料63页
Zhao, X. et al. Cancer Res 2019;67:4443-4450
•成败的关键因素： 组织的固定、包埋 抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间） 非特异性抗原的封闭 内源性酶或自发荧光的消减 显色
思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？
3. Flow Cytometric analysis(流式细胞术) FACS: (Fluorescence-Activated Cell Sorter)
1. ELISA(酶联免疫吸附试验 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
RIA (radioimmunoassay, Berson&Yalow， 1960)
IRMA(immunoradiovelric assay, Miles&Hiles, 1968)
E(L)I(S)A (Engvall&Perlmann, van Weemen and Schuurs , 1971)
Complementarity-determining regions (CDRs):
CDR1 CDR2
CDR1
CDR2 CDR3
CDR3
H
FR1
CDR1 FR2 CDR2 FR3
CDR3
FR4
L
CDR: Complementarity Determining Region FR: Framework Region
alive
HGPRT+， TK+
HGPRT-， TK-
B cell+MyelomaMyeloma Myeloma+Myeloma HGPRT-， TK-
H, 次黄嘌呤 T, 胸腺嘧啶
•成败的关键因素： 组织的固定、包埋 抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间） 非特异性抗原的封闭 内源性酶或自发荧光的消减 显色
思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？
3. Flow Cytometric analysis(流式细胞术) FACS: (Fluorescence-Activated Cell Sorter)
1. ELISA(酶联免疫吸附试验 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
RIA (radioimmunoassay, Berson&Yalow， 1960)
IRMA(immunoradiovelric assay, Miles&Hiles, 1968)
E(L)I(S)A (Engvall&Perlmann, van Weemen and Schuurs , 1971)
Complementarity-determining regions (CDRs):
CDR1 CDR2
CDR1
CDR2 CDR3
CDR3
H
FR1
CDR1 FR2 CDR2 FR3
CDR3
FR4
L
CDR: Complementarity Determining Region FR: Framework Region
alive
HGPRT+， TK+
HGPRT-， TK-
B cell+MyelomaMyeloma Myeloma+Myeloma HGPRT-， TK-
H, 次黄嘌呤 T, 胸腺嘧啶
常用的临床免疫学检测技术【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版常用的临床免疫学检测技术第一讲免疫浊度技术一、免疫浊度法基本原理免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。
二、免疫比浊法的特点：1、自动化免疫分析稳定性好，敏感性高(达ng/L)、精确度高（CV<5%)，干扰因素少，结果判断更加客观、准确，也便于进行室内及室间质量控制。
2、自动化免疫分析快速、简便，结果回报时间短，便于及时将各种信息向临床反馈，又可节约大量人力物力，利于大批量样品的处理。
3、自动化免疫分析能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。
4、自动化免疫分析可利用多道计数器、测光仪，同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析项目，血清用量少，具有明显的应用优势。
三、免疫浊度法分类（一）透射光免疫浊度法透射光免疫浊度法是个极简便的方法，测定方式是测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减，读数以吸收光单位（A）或OD表示，这种A值反映了入射光和透射光的比率。
（二）散射比浊法散射比浊法应用越来越多，且有替代其他免疫定量法的趋势。
散射比浊的原理是根据雷利(Rayleigh)公式提出的，当复合物较小时（<3*10）呈全透射，透射与散射相当。
当复合物大于入射光波的1/20时，形成不对称前向散射，在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果，散射光的量代表复合物的量。
1、终点散射比浊法2、速率散射比浊法速率法的灵敏度与特异性都优于终点法，前者的灵敏度比后者高出3个数量级之多，但终点法稳定性好。
所谓速率，是在某单位时间内形成大于3*10以上的复合物量（不是积累数），当仪器测定到某一时间单位内形成的速率下降时，即出现速率峰，该峰值的高低，即代表抗原的量。
速率散射比浊法有三大特点：1、时间快，一般在30-60s之内就可完成测试；2、比较准确，因其测定形成速率，抗原多，速率快；3、节省试剂。
临床常用免疫学检验方法.pptx
糖脂类P460-461
癌抗原50（cancer antigen 50, CA-50) 癌抗原72-4（cancer antigen 72-4, CA72-4) 糖链抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9,
CA19-9) 癌抗原242（carbohydrate antigen 242, CA242)
蛋白类P458-460
甲种胎儿球蛋白（alpha fetoprotein, AFP) 癌胚抗原（carcineombryonic antigen, CEA) 前列腺特异抗原（prostate specific antigen, PSA) 癌抗原125（cancer antigen 125, CA125) 癌抗原15-3（cancer antigen 15-3, CA15-3) 组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen, TPA) 鳞状上皮细胞癌抗原（squamouse cell carcinoma antigen, SCC)
• 13、志不立，天下无可成之事。20.11.1520.11.1514:33:4314:33:43November 15, 2020
• 14、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If I'd gone alone, I couldn't have seen nearly as much, because I wouldn't have known my way about.
临床常用免疫学检验方法
抗原抗体反应检测
利用抗原和抗体特异性结合的原理，通过标记技术对抗体 或抗原进行标记，从而对目标抗原进行定量或定性检测。
细胞免疫检测
通过对免疫细胞表面的标志物或其功能活性进行检测，了解机体 的细胞免疫状态。常用的方法包括T细胞亚群分析、细胞因子检测
等。
体液免疫检测
通过对血清或血浆中的免疫球蛋白、补体等成分进行检测，了解 机体的体液免疫状态。常用的方法包括免疫球蛋白检测、补体活
一种基于胶体金标记抗体的免疫学检测方法，通过观察胶体金颜色变化来判断抗 原或抗体的存在。
详细描述
胶体金免疫层析试验利用胶体金标记的抗体与抗原结合后产生的颜色变化，通过 肉眼观察或仪器检测来判断抗原或抗体的存在。该方法具有快速、简便、无需特 殊仪器等优点，广泛应用于临床诊断和快速检测领域。
04 细胞免疫学检测方法
间接凝集试验的优点是敏感性较高，但操作相对复杂。
抗球蛋白试验
抗球蛋白试验是一种用于检测红细胞表面抗原 的试验方法，通过将待测红细胞与相应抗体结 合后，观察是否发生凝集反应。
该方法常用于诊断自身免疫性溶血性贫血等疾 病。
抗球蛋白试验的优点是特异性高，但操作难度 较大。
补体结合试验
补体结合试验是一种通过检测 补体活化程度来判断抗原或抗
有重要价值。
0ห้องสมุดไป่ตู้ 其他免疫学检测方法
免疫散射比浊法
要点一
总结词
一种基于抗原抗体反应的检测方法，通过测量反应液中颗 粒物的散射光强度来定量测定抗原或抗体浓度。
要点二
详细描述
免疫散射比浊法是一种简便、快速、准确的免疫学检测方 法。其原理是当抗原抗体反应发生时，会产生一定大小的 复合物颗粒，这些颗粒在光的作用下产生散射光。通过测 量散射光的强度，可以推算出抗原或抗体的浓度。该方法 广泛应用于临床实验室，用于检测各种免疫相关疾病，如 风湿性疾病、肾脏疾病等。
免疫学常用实验方法64页文档
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❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
免疫学常用实验方法
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
免疫学实验方法共77页
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ—苏联
免疫学实验方法
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ—苏联
免疫学实验方法
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
常见免疫学试验技术
常见免疫学试验技术本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March免疫学实验实验一与免疫相关的细胞形态的观察目的要求：观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。
实验器材：显微镜血液涂片（瑞氏染色）结缔组织切片方法：油镜观察一．血涂片的观察（A）红细胞：淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。
（B）颗粒白血球嗜中性颗粒白血球：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。
直径10—12微米。
嗜酸性颗粒白血球：略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。
直径10—15微米。
2嗜碱性颗粒白血球：体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。
直径10—11微米。
（C）无颗粒白血球淋巴细胞：涂片中可观察到中、小型两种。
小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。
其中含致密的核，染成深紫色。
周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。
中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。
6-8微米。
单核细胞：体积最大，细胞圆形。
胞质染成灰蓝色。
核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。
直径14-20微米。
二．肥大细胞的观察（示教）胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。
其中含肝素、组织胺等物质。
常成群地分布于血管的周围。
三．浆细胞的观察（示教）细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。
核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。
正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。
浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。
四．巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。
常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。
免疫学检测方法共65页
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
免疫学检测方法
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
谢谢！
免疫学检测方法
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
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（1）固相的抗原或抗体，
即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;
（2）酶标记的抗原或抗体，
称为"结合物"（conjugate）；
（3）酶反应的 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。 •对照和标准曲线
阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线
标记的免疫测定法： ng/ml 水平 (例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其 敏感度可达0.1ng /ml)
Often used methods
ELISA------酶联免疫吸附试验 Immunohistochemistry --------免疫组织化学 FACS------流式细胞术 Western Blotting-------免疫印迹技术
1. ELISA(酶联免疫吸附试验 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
RIA (radioimmunoassay, Berson&Yalow， 1960)
IRMA(immunoradiovelric assay, Miles&Hiles, 1968)
E(L)I(S)A (Engvall&Perlmann, van Weemen and Schuurs , 1971)
Specificity 特异性
Reversibility可逆性
Ag+Ab→Ag·Ab
解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。 在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。
Ratio最适比例
Sensitivity 敏感性
化学比色法： mg/ml
酶反应测定法： 5-10μg/ml (免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿)
待测样品的合理稀释
•不同类型的检测方法
2. Immunohistochemistry (免疫组化)
原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶） 用途：组织或细胞内抗原的定性和定位
流程：
Copyright ©2019 American Association for Cancer Research
Lequin, R. M. Clin Chem 2019;51:2415-2418 Copyright ©2019 American Association for Clinical Chemistry
ELISA
•基础: 抗原或抗体的固相化 抗原或抗体的酶标记
•用途：目标蛋白的定性或定量分析
•三个必要试剂：
•Animal experiment
I. Antigen-Antibody Reaction
非非共共价价键键结合结合 抗体的互补决定区 (CDRs)
抗原决定簇(antigenic determinant) 又称表位 (epitope)
Complementarity-determining regions (CDRs):
CDR1 CDR2
CDR1
CDR2 CDR3
CDR3
H
FR1
CDR1 FR2 CDR2 FR3
CDR3
FR4
L
CDR: Complementarity Determining Region FR: Framework Region
Antigenic Determinant
Features of Ag-Ab Reaction
•Ag-Ab reation:
ELISA, Immunohistochemistry, FACS, Western blot, Hybridoma & monoclonal antibody
•Cell function: 3H－TdR proliferation MTT CFSE Cytotoxicity 51Cr
Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1–/– but not TNFR1–/–/R2–/– mice. A to F, TNFR1–/– mice or TNFR1–/–/R2–/– mice were injected s.c. with 5 x 106 of J-mTNF10 cells. Ten days after tumor cell challenge, tissue sections of the injection site were stained for Mac-1+ (A and B), Gr-1+ (C and D), and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sections were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.
Estimates of the number of articles published per 5-year period from 1960 to 2019
Figure. Estimates of the number of articles published per 5-year period from 1960 to 2019. The search was done in February 2019 in PubMed/National Library of Medicine, NIH, with the search terms: enzymeimmunoassay, enzyme-linked immunosorbent assay (EIA/ELISA combined), and RIA. (Ordinate), number of articles in which the keywords are quoted. (Abscissa), 5-year periods from 1960 to 2019. , combined EIA/ELISA; , RIA. [Note: I do not pretend that the numbers in this figure are precise; the trends, however, are evident.]
即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;
（2）酶标记的抗原或抗体，
称为"结合物"（conjugate）；
（3）酶反应的 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。 •对照和标准曲线
阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线
标记的免疫测定法： ng/ml 水平 (例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其 敏感度可达0.1ng /ml)
Often used methods
ELISA------酶联免疫吸附试验 Immunohistochemistry --------免疫组织化学 FACS------流式细胞术 Western Blotting-------免疫印迹技术
1. ELISA(酶联免疫吸附试验 Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
RIA (radioimmunoassay, Berson&Yalow， 1960)
IRMA(immunoradiovelric assay, Miles&Hiles, 1968)
E(L)I(S)A (Engvall&Perlmann, van Weemen and Schuurs , 1971)
Specificity 特异性
Reversibility可逆性
Ag+Ab→Ag·Ab
解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。 在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。
Ratio最适比例
Sensitivity 敏感性
化学比色法： mg/ml
酶反应测定法： 5-10μg/ml (免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿)
待测样品的合理稀释
•不同类型的检测方法
2. Immunohistochemistry (免疫组化)
原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶） 用途：组织或细胞内抗原的定性和定位
流程：
Copyright ©2019 American Association for Cancer Research
Lequin, R. M. Clin Chem 2019;51:2415-2418 Copyright ©2019 American Association for Clinical Chemistry
ELISA
•基础: 抗原或抗体的固相化 抗原或抗体的酶标记
•用途：目标蛋白的定性或定量分析
•三个必要试剂：
•Animal experiment
I. Antigen-Antibody Reaction
非非共共价价键键结合结合 抗体的互补决定区 (CDRs)
抗原决定簇(antigenic determinant) 又称表位 (epitope)
Complementarity-determining regions (CDRs):
CDR1 CDR2
CDR1
CDR2 CDR3
CDR3
H
FR1
CDR1 FR2 CDR2 FR3
CDR3
FR4
L
CDR: Complementarity Determining Region FR: Framework Region
Antigenic Determinant
Features of Ag-Ab Reaction
•Ag-Ab reation:
ELISA, Immunohistochemistry, FACS, Western blot, Hybridoma & monoclonal antibody
•Cell function: 3H－TdR proliferation MTT CFSE Cytotoxicity 51Cr
Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1–/– but not TNFR1–/–/R2–/– mice. A to F, TNFR1–/– mice or TNFR1–/–/R2–/– mice were injected s.c. with 5 x 106 of J-mTNF10 cells. Ten days after tumor cell challenge, tissue sections of the injection site were stained for Mac-1+ (A and B), Gr-1+ (C and D), and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sections were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.
Estimates of the number of articles published per 5-year period from 1960 to 2019
Figure. Estimates of the number of articles published per 5-year period from 1960 to 2019. The search was done in February 2019 in PubMed/National Library of Medicine, NIH, with the search terms: enzymeimmunoassay, enzyme-linked immunosorbent assay (EIA/ELISA combined), and RIA. (Ordinate), number of articles in which the keywords are quoted. (Abscissa), 5-year periods from 1960 to 2019. , combined EIA/ELISA; , RIA. [Note: I do not pretend that the numbers in this figure are precise; the trends, however, are evident.]