分枝杆菌 微生物学检验

分枝杆菌

1. 分枝杆菌属(Mycobacterium)：

（1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜；

（2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌；

（3）营养要求较高，常用罗琴培养基；

（4）生长缓慢，2~8周后方可见菌落；

（5）G+C mol%为62%~70%；

（6）由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。

2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌

3. 分枝杆菌属分类

（1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌

（2）非典型分枝杆菌：

（3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌

4. 结核分枝杆菌

（1）临床意义

A. 本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁殖导致结核发生；

B. 引起结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所差异，全球约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称；

C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。

D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引起相应的结核病

（2）致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质D：诱发IV型超敏反应；硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质；

致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引起Ⅳ型超敏反应。（3）结核结节的形成：

A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反应，是细胞免疫和IV型变态反应平衡的结果；

B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。3~6周后，细胞变形，IV型变态反应产生；

C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死；

（4）Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反应：

有毒结核分枝杆菌被初次接种豚鼠10－14天，局部产生小节，形成肿块→坏死溃疡侵入附近淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。说明初次感染，机体无免疫力和超敏反应。

在8~12周之前先动物接种减毒小量结核分枝杆菌，再次接种结核分枝杆菌后局部反应提早出现，2~3天内红肿硬结溃疡痊愈。说明再次感染，机体有免疫力和超敏反应。

（5）微生物学检验

标本采集: 根据病变部位不同而定(晨痰、支气管洗液、清晨的中后段尿)

运送: 消毒容器

直接检查: 萋-尼抗酸染色(热)、Kinyoum染色(冷)，金-胺O染色

消化: 4%NaOH 37℃15~30分钟；胰酶-新洁尔灭法；4%硫酸法（尿标本）

培养分离：罗琴培养基

鉴定: 烟酸、硝酸盐还原、触酶

药物敏感试验

（6）直接涂片染色镜检：痰厚涂片，齐-尼抗酸染色后，至少观察100个视野。结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”。可用计数法排除其他分支杆菌。

（7）结核分枝杆菌形态特征：①细长、略弯曲杆菌，牛型结核分枝杆菌稍短；②排列成团、成堆；；③抗酸染色阳性，治疗后菌体呈非抗酸性G+颗粒，称much颗粒（L型变异）；

④金胺“O”染色菌体呈黄色荧光；

（8）分离培养：

标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长37℃，5％~10％CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核杆菌。

鉴定：(1)PCR反向膜探针杂交EHSA法(PCR杂交梳)；

(2)DNA探针；

(3)16s rRNA基因序列测定；

(4)高效液相色谱(HPLC)检测；

（9）培养特性：

A. 最适温度35~37℃，最适pH6.4~6.8；

B. 专性需氧，在液体培养基上形成菌膜，有毒株呈索状生长；

C. 营养要求高，专嗜甘油为碳源，常用罗琴培养基(鸡蛋、甘油、枸橼酸钠、天门冬酸、马铃薯粉、孔雀绿、钾镁离子)；

D. 繁殖慢，一代需要18小时；

E. 菜花样菌落，不规则凸起、不透明、粗糙，牛型结核分枝杆菌为光滑型；

（10）生化反应：糖类发酵(-) 热触酶(-) Tween水解(-)

热触酶(-) 热磷酸酶(-)，为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定试验，后者阳性

烟酸试验(+) 硝酸盐还原(+) 中性红(+)

烟酰胺酶试验(+) 脲酶试验(+)

牛型分枝杆菌均为阴性

（11）结核分枝杆菌鉴别试验

（12）结核分枝杆菌抵抗力：

温度：菌悬液80℃5min、痰标本煮沸5min完全杀死细菌

光线：对紫外线敏感

干燥：对干燥或干热抵抗力强，干燥痰中可存活数周

化学因素：75%乙醇5min，石炭酸、来苏儿、甲醛敏感

（13）分枝杆菌属快速鉴定程序：

（14）结核分枝杆菌快速鉴定技术

A. 快速分离鉴定：采用放射性C14棕榈酸的7H12培养液，细菌生长后生成C14O2，能自动显示测定结果，有Bactec 460系统、BacT/Alert等

B. 基因检测

C. 核酸探针

D. PCR：注意假阳性的存在

E. 核酸指印技术

（15）结核菌素试验和卡介苗：

结核病是病原体和宿主相互作用，由细胞免疫介导的免疫病理反应和组织损伤的结果。流行病学调查使用5U的OT和PPD，若1TU呈强阳性，提示有活动性的结核。

5. 麻风分枝杆菌(M.leprae)

（1）抗酸染色阳性, 短而粗, 呈束状或团状排列, 胞内寄生,胞质呈泡沫状称麻风细胞。（2）迄今尚不能人工培养, 只能动物接种(犰狳), 也可用小鼠足垫接种, 增代时间约20~30天。

（3）麻风病：顽固性感染；瘤型：侵犯皮肤及各脏器；结核样型：自限型；界限类综合征；（4）微生物学检验：

直接镜检:组织刮片

组织病理学检查