分枝杆菌 微生物学检验
结核分枝杆菌、厌氧菌及其它微生物的检测
最终鉴定需要进行生化反应及终末代谢产物等检 查。
生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验 硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂 酶试验、明胶液化试验、硫化氢试验等——厌氧 API条。
目前用于厌氧菌快速鉴定还有自动微生物鉴定系 统等。
实验内容
1、记录抗酸染色步骤。 2、油镜下观察抗酸杆菌涂片，并记
厌氧菌的分离与鉴定
（三）标本接种
标本接种3个血琼脂平板，分别置于有氧、 无氧和含5-10%CO2的环境中培养。若只 要求检测厌氧菌，只需接种1个厌氧血琼 脂平板。
厌氧菌的分离与鉴定
（四）耐氧试验
当厌氧血平板上有细菌生长时，为了确 定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。挑 取菌落分别转种2块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板，然后将平板分别放 置在需氧、厌氧和CO2环境中培养。
荧光染色结果报告
—：观察70个视野未发现抗酸杆菌； ±：70个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：50个视野内发现2-18条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现4-36条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现36条以上抗酸杆菌。
厌氧菌的分离与鉴定
厌氧菌标本的采集 涂片与染色 标本接种 耐氧试验 鉴定试验
干后油镜下观察结果。
抗酸染色结果观察
油镜下观察涂片，在淡蓝色背景下可见染成红 色细长或分枝状杆菌，此为抗酸染色阳性细菌 。
抗酸染色结果报告
—：观察300个视野未发现抗酸杆菌； ±：300个视野内发现1-2条抗酸杆菌； 1+：100个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 2+：10个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 3+：每个视野内发现1-9条抗酸杆菌； 4+：每个视野内发现9条以上抗酸杆菌。
实验室检验项目的分类
实验室检验项目的分类
实验室检验是临床诊断过程中必不可少的一部分。
实验室检验的项目
很多，按照其检验内容和目的，可分为以下几类：
1. 临床生化检验：主要检测患者的生理、代谢功能和营养状态等方面
的指标，如血浆蛋白、血压、血糖、脂肪酸等。
2. 体液检验：主要检测人体各种体液的化学、生理、免疫学等方面的
指标，如脑脊液、胸腔积液、尿液等。
3. 免疫学检验：主要检测患者的免疫状态和免疫功能，如人类免疫缺
陷病毒(HIV)检测、肝炎病毒检测等。
4. 微生物学检验：主要用于细菌、真菌、病毒等病原体的检测和鉴定，包括细菌药敏试验、肺结核分枝杆菌检测等。
5. 分子生物学检验：主要检测人体基因、DNA、RNA等分子水平上的信息，如PCR检测、基因突变检测等。
以上五类实验室检验项目是临床医学中常用的检测分类。
在医生选择
检测项目时，应根据不同患者和不同疾病发展的特点和需要，选择相
应的检测项目，以便更快、更准确地进行病情诊断和治疗。
此外，在进行实验室检验时，应确保检验方法、设备和材料的质量和安全性，并保护患者的隐私和个人信息，提高医学检验的可靠性和准确性。
微生物学--细菌检验基本技术
• 常用的指示剂：酚红、中性红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、 甲基红等
一、培养基
（二）培养基分类
1．按成分分类
• 合成培养基：是人工合成，组分明确，都是无机盐和化学 纯物质组成的培养基 • 天然培养基：也称复合培养基。是指含有化学成分不完全 明了或各批物质的成分很难一致的天然物质所组成的培养基， 如蛋白胨、牛肉膏、肉浸液、鸡蛋、马铃薯等。细菌检验常 用
一、培养基
6．灭菌 • 高压蒸汽灭菌
• 无糖：103．4kPa
121．3℃维持
15~20min
• 有糖： 68．95kPa 115℃ 维持
15min
• 间歇蒸汽灭菌法：血清、牛乳、鸡蛋 • 血清凝固器灭菌
一、培养基
7．质量检验 • 无菌试验：将制好的培养基在35℃温箱培养过夜，判定是否 灭菌合格 • 效果检查：按不同的培养要求，接种相应菌种，观察细菌的 生长、菌落形态、色素、溶血及生化反应等特征，判断培养基 是否符合要求
（2）结果 抗酸性细菌和非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
三、细菌染色标本的检查
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
三、细菌染色标本的检查
3．其他染色方法
（1）鞭毛染色 （2）荚膜染色
第二节 细菌的培养与分离技术
重点提示
• 培养基的主要成分及作用 • 培养基的种类 • 培养基制备的基本程序 • 细菌接种与培养方法 • 细菌在培养基中的生长现象
2020/2/28
7
常用诊断流程
• 表解法 区别比较复杂细菌，将各种细菌及其多 种
特性列成矩阵表格，使相互区别点十分明显，便于分析 比较
•
肠杆菌科初步分属
微生物第章 分枝杆菌属
微生物第章：分枝杆菌属一、概述分枝杆菌属（Bacillus）是革兰氏阳性的芽孢杆菌科中最常见的属之一。
其名称来源于其在培养基上形成的分枝的菌体形态。
该属菌体大小相对较大，形态多样，包括直形、杆形、梭形或球形等不同类型。
分枝杆菌属包括很多种类的细菌，一些种类在自然环境中很常见，有着重要的生态、工业和医学应用价值。
二、生态学和鉴定分枝杆菌属中的细菌生活在许多不同的环境中，包括土壤、水、植物、食品和动物的肠道中。
细菌在自然环境中存在着极为广泛的分布，在枯萎的植物、渣滓、泥炭、海水和河流等地方都可以发现其存在。
在实验室条件下，分枝杆菌属可以通过形态特征、代谢特性和生长特点等鉴定方法进行分离和鉴定。
最常用的方法是通过对分枝杆菌在特定培养基上的生长型态观察和菌落形态分析来确定其种属。
三、病原学分枝杆菌属在人类和动物中可以引起多种疾病，包括但不限于食物中毒、牲畜疾病和人类疾病。
尽管其中很多细菌是无害的或有益的，但某些菌株却可以对人类或动物健康构成威胁。
常见的分枝杆菌病原体包括：芽孢杆菌（B. anthracis）, 糖原芽胞杆菌（B. cereus），乳酸吸收性芽胞杆菌 (B. coagulans) 和枯草杆菌（B. subtilis）等。
分枝杆菌的病原性与其产生的细胞外毒素和内毒素有关，而这些毒素的分泌与生长环境和条件有很大关系。
四、工业应用除了在疾病治疗上的作用外，分枝杆菌属在工业生产中还有广泛的应用。
例如，在饮食加工业中，分枝杆菌可以用于制造豆腐、酱油等食品。
同时，分枝杆菌的一些菌株也可以进行微生物发酵生产出某些化合物，如抗生素、植酸酶、纤维蛋白溶酶等。
这些化合物在医药和普通日常生活中也被广泛使用。
五、分枝杆菌属在自然环境、医学、动物和食品加工业、以及其他工业领域都存在着广泛的应用和研究价值。
随着科学技术的发展和研究范围不断扩大，分枝杆菌属的多样性和作用将会得到更深入的了解和研究。
实验六 分枝杆菌属的鉴定
临床微生物学教研室
实验步骤及注意事项
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
石碳酸 复红 3%盐 酸酒精 吕氏 美兰
加热至出现蒸汽， 勿干，持续5min
脱色干净
复染充分 1 min
临床微生物学教研室
约3 min
临床微生物学教研室
初染: 在加热条件下，细胞壁通透性增加，细
菌中分枝菌酸与石碳酸复红牢固结合
脱色: 分枝菌酸复合物抵抗盐酸酒精脱色作用 复染: 组织或杂菌被吕氏美兰复染，背景呈蓝
色,结核分枝杆菌仍保持红色
临床微生物学教研室
实验步骤
1.涂片: 痰标本取脓痰部分或离心制成厚膜涂片（10×20 mm)，干燥固定 2.染色：
肉眼可见的菌落。
菌落:菜花样、面包屑样
临床微生物学教பைடு நூலகம்室
固体培养基上：菌落 为干燥、坚硬、表面 呈颗粒状、乳酪色或 黄色，形似菜花样， 为粗糙型。“碎面包 屑样”
液体培养内：表面生 长，形成纹状菌膜
临床微生物学教研室
录像学习 结核分枝杆菌培养与诊断方法新进展（了解）
思考题 1.分枝杆菌培养标本的前处理方法？ 2.分枝杆菌快速培养系统的原理？
3+ ：1-9条/每个视野
分枝杆菌
32
2、分离培养
（3）接种培养
取0.1ml处理的各种标本悬液和沉淀物，接种固体培养基 35-37℃
5%-10%CO2培养 一周内每天观察，以后每周观察一次，直到8周 根据生长时间、菌落形态、产生的色素等特点加以判定 报告方式：培养阳性 （斜面上20个菌落以下，报菌落数） 培养阴性 必须观察8周
（多用于尿标本的前处理）
胰酶-新洁尔灭：1g/L胰酶消化后，再用0.3%新洁尔灭处理5min以液化
和杀灭杂菌
NALC-2%NaOH（N-乙酰-L-半胱氨酸，2%氢氧化钠 ）适用各种标本处理
31
2、分离培养
（2）培养基选择 鸡蛋为主的培养基 L-J培养基 曲氏 小川 琼脂为基础的培养基 米氏7H10和7H11 液体培养基 米氏7H9和吐温白蛋白肉汤，主要用 与药敏试验
34
标本 涂片检查 分离培养 处理过的标本 或无污染标本
核酸检测
抗体检测
直接涂片
5
结核分枝杆菌扫描电镜照片
L-型结核分枝杆菌扫描电镜照片
Ziehl-Neelsen 抗酸染色（痰直接涂片）
Ziehl-Neelsen 抗酸染色（纯培养）
6
金胺“O”染色，荧光显微镜下菌体发出黄绿色或橙黄色荧光
7
2、培养特性
专性需氧，8-12%CO2刺激生长，最适温度 35-37℃，
PH6.5-6.8，需要一定的湿度 生长缓慢， 18～24h分裂一代，在固体培养基上2-4周才 能长出菌落。菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄 色，表面粗糙，形似菜花样 液体培养基生长较快，多表面生长，形成菌膜，易碎沉于 管底。有毒力菌株在培养液中呈索状生长 营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及 含某些无机盐类的特殊培养基（如罗氏培养基）上才能生 长
分枝杆菌属及检验
• 全球性卫生问题
– 是艾滋病高发区人群的首要死因
• 世界防治结核病日
– 3月24日
结核分枝杆菌 －－形态染色
• 细长略弯，丝状或分 枝生长
• 无芽孢，无鞭毛，无 荚膜,无菌毛
• 革兰染色阳性，不易 着色
• 抗酸染色阳性,菌体被 染成红色
• 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～ 4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的 细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特 别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层
※液体培养基：形成菌膜， 有毒株呈索状生长
• 初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏 （Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、 甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑
制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质
生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般 2～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中
教学大纲
• 掌握内容
– 结核分枝杆菌主要生物学性状；致病物质及 致病机制；结核菌素试验原理及应用；微生 物学检查法
• 了解内容
– 麻风分枝杆菌的形态染色特性、致病性及微 生物学检查法
• 全世界有1/3人口，19亿人已感染结核分枝杆 菌，15岁以下儿童感染者达1.8亿，每秒种就有一 人感染，全球有2 000万活动性患者，新发病例 1 000万人，每年有300万人死于结核，死于结核的 人数超过AIDS疾病、腹泻及热带病死亡人数的总 和，是传染病死亡最多的。近年来AIDS的发病率 上升，伴随结核病上升。我国解放前结核严重流 行，发病率大于1%，有十痨九死之称，建国后人 民生活水平提高，卫生条件的改善，抗痨药物的 发现，特别是积极开展防痨工作，接种BCG，发 病率和死亡率大大降低，但近年来有抬头趋势。
分枝杆菌属及检验考点总结
分枝杆菌属及检验考点总结一、结核分枝杆菌引起人和动物结核病的病原菌。
目前已知在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。
（一）生物学特性1.形态与染色G+，细长或略带弯曲的杆菌，在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。
抗酸菌。
既往在组织中曾发现革兰阳性的非抗酸颗粒，接种动物可产生典型的结核病变，后被称为Much颗粒。
2.培养特性◆专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%～10%C02环境中可刺激其生长。
需适当的湿度。
本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18h一代。
◆固体培养基：2～6周才能长出菌落，呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。
◆液体培养基中生长较快，多为表面生长，形成菌膜，且干燥易碎而沉于管底。
有毒力菌株在液体培养基中可呈索状生长，无毒株则无此现象。
◆营养要求较高，必须在血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长。
3.生化反应◆不发酵糖类，能产生过氧化氢酶，耐热触酶试验、聚山梨酯-80水解试验和耐热磷酸酶试验均为阴性，脲酶试验和中性红试验均为阳性。
◆人型结核分枝杆菌：烟酸试验、硝酸盐还原和烟酰胺酶试验均为阳性；牛型结核分枝杆菌均阴性。
4.抵抗力：对酒精敏感。
5.变异性：形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。
毒力变异：卡介苗（BCG）——将有毒的牛型结核分枝杆菌培养。
于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年传种230代，获得减毒菌株，再接种动物，不能致病而使其获得免疫力。
用于预防结核病。
（二）临床意义1.致病性◆不产生内毒素和外毒素，也无荚膜和侵袭性酶。
◆主要致病物质：脂质。
索状因子（破坏细胞，引起肉芽肿）、磷脂（形成结核结节）、硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）、蜡质D（引起迟发性过敏反应）。
◆主要通过呼吸道、消化道和受损伤的皮肤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起的肺结核最多见。
◆肺外感染可发生在脑、肾、肠及腹膜。
结核分枝杆菌属
This is an acid fast stain of Mycobacterium tuberculosis (MTB).
Note the red rods--hence the terminology for MTB in histologic sections or smears: acid fast bacilli.组织中结核分枝杆菌(抗酸染色)
分枝杆菌属
Mycobacterium
是一类细长略弯的杆菌，除二分裂繁殖外, 尚有分枝生长的趋势，故名分枝杆菌。
态生两靥之愁， 娇袭一身之病。
泪光点点， 娇喘微微。 闲静时如姣花照水， 行动时如弱柳扶风。
痨病
本属菌的共同特点：
1. 无芽胞，无鞭毛，某些菌株有荚膜，有分枝
生长趋势;
2. 细胞壁脂质含量高，主要为分枝菌酸； 3. 为G+b,但不易着色，抗酸染色阳性，故又名
M.tuberculosis
一．微生物特性
1. 形态染色
细长略弯的杆菌,有时可见分枝状，可出现多形态: 球形、串珠状或丝状。革兰染色阳性,但不易着色,抗酸 染色阳性,经齐-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色,菌体呈红色, 其他细菌和背景物质呈蓝色,用金胺O荧光染色→菌体呈 金黄色荧光。 本菌无鞭毛,无芽胞,有荚膜,但因制片破坏不易看到。
结核分枝杆菌金胺’O’染色后用荧光显微镜HP镜观察
Mycobacteria can also be stained with auramine and viewed with fluorescence microscopy, in which acid fast bacilli now appear as glowing yellow rods. This method is easier to use to screen for mycobacteria and is the method routinely used in sputum specimens sent to the laboratory.
结核分枝杆菌
白质是结核菌素。结核茵素与蜡质D结合，能引起较强 的迟发型变态反应。其他蛋白质可引起机体产生相应的 抗体，但无保护作用。2019/10/源自618四、微生物学检验
临床标本
涂片检查
分离培养
核酸检测 抗体检测
直接涂片 集菌涂片 处理标本或无污染标本
染色 抗酸.. 金胺O..
固体培养基---典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、 乳酪色或淡黄色，形似菜花样。
液体培养基---生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，有毒株可 呈索状生长（吐温干扰）。
2019/10/16
12
2019/10/16
菜花样菌落
13
生化反应
生化不活泼。不发酵糖类，多数菌株触酶阳性，热触酶 阴性，非结核分枝杆菌正好相反。 结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩－2－羧酸 肼(T2H)，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。
迅速生长菌 偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌
2019/10/16
29
重点：
结核分枝杆菌的细菌学特性 结核分枝杆菌的实验室检查
2019/10/16
30
染性免疫。TB菌的免疫原rRNA和变应原结核菌素诱发机体
产生由T淋巴细胞介导细胞免疫反应。
2019/10/16
16
致病物质
1.脂质－脂质占菌体干重的20～40%，占胞壁干重的60%。
①磷脂：能刺激单核细胞增生，并可抑制蛋白酶的分 解作用，使病灶形成干酷样坏死。
②索状因子：是分枝菌酸与海藻糖的复合物，具有破 坏细胞线粒体膜，毒害微粒体酶类，抑制中性粒细胞 游走和吞噬作用，引起慢性肉牙肿。具有该物质的TB 菌毒株，在液体培养基中能紧密粘成索状。
分枝杆菌医学
乳白色干燥不透明，表面呈颗粒结节，边缘不整。 3.抵抗力：含大量脂质，抵抗力强抗干燥、抗酸碱、抗化学消毒剂、对湿
热和紫外线敏感 4.变异性：结核杆菌易发生菌落形态（L型）、毒力（BCG）、免疫原性
和耐药性变异。
致病性
一.致病物质 1.脂质：磷脂能促进使单核细胞增生，引起结核结节和干酪样坏死；
涂片镜检的报告方式
半定量报告
未找到抗酸菌 可疑抗酸杆菌； 再送标本检测
石炭酸复红染色：抗 荧光染色：抗酸
酸杆菌（1000×）
杆菌
（450×）
0 1～2/300视野
0 1～2/70视野
1＋
1～9/100视野
2～18/50视野
2＋
1～9/10视野
4～36/10视野
3＋
1～9/视野
4～36/视野
4＋
>9/视野
的形成，也可经血到达多个脏器引起相应结核病。
2继发感染：多见于成人或较大的儿童，也以肺部多见，特点为病灶局限， 不易累积邻近淋巴结，病灶常钙化而愈，也可破溃成空洞。
三、免疫性
1.免疫机理：传染性免疫，主要是细胞免疫 2.免疫与变态反应：T细胞介导的结果
结核菌素试验（OT）： ①原理：细胞免疫或Ⅳ变态反应。 ②方法：用OT或PPD所做的皮内试验
涂片染色为抗酸阳性
第一节 结核分枝杆菌复合群
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）
简称结核杆菌 人和动物结核病的病原菌
三个时期： 1882年结核菌被发现之前，称之为“白色 瘟疫”
1882-1945年，发现结核杆菌到抗结核药物没有 广泛应用前。
15第十五章 分枝杆菌属检验
第十五章分枝杆菌属检验一、名词解释1.卡介苗（BCG）2.抗酸杆菌(acid-fast bacilli)3.结核菌素试验4.旧结核菌素(OT)5.索状因子二、选择题【A1型题】1.下列细菌中繁殖最慢的是A、大肠埃希菌B、丙型链球菌C、脑膜炎奈瑟菌D、结核分枝杆菌E、肺炎链球菌2.在液体培养基中形成菌膜生长的细菌是A、变形杆菌;B、布氏杆菌;C、肉毒梭菌;D、结核杆菌;E、产气荚膜杆菌3.结核分枝杆菌常用的培养基是A、沙保培养基B、罗氏培养基C、疱肉培养基D、巧克力色培养基E、亚碲酸钾培养基4.细胞壁含脂类最多的细菌是A、结核杆菌B、白喉棒状杆菌C、衣氏放线菌D、霍乱弧菌E、幽门螺杆菌5.与结核分枝杆菌抗酸性有关的成分是A、索状因子B、磷脂C、分枝菌酸D、蜡脂DE、硫酸脑苷脂6.关于结核分枝杆菌侵入机体的途径 ,不可能的是A、呼吸道B、消化道C、破损的皮肤D、泌尿道E、节肢动物的叮咬7.不以内毒素或外毒素为致病物质的细菌是A、白喉棒状杆菌B、炭疽芽胞杆菌C、结核分枝杆菌D、铜绿假单胞菌E、布鲁菌8.人体对结核分枝杆菌的免疫特点是A、体液免疫和细胞免疫同时存在B、以体液免疫为主C、有菌免疫D、不能通过人工主动免疫获得E、可引起I型超敏反应9.卡介苗是A、经甲醛处理后的人型结核分枝杆菌B、加热处理后的人型结核分枝杆菌C、发生了抗原变异的牛型结核分枝杆菌D、保持免疫原性 ,减毒的活的牛型结核分枝杆菌E、保持免疫原性 ,减毒的活的人型结核分枝杆菌10.卡介苗的接种对象主要是A、结核性脑膜炎患者B、结核菌素试验阳性者C、严重结核病人 , 结核菌素试验阴性患者D、新生儿和结核菌素试验阴性的儿童E、老年人11.有关结核菌素试验 ,下述错误的是A、属于皮肤迟发型超敏反应B、可检测机体对结核杆菌的免疫状况C、皮肤反应程度以局部红肿，硬结的直径为标准D、可检测机体细胞免疫功能E、12～18小时观察结果12. 结核菌素试验为阳性反应 ,下述叙述可能错误的是A、表明机体已感染过结核杆菌;B、表明机体接种卡介苗成功;C、表明机体对结核杆菌有一定的特异性免疫;D、表明机体对结核杆菌有迟发型超敏反应;E、表明机体对结核杆菌无免疫力13. 从痰中检出具有临床诊断意义的细菌是A、表皮葡萄球菌B、金黄色葡萄球菌C、甲型溶血型链球菌D、脑膜炎奈瑟菌E、结核分枝杆菌14.下列各细菌细胞壁中含脂量最多的是A、结核杆菌B、白喉杆菌C、放线菌D、霍乱弧菌E、幽门螺杆菌15.关于结合分枝杆菌生物学特性的叙述，错误的是A、专性需氧B、抗酸染色呈红色C、菌落表面粗糙呈菜花状D、耐酸碱E、耐煮沸，100℃，15分钟才死亡16.下列各成分与结核杆菌的致病性有关 ,除外的是A、结核杆菌索状因子B、磷脂C、结核杆菌内毒素D、蜡脂DE、硫酸脑苷脂17.关于结核菌素试验,下列错误的是A、可用来选择卡介苗接种对象B、检测机体细胞免疫和体液免疫状况C、作为婴幼儿结核病的辅助诊断D、红肿硬结直径大于0.5cm为阳性E、试验阳性说明已感染过结核杆菌18.下列最适合接种卡介苗的对象是A、长期低热和咳嗽，疑为肺结核的患儿B、OT试验阴性的麻疹患儿C、OT试验阳性儿童D、OT试验阴性儿童E、OT试验阴性的细胞免疫缺陷者19.一位18岁女学生就诊时主诉：近一个月来咳嗽，痰中时有血丝。
临床微生物学检验 第14章 分枝杆菌
三、微生物学检验
（二）标本采集 • 据感染部位的不同采集不同的标本 • 疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检 • 疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～
15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通 常需3～5份标本） • 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无 菌注射器抽取送检 • 其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌 试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取 凝块作涂片或接种培养
• WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起 列为人类的最主要杀手
二、临床意义
(一) 所致疾病 通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径
感染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结 核为多见 (二)免疫性
有菌免疫或称传染性免疫 细胞免疫 迟发型超敏反应
二、临床意义
(三) 变异 • 结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒
生化反应--烦琐、费时（ 4～8 周）,影响因素多
• 结核分枝杆菌不发酵糖类 • 能产生触酶 • 人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受
噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能 • 人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无
毒株则为阴性，并失去索状生长现象
噬菌体鉴定法（PhaB）
• Wilson 等于1997年建立的快速检测新技术 • 原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分
二、临床意义
• 迄今为止已发现NTM有150余种，其中约 1/3与人类疾病有关。 条件致病菌 毒力低于结核分枝杆菌 自然界中广泛存在 可以在人体某些部位定植
• 结核病和NTM感染的治疗不同
为何要关注NTM？
自然界中广泛存在，如水、土壤和气溶胶， 可导致免疫力低下的患者感染。 近年来，因手术器械、注射器具及医疗用 水等灭菌不合格、使用不规范造成患者手术 切口、注射部位NTM感染暴发事件。
临床微生物学检验技术
二、染色标本
· 细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、 排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类，因 此染色标本的检查在细菌的初步鉴定中应用最广，起 着非常重要的作用。
· （一）常用染料：酸性染料、碱性染料、复合染料。 · （二）常用的染色方法：革兰染色、抗酸染色、
荧光染色。
革兰染色
三、生化反应
（一）碳水化合物的代谢试验 1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶， 因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分 解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌 对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力， 可用以鉴定细菌种类。
方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中， 35℃孵育48~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示 剂，立即观察结果。
结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔 红色为弱阳性。
应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠 埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠 杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌 属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
3
革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结
晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革
兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形
成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。
2. 染色方法
1 标本涂片、干燥和固定。 2 染色：在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴， 室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。再滴 加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。滴加95%酒精数滴， 轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片， 使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的 酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。 再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。 3 标本染色后，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏油后 用油镜观察。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分枝杆菌
1. 分枝杆菌属(Mycobacterium)：
（1）一类细长、略带弯曲、呈分枝状生长细菌，革兰染色阳性，无芽胞、无荚膜；
（2）抗酸染色阳性，故又称抗酸杆菌；
（3）营养要求较高，常用罗琴培养基；
（4）生长缓慢，2~8周后方可见菌落；
（5）G+C mol%为62%~70%；
（6）由于结核分枝杆菌的耐药和AIDS发病率呈上升趋势，结核病成为危胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题。
2. 主要致病种类：人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌
3. 分枝杆菌属分类
（1）典型结核分枝杆菌：人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌
（2）非典型分枝杆菌：
（3）其他：副结核分枝杆菌、麻风杆菌、鼠麻风杆菌
4. 结核分枝杆菌
（1）临床意义
A. 本菌抵抗力强，可存活6~8月，随着漂浮于空气中的微滴核被吸入呼吸道，植入肺泡发育繁殖导致结核发生；
B. 引起结核病，随社区人群生活状况不同发病率有所差异，全球约有1/3人感染，有人类死亡之首和白色瘟疫之称；
C. 免疫性：有菌免疫或称传染性免疫，细胞免疫在抗感染免疫中起重要作用。
D. 细菌可经血、淋巴，在骨、关节、肾、脑膜等处引起相应的结核病
（2）致病物质荚膜：抗吞噬；细胞壁脂质；磷脂：刺激单核细胞增生、结核结节形成、干酪样坏死；分枝菌酸：抗酸性；索状因子：破坏线粒体膜；蜡质D：诱发IV型超敏反应；硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞；蛋白质；
致病机制：胞内寄生，细胞免疫为主，在巨噬细胞中存活，引起Ⅳ型超敏反应。
（3）结核结节的形成：
A. 是单核细胞参与的炎性肉芽肿反应，是细胞免疫和IV型变态反应平衡的结果；
B. 细菌的脂质抵抗吞噬，巨噬细胞被破坏，形成原发感染。
3~6周后，细胞变形，IV型变态反应产生；
C. 磷脂刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞融合成多核巨细胞。
抑制蛋白酶对组织溶解，产生干酪样坏死；
（4）Koch现象（郭霍现象）和IV型变态反应：
有毒结核分枝杆菌被初次接种豚鼠10－14天，局部产生小节，形成肿块→坏死溃疡侵入附近淋巴结→淋巴血流全身播散，经久不愈→动物死亡。
说明初次感染，机体无免疫力和超敏反应。
在8~12周之前先动物接种减毒小量结核分枝杆菌，再次接种结核分枝杆菌后局部反应提早出现，2~3天内红肿硬结溃疡痊愈。
说明再次感染，机体有免疫力和超敏反应。
（5）微生物学检验
标本采集: 根据病变部位不同而定(晨痰、支气管洗液、清晨的中后段尿)
运送: 消毒容器
直接检查: 萋-尼抗酸染色(热)、Kinyoum染色(冷)，金-胺O染色
消化: 4%NaOH 37℃15~30分钟；胰酶-新洁尔灭法；4%硫酸法（尿标本）
培养分离：罗琴培养基
鉴定: 烟酸、硝酸盐还原、触酶
药物敏感试验
（6）直接涂片染色镜检：痰厚涂片，齐-尼抗酸染色后，至少观察100个视野。
结核分枝杆菌抗酸染色后呈红色，其他细菌和细胞为蓝色。
结果应报告“找到或未找到抗酸性杆菌”，而不能报告“找到结核分枝杆菌”。
可用计数法排除其他分支杆菌。
（7）结核分枝杆菌形态特征：①细长、略弯曲杆菌，牛型结核分枝杆菌稍短；②排列成团、成堆；；③抗酸染色阳性，治疗后菌体呈非抗酸性G+颗粒，称much颗粒（L型变异）；
④金胺“O”染色菌体呈黄色荧光；
（8）分离培养：
标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长37℃，5％~10％CO2培养8周，如果出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，多数是结核杆菌。
鉴定：(1)PCR反向膜探针杂交EHSA法(PCR杂交梳)；
(2)DNA探针；
(3)16s rRNA基因序列测定；
(4)高效液相色谱(HPLC)检测；
（9）培养特性：
A. 最适温度35~37℃，最适pH6.4~6.8；
B. 专性需氧，在液体培养基上形成菌膜，有毒株呈索状生长；
C. 营养要求高，专嗜甘油为碳源，常用罗琴培养基(鸡蛋、甘油、枸橼酸钠、天门冬酸、马铃薯粉、孔雀绿、钾镁离子)；
D. 繁殖慢，一代需要18小时；
E. 菜花样菌落，不规则凸起、不透明、粗糙，牛型结核分枝杆菌为光滑型；
（10）生化反应：糖类发酵(-) 热触酶(-) Tween水解(-)
热触酶(-) 热磷酸酶(-)，为结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌鉴定试验，后者阳性
烟酸试验(+) 硝酸盐还原(+) 中性红(+)
烟酰胺酶试验(+) 脲酶试验(+)
牛型分枝杆菌均为阴性
（11）结核分枝杆菌鉴别试验
（12）结核分枝杆菌抵抗力：
温度：菌悬液80℃5min、痰标本煮沸5min完全杀死细菌
光线：对紫外线敏感
干燥：对干燥或干热抵抗力强，干燥痰中可存活数周
化学因素：75%乙醇5min，石炭酸、来苏儿、甲醛敏感
（13）分枝杆菌属快速鉴定程序：
（14）结核分枝杆菌快速鉴定技术
A. 快速分离鉴定：采用放射性C14棕榈酸的7H12培养液，细菌生长后生成C14O2，能自动显示测定结果，有Bactec 460系统、BacT/Alert等
B. 基因检测
C. 核酸探针
D. PCR：注意假阳性的存在
E. 核酸指印技术
（15）结核菌素试验和卡介苗：
结核病是病原体和宿主相互作用，由细胞免疫介导的免疫病理反应和组织损伤的结果。
流行病学调查使用5U的OT和PPD，若1TU呈强阳性，提示有活动性的结核。
5. 麻风分枝杆菌(M.leprae)
（1）抗酸染色阳性, 短而粗, 呈束状或团状排列, 胞内寄生,胞质呈泡沫状称麻风细胞。
（2）迄今尚不能人工培养, 只能动物接种(犰狳), 也可用小鼠足垫接种, 增代时间约20~30天。
（3）麻风病：顽固性感染；瘤型：侵犯皮肤及各脏器；结核样型：自限型；界限类综合征；（4）微生物学检验：
直接镜检:组织刮片
组织病理学检查。