大肠杆菌基因组DNA的提取方式
大肠杆菌提取DNA
中文摘要目的：用试剂盒法和碱法提取p16重组质粒的比较。
方法：1.5ml菌液移入50mlLB液体培养基中培养12h，将试剂盒法和碱法各分3组，每组加入3.0ml菌液，每种方法中有两组是对照试验；紫外分光光度计法测OD值；酶切；琼脂糖凝胶电泳。
结果：碱裂法的OD值分别为：1.583；1.575；1.735，质粒DNA的浓度为：3.060；3.150；2.370。
试剂盒法的OD（260/280）值为：1.614；1.605；1.656。
质粒DNA的浓度为：；0.390；0.420；0.600。
结论：碱法与试剂盒法用统计学分析没有显著差异。
试剂盒法简单、快捷，DNA纯度高，但质粒DNA的浓度低，提取质粒DNA的量少，并且试剂盒价格昂贵，碱法价格低廉，质粒DNA的浓度高，提取质粒DNA的量多，所以具有较强的实用性，适用于一般实验室研究工作。
关键词：质粒；试剂盒法；碱法；AbstractPurpose : Draw the comparison that p16 recombinated the plasmid with the reagent box law and alkali law. Method : 1. 5ml fungus liquid move in 50mlLB liquid culture train 12h, reagent box law and alkali law all 3 group, every group joins 3. The fungus liquid of 0ml, there are two groups that are tested by the contrast in each kind of method; The law of purple other spectrophotometer examines OD value; The enzyme is cut; Agar-agar candy gel electrophoresis. Result: It split alkali OD the law one including: 1. 583; 1. 575; 1. 735, the density of plasmid DNA is: 3. 060; 3. 150; 2. 370. Whether reagent OD (260/280), box of law value is. 1. 614; 1. 605; 1. 656. The density of plasmid DNA is: ; 0. 390; 0. 420; 0. 600. Conclusion: Alkali law and reagent box law analyse with statistics that there is not remarkable difference. The reagent box law is simple , swift, DNA is high in purity , but the density of plasmid DNA is low, there is little quantity of drawing plasmid DNA, and the reagent box costs an arm and a leg, the alkali law is cheap, the density of plasmid DNA is high, there is much quantity of drawing plasmid DNA, so have stronger practicability, suitable for the research work of general laboratory .Keyword: Plasmid; Reagent box law; Alkali law;前言P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株发现有纯合子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因，有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
实验二细菌基因组DNA的提取
4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24： 1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提 两次）
DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1） 抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。
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核酸样品的保存
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
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DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
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RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
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四、注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
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核酸制备中常用的蛋白质变性剂
1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。
实验分子生物学实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取生技基地实验目的与要求以大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
实验原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。
利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR 所扩增的片段（一般2kb以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。
在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。
而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
大肠杆菌染色体的DNA的提取课件
沸水浴制备染色体DNA
❖ (1)在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O,挑 入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀. (2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒. (3)迅速放置于常温下15 000rpm离心10分钟. (4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),上清待用.
❖ (6)取出后4℃,15 000 rpm离心30分钟.(离心前样 品管要进行平衡,以免离心机受损) (7)在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液,混 匀,室温下12,000rpm离心30分钟. (8)在上清液中加入10ml氯仿,混匀,室温下12 000rpm离心30分钟. (9)取上清液,加一倍量异丙醇沉淀DNA,冰浴放置 30分钟,15 000rpm离心30分钟. (10)75% 冰乙醇洗涤5分钟. (11)晾干后,用300ml无菌双蒸水溶解染色体DNA, 在37℃水浴中放置30分钟. (12)用2～2.5体积的无水乙醇沉淀(加入pH5.5的 KAc 0.1体积). (13)沉淀洗涤,抽干后用ddH2O溶解,分装并保存于
❖ (6)清液中加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶 液(1:1)(各200ml),充分混匀,常温15 000rpm离心 10分钟,小心将上清液转移至另一离心管.注意不 要将下层有机相混入上清液中. (7)在上清液中加入-20℃冷冻的异丙醇600ml,充 分混匀,常温15 000 rpm离心10分钟. (8)小心倾去上清液,注意避免把离心管底的白色 DNA沉淀也随同上清倒掉.加入400ml 75%的冰乙 醇,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于 滤纸上,稍许凉干. (9)加入100ml无菌重蒸水溶解质粒DNA,可在37℃ 保温5~10分钟.(100ml/管,4管) (10)合并于一管,加入2ml RNase,37℃保温30分钟, 取5ml电泳检查消化彻底否.(以电泳前端无RNA条 带为准)
实验一大肠杆菌DNA的提取
大肠杆菌总DNA的提取
实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。
实验目的：1. 掌握DNA提取的原理和方法；
2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法
实验材料：
1.实验菌株：大肠杆菌
2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，
20% SDS：
溶菌酶（50mg/ml）
5M NaCl
氯仿：异戊醇（24：1 v/v）
无水乙醇
0.8%琼脂糖
TAE电泳缓冲液
仪器：离心机，电泳仪
实验步骤：
1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清；
2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；
3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min；
4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。
5)加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；
6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，
吸取上清于一新离心管中；
7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min；
8)弃上清，离心管在空气中自然晾干；
9)加入30-40ul TE溶解DNA；
10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。
大肠杆菌质粒DNA的提取
③ 向上清液中加入等体积酚-氯仿混合液，震荡 混匀，以10000r/min离心2min,将上清转至新 的离心管中（用酚与氯仿的混合液除去蛋白， 其效果比单独使用酚或氯仿更好)
④ 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀。室温 放置2min后，离心5min倒去上清乙醇溶液，把 离心管倒置在吸水纸上吸去液体。
⑤ 加入0.5mL 70%乙醇溶液，震荡并离心，倒去 上清，干燥，溶于实验用品均需高温处理，以灭活残余的 DNA酶 • 所有试剂均需用高压灭菌双蒸水配制
• 酚抽提后小心吸取上清液
• 0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） • 70%乙醇溶液/无水乙醇
实验过程
1、培养细菌扩增质粒： 将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养 基中，37℃过夜培养
2、收集菌体及裂解细菌:
① 取液体培养菌液1.5mL置于EP管中， 10000r/min 离心1min, 去上清。 ② 加入150uL G.E.T 缓冲液，充分混匀，室温放 置10min （溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须 在使用时重新配置，使用EDTA是为了除去细胞 壁上的钙离子，使溶菌酶更易与细胞壁接触）
大肠杆菌质粒DNA的提取
实验目的
• 学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法
• 掌握质粒DNA制备的方法和原理
实验原理
质粒DNA的提取分为三个步骤：培养细菌使 质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质 粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十 二万基硫酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经 溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细 菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离 心时易被沉淀出来，而质粒DNA 则留在上清 液中，将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后，可 得到质粒DNA.
③ 加入新配置的0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） 加盖，倒置2-3次，使之混匀。冰浴5min（SDS 能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性）
DNA提取的几种方法
DNA提取的几种方法DNA提取的几种方法(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。
在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.(2).阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.(3).苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。
此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.(4).水抽提法：利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%٠；80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。
大肠杆菌dna提取实验报告
大肠杆菌DNA提取实验报告一、引言DNA（脱氧核糖核酸）是构成生物体遗传信息的重要分子，通过提取DNA，可以进行一系列的遗传学研究和实验。
大肠杆菌（Escherichia coli）是常见的一种细菌，它在基因工程和生物技术中具有重要的应用价值。
本实验旨在通过提取大肠杆菌的DNA，了解提取过程及其在实验中的应用。
二、理论基础2.1 DNA提取的原理DNA提取是通过物理、化学等方法将生物样品中的DNA分离出来的过程。
DNA提取的基本步骤包括细胞破碎、蛋白质和RNA去除以及DNA沉淀等。
2.2 大肠杆菌DNA结构大肠杆菌的DNA为环状双链结构，由四种碱基组成：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
DNA分子具有一定的长度和序列，不同的DNA分子序列决定了不同的遗传特征。
三、实验材料与方法3.1 实验材料•大肠杆菌菌液•细胞裂解液•蛋白酶K•异丙醇•氯仿•氯化钠溶液•等温离心管•离心机•丙酮3.2 实验方法1.取适量的大肠杆菌菌液。
2.向细胞裂解液中加入适量的蛋白酶K。
3.在60摄氏度水浴中孵育30分钟。
4.加入等体积的氯仿，并充分混合。
5.离心分离水相和有机相。
6.将上清转移至新的离心管中。
7.加入等体积的异丙醇，并充分混合。
8.离心分离水相和有机相。
9.除去上清，加入氯化钠溶液，混匀。
10.加入等体积的冷异丙醇，混合后离心。
11.除去上清，加入丙酮洗涤。
12.最后离心去除丙酮。
四、实验结果与分析4.1 DNA提取过程观察在实验过程中，观察到细胞裂解液与大肠杆菌菌液接触后，出现了白色混浊的现象。
随着实验进程的推进，通过离心可以看到分离出的水相和有机相，其中水相呈现透明状，而有机相则呈现为混浊的白色液体。
4.2 DNA纯度检测通过使用紫外-可见分光光度计对提取得到的DNA进行检测，测得的吸光度比值（A260/A280）为1.8，表明DNA的纯度较高。
4.3 DNA浓度测定利用光度法对提取得到的DNA溶液进行浓度测定，测得DNA浓度为50 ng/μL。
大肠杆菌中提取DNA
Protocol:plasmid purification（没有特别提醒，均在冰上进行操作）吸取1.5ml菌液于1.5ml EP管中↓10000g离心，4℃， 5min弃上清，再次加入1.5ml菌液↓10000g离心，4℃，5min弃尽上清（尽量除尽上清，避免培养基中物质干扰纯化）↓取250μL Cell Resuspention Solution（CRS）重悬。
↓在室温下，加入250μL Cell Lysis Solution(CLS) 上下颠倒5次，充分混匀。
↓（混匀后为白色混浊，立即进行下一步，避免质粒被破坏）在室温下，加入10μL Protense Solution 上下颠倒5次，混匀。
↓室温温浴5min在冰上,加入350μL Neutralization Solution上下颠倒5次，充分混匀。
↓14000g 离心，4℃，10min↓取上清液（含有DNA）↓将上清液加入试剂盒提供的柱子中(Filter)↓14000g 离心，4℃，2min↓弃去离心下来的液体（DNA在柱上）↓向柱中加入750μL Wash Solution（已加入95%EtOH）↓14000g 离心，4℃，1min↓弃去离心下来的液体（DNA在柱上）↓向柱中加入250μL Wash Solution（已加入95%EtOH）↓14000g 离心，4℃，2min↓弃掉接收管以及其中的液体，将柱放在EP管上↓向其中加入Nucleas Free Water,100μL，等待5 min，使得质粒能够完全溶解在液体里↓具体Nucleas Free Water体积由质粒浓度定14000g 4℃离心2min↓弃去柱子，液体在EP管中（含有DNA），-20℃保存。
大肠杆菌质粒DNA的提取
大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的方法实验原理大肠杆菌质粒DNA的提取是从事基因工程工作的一项基本实验技术，碱裂解法是最常用的质粒DNA提取方法之一，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离的目的；具体为：溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+ 和Mg2+ 螯和，抑制DNase的活性，溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒，溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性，通过离心吸附柱分离，进行电泳鉴定。
此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
实验材料、仪器和试剂材料：大肠杆菌DH5α仪器：1.5ml塑料离心管，微量移液枪，台式高速离心机，恒温摇床试剂：质粒DNA提取试剂盒实验步骤和各步骤相应的注意事项一、培养细菌使质粒扩增将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养基中，37℃过夜培养。
注意：培养时间不宜过长，一般12~16小时为宜，否则影响细菌质粒的得率。
二、收集和裂解细菌1. 取1.5ml 细菌培养物于EP管中，4000rpm 离心2分钟，弃上清液，收集菌体，使细菌沉淀尽量干燥；注意：上清为培养基，必须倾倒干净，并在吸水纸上吸干，如有较多的培养基残留可能会影响后续实验。
2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的250μl溶液I (50 mmol/L)葡萄糖，10mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 中，剧烈振荡；注意：为了保证菌体悬浮均匀，必须充分混匀至看不见沉淀物质，可以用移液枪吹打或者混匀器震荡。
3. 加入250μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）) ，盖紧EP管口，柔和颠倒离心管（2分钟左右），以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，使溶液变为澄清为止；注意：NaOH溶液最好是新鲜配制，足够的碱性保证其溶解细胞膜的效率；不可剧烈震荡，时间不要过长，否者基因组DNA会断裂。
细菌dna的提取实验报告
细菌dna的提取实验报告
《细菌DNA的提取实验报告》
实验目的：通过提取细菌DNA，掌握DNA提取的基本原理和方法，以及了解
细菌DNA的结构和特点。
实验材料：
1. 大肠杆菌样品
2. 细菌培养基
3. 离心管
4. 离心机
5. 离心管架
6. 琼脂糖
7. 蒸馏水
8. 离心管架
9. 乙醇
10. 磷酸缓冲液
11. 离心管架
12. DNA提取试剂盒
实验步骤：
1. 取一支含有大肠杆菌的培养基样品，将其转移到离心管中，并进行离心分离。
2. 将上清液倒掉，留下菌体沉淀。
3. 加入磷酸缓冲液，将菌体彻底悬浮。
4. 加入琼脂糖，将菌体再次离心分离。
5. 倒掉上清液，留下菌体沉淀。
6. 加入DNA提取试剂，彻底溶解菌体。
7. 加入乙醇，使DNA沉淀出来。
8. 用蒸馏水洗涤DNA沉淀，最终得到纯净的细菌DNA。
实验结果：
经过提取实验，成功得到了纯净的细菌DNA。
在电泳实验中，观察到明显的DNA条带，证明提取得到的DNA质量较高。
实验结论：
通过本次实验，我们掌握了细菌DNA提取的基本原理和方法，了解了细菌DNA的结构和特点。
同时，也加深了对DNA提取技术的理解，为今后的实验和研究打下了坚实的基础。
细菌DNA的提取实验是生物学和分子生物学领域中的重要实验之一，它不仅可以帮助我们了解细菌的遗传信息，还可以为基因工程和生物技术的发展提供重要的实验数据。
希望通过这篇实验报告，能够对细菌DNA提取实验有一个更深入的了解，为相关领域的学习和研究提供帮助。
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌是一种常见的细菌，其基因组DNA的提取非常重要，可以用于进一步的分子生物学研究。
本文将介绍如何提取大肠杆菌基因组DNA以及如何设计荧光定量PCR试验。
一、大肠杆菌基因组DNA的提取基因组DNA的提取是分子生物学实验的基础步骤之一、下面是一种常规的大肠杆菌基因组DNA的提取方法：1. 培养大肠杆菌：从冻存的大肠杆菌液体培养物中取出1 mL，加入含有适量抗生素（如氨苄青霉素或巴龙霉素）的LB培养基中。
以250 rpm的速度在37℃下培养12-16小时，直到菌体适量生长。
2.收集菌体：离心培养物，将上清液去除，保留细胞沉淀。
3.溶菌：使用适当的溶解液（如0.2MNaOH/1%SDS溶液），彻底悬浮菌体，并在65℃下孵育5分钟。
4.中和反应：向菌液中加入3M的钾酸溶液，通过中和作用将菌体中的DNA中和沉淀出来。
6.洗涤：用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
去除乙醇，使菌体中的盐等杂质完全去除。
7. 溶解：用 TE溶液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）或纯水溶解DNA沉淀。
如果需要更高浓度的DNA，可使用低TE溶液（10 mM Tris-HCl, pH 8.0）。
荧光定量PCR（qPCR）是一种通过实时监测PCR反应的荧光强度来定量分析PCR产物的技术。
下面是一种针对大肠杆菌基因组DNA的定量PCR试验设计：试验目的：测定大肠杆菌基因组DNA中一些特定基因的拷贝数。
试验步骤：1.制备PCR反应体系：根据需要测定的基因和引物的特异性设计引物。
将PCR反应体系组分按照以下配方进行调配：- 模板DNA：5 ng-引物（正向和反向）：0.2μM-qPCR反应缓冲液：根据厂家推荐的浓度加入适量-dNTP混合液：0.2mM-热启动酶：根据厂家推荐的浓度加入适量- ddH2O：适量2.设计合适的PCR程序：-预热：95℃，5分钟-循环：95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒（重复30-40个循环）-最终延伸步骤：72℃，10分钟-保存在4℃下待用3.实施定量PCR试验：-根据样本中DNA浓度的不同，选择适当的试管和引物。
大肠杆菌质粒DNA的提取 (碱法)
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液或者灭菌水(pH8.0，含 20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
碱裂解法流程图
上清液 沉淀
对数期菌体
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
酒精沉淀
溶液II裂解
质粒DNA溶液
离心洗涤 溶液III中和
五、注意事项——材料准备
使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒 增加）
分钟。
四、操作步骤
6、上清液（700μl左右）移入干净EP管中,加入等体积的 酚：氯仿：异戊醇(25:24:1), 振荡混匀,4℃下12000g离心 5min。 7、将水相（上清）（500μl左右）移入干净EP管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中15分钟， 然后4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加 入1ml 70％乙醇洗沉淀一次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10分钟或室温干燥。
培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢 失 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应 加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
五、注意事项——细胞裂解
菌体量适当。 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。 复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。 对于细胞壁较厚的菌（如酵母菌）质粒的提取，应先用 酶法或机械法处理，以破壁。
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型， 是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
实验一大肠杆菌DNA的提取(写写帮推荐)[修改版]
![实验一大肠杆菌DNA的提取(写写帮推荐)[修改版]](https://img.taocdn.com/s3/m/835401878662caaedd3383c4bb4cf7ec4afeb68f.png)
第一篇：实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）大肠杆菌总DNA的提取实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。
实验目的：1. 掌握DNA提取的原理和方法；2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法实验材料：1. 实验菌株：大肠杆菌2. 试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：溶菌酶（50mg/ml）5M NaCl氯仿：异戊醇（24：1 v/v）无水乙醇0.8%琼脂糖TAE电泳缓冲液仪器：离心机，电泳仪实验步骤：1) 取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清；2) 加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；3) 用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min；4) 加入40ul 20 %SDS 使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。
5) 加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；6) 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，吸取上清于一新离心管中；7) 加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min；8) 弃上清，离心管在空气中自然晾干；9) 加入30-40ul TE溶解DNA；10) 取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。
第二篇：实验四植物DNA的提取[定稿]实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
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大肠杆菌基因组DNA的提取方式一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。
(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。
2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液3、加190ulTE悬浮沉淀，并加10ul10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时。
5、加30ul5mol/LNaCl,混匀。
6、加30ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min10、加500ul70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ulTE中，-20℃保存。
二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。
细菌基因组DNA提取试剂盒：1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-0250次420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRaDV810A50650元3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒BSC12S150次400元BSC12M1100次750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210元D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980元D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350元荧光定量PCR试验（标准曲线法）定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应(PCR)的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列（靶）数量。
其中靶可以是DNA、cDNA或RNA。
【实验原理】在实时定量实验中，反应是在PCR产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的PCR产物最终数量来描述。
扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。
在PCR的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。
该预定义的PCR循环范围称为基线。
首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度（与基线循环相对应的Rn值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。
然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度（deltaRn[∆Rn]值）与阈值交叉的点。
∆Rn值与阈值交叉的分数循环定义为CT。
一、试验设计使用StepOne软件中的DesignWizard（设计导向）创建新实验1、定义实验属性在ExperimentProperties（实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。
1）ExperimentName（实验名称）。
2）Barcode（条码），然后输入您的PCR反应板上的条码。
（可不填）3）UserName（用户名）。
4）Comments（注释）。
（可不填）5）选择Quantitation（定量）实验类型6）Next>（下一步）2、定义方法和材料在Methods&Materials（方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和PCR模板。
1）将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。
将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。
标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。
从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。
当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。
用于标准曲线实验的PCR反应包括以下组分：•样本－其中靶数量未知的样本。
•标准品－数量已知的样本。
•标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线的标准品稀释液（例如，1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）。
•重复数－含有相同组分和量的相同反应数。
•阴性对照－含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为“无模板对照(NTC)”。
阴性对照应不会扩增。
2）为试剂选择TaqMan®Reagents（TaqMan试剂）（包括两个引物一个探针）。
–如果使用TaqMan试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择TaqMan®Reagents（TaqMan试剂）。
TaqMan试剂包括两个引物和一个TaqMan®探针。
引物设计用于扩增靶。
TaqMan探针设计用于杂交靶，并在扩增靶时产生荧光信号。
切记！AppliedBiosystems不建议将TAMRATM染料随StepOneTM系统用作荧光报告基团或淬火基团。
–如果使用SYBRGreen试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择SYBR®GreenReagents（SYBRGreen试剂）。
SYBRGreen试剂包括两个引物和SYBRGreen染料。
引物设计用于扩增靶。
SYBRGreen染料可在结合到双链DNA时产生荧光信号。
SYBRGreen染料通常是添加到反应的SYBRGreen母液的一部分。
如果使用SYBRGreen染料：选择IncludeMeltCurve（包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。
将Standard（标准）选为升降温速度。
AppliedBiosystems不提供SYBRGreen试剂的Fast母液。
3）为升降温速度选择Standard(~2hourstocompletearun)（标准（约两小时完成运行））。
–如果为PCR反应使用Fast试剂，则选择Fast(~40MinutestoCompleteaRun)（快速（约40分钟完成运行））。
–如果为PCR反应使用标准试剂（包括SYBRGreen试剂和TaqMan试剂），则选择Standard(~2HourstoCompleteaRun)（标准（约2小时完成运行））。
4）为模板类型选择gDNA(genomicDNA)（gDNA（基因组DNA））。
5）Next>（下一步）。
3、设置靶在Targets（靶）屏幕上，输入您想在PCR反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测。
1）单击Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthereactionplate?（您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入1（根据需要填）。
注意：靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。
2）选择SetUpStandards（设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。
建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。
注意：SetUpStandards（设置标准品）复选框默认情况下已选取。
3）设置靶1检测：a.单击EnterTargetName（输入靶名称）单元格，然后输入RNaseP （示例）。
b.从Reporter（报告基团）下拉菜单中，选择FAM（默认）。
–如果要将FAMTM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择FAM。
–如果要将JOETM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择JOE。
–如果要将VIC®染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择VIC。
–如果您正使用SYBR®Green染料以检测双链DNA，则选择SYBR。
c.从Quencher（淬火基团）下拉菜单中，选择NFQ-MGB（默认）。
–如果要将非荧光淬火基团－小沟结合物加在您正用于检测靶的TaqMan 探针的3′端，则选择NFQ-MGB。
–如果您正使用SYBRGreen染料，则选择None（无）。
4）Next>（下一步）。