机能实验学完整版ppt课件
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本实验通过对家兔行双侧去卵巢手术后 阴性对照组、尼古丁组和阳性对照组，采 用放射性配基结合分析法测定各组放射性， 通过各浓度组放射活性与阴性对照组比较 探讨尼古丁是否通过竞争结合ER途径显示 抗雌激素样作用,为进一步研究作用机制提 供理论依据。
4
技术路线
5
三.【实验内容】
实验步骤 观察指标 预期结果
21
（2） 方法创新
本实验采用相对简单、易于理解的放射 性配基结合分析法作为实验骨架技术。通 过控制单因素变量，绘制竞争性结合曲线 对比实验组和对照组数据结果，直观判断 实验结果。避免过于复杂误差较大的实验 设计方法。
22
（3） 实验结果临床意义的创新
进一步探究尼古丁对雌激素竞争性抑制 机制，加深人们尼古丁的认识，通过研究 尼古丁及其类似物对靶组织局部抗雌激素 作用的机制，为雌激素依赖性疾病提供新 的治疗策略。
组别
1（空白）
2
3
4
5
6
7
标准蛋白液 /ml
0.9%NaCl/ml
考马斯亮蓝染 液/ml
蛋白质浓度 （μg/ml）
A595nm
11
4)尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验
尼古丁反 应体系
阳性对 照体系
阴性对 照体系
加胞 浆液 及 3H-E2
16小时
加DCC， 混匀
冰浴、离心
FJ-2101G计 数放射活性
17
（1）受试物配制:
尼古丁溶于无水乙醇,配制成3×10 3mol/L 母液,置-20℃保存。
18
（2） 实验溶液的配制:
雌激素受体抽提缓冲液: Tris 10mmol/ L ,EDTA
1 mmol/ L ,用1 mol/ L HCl调pH至7.4 ,体积分数为 10 %的甘油,4 ℃保存,临用前每100 ml 缓冲液加
16
四.【实验材料】
1 受试物与主要试剂:
95％纯净的烟碱（尼古丁）; 6 ,7 - 3H 雌二醇(3H - E2 ) ,48 Ci/ mmol; 17 -β-雌二醇(estradiol ,E2 ); 2 ,5-二甲基恶唑(PPO); 1 ,4-双-〔2’- 15’-苯基恶唑〕-苯 (POPOP);
因此如何拮抗或减弱雌激素的作用以治疗 雌激素依赖性疾病成为研究热点，并具有重要 的临床意义。
2
尼古丁又叫烟碱，是一种吡啶族生物
碱，它可以通过呼吸道、鼻粘膜、皮肤迅 速吸收入人体，并通过尿液、胆汁、唾液、 胃液、汗液和乳汁排泄。
尼古丁作为烟中碱类的主要成分，具有 拮抗雌激素作用。
3
二.【设计思路】
点，联想二手烟中的主要成分尼古丁对于人 体的影响。本组成员通过查找各类相关文献，
发现与我们惯性思维所认为的致癌有毒的尼古丁 有差异，研究表明尼古丁不一定是可怕的致癌凶
手，其本身不引起肿瘤，相反，尼古丁在人体 中存在抗雌激素的作用。尼古丁对于由雌激素
诱导的疾病如子宫内膜异位症、子宫肌瘤及乳腺
纤维腺瘤等具有临床治疗意义。
15
(2)随着尼古丁浓度的升高,其与家兔子宫胞浆ER结 合的3H-E2没有明显降低。即尼古丁反应体系的 3H - E2特异结合指数(%)几乎不随尼古丁浓度的 改变而变化，而阳性对照E2反应体系中的特异性 结合指数(%)随E2浓度升高，明显降低。 说明，尼古丁可能与雌激素受体结合，但其 作用的配体位点与雌激素明显不同。两者之间不 存在竞争结合；尼古丁可能不与雌激素受体结合 ，而是通过其他未知途径干扰雌激素和雌激素受 体的结合过程。尼古丁各浓度组放射活性与阴性 对照组比较, 差异无统计学意义。
6
1 实验步骤 卵巢切除术
子宫雌激素受体( ER)抽提液的制备 测定子宫雌激素受体( ER)抽提液蛋白含量 尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验
统计学处理 7
1）卵巢切除术
1w 实验动物适应性饲养
双侧卵巢摘除术
1w 阴道脱落细胞学检查
处死
取出子宫剥离脂肪,冻存于液氮
8
2)子宫雌激素受体( ER)抽提液的制备
19
2 实验动物:
采用体重3.0-3.5公斤的新西兰种雌兔 （家兔）,去卵巢一周后取子宫,-80 ℃保存, 一周内测定。整个实验过程中,动物自由摄 食和饮水,室温20～23℃,相对湿度65%75% ,12h/12h 明暗周期。
20
五. 【创新性与可行性】
1 创新性
（1）立题创新
以根据现实生活中普遍存在的二手烟为立足
43ml巯基乙醇。 活性炭-葡聚糖(DCC)悬液: Tris 10 mmol/
L ,DextronT - 70 0.025 g/ L ,用1 moL/ L HCl 调pH 至8.0 ,4℃保存。临用时每100 ml 加入0.25 g 活性 炭,充分搅拌。
闪烁液:PPO 5.5g,POPOP 0.07g,溶于1L二甲苯。
尼古丁抗雌激素作用研究
医学检验1002班
设计参与者: 张志慧 魏冬梅 齐天琪 谷怡珊 冯智才
1
一. 【研究背景及立论依据】
雌激素是一类有广泛生物活性的甾体化
合物,它有促进和维持生殖器官和副性征的生理 作用,可应用临床治疗疾病。雌激素对不仅细胞 增殖起促进作用，还能诱导乳腺癌和子宫内膜 癌的发生及发展。
3H - E2 特异结合指数( %)
14
3 预期结果
(1)随着尼古丁浓度的升高,其与家兔子宫胞浆ER结 合的3H- E2有明显降低。且尼古丁反应体系的3H E2特异结合指数(%)与阳性对照E2反应体系中的变 化趋势趋于一致。说明，尼古丁可以竞争性结合 激素受体。尼古丁各浓度组放射活性与阴性对照 组比较, 差异无统计学意义。
冻存子宫快速剪碎
加入抽提缓冲液
匀浆
差速离心，去沉淀
上清液即为ER胞浆液
9
3)测定子宫雌激素受体（ER）抽提液的制备
每管按编号加入试剂 混匀 (见表一）
静置3分钟
以第1管为空白，于波长595nm 处比色，读取吸光度，
另取试管
作图
样品液
考马斯亮 蓝染液
静置3分钟， 595nm比色
分析
10
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 ——标准曲线测定表
12
5) 统计学处理
SAS12. 0软件
单因素方差分析 及Speaman相关分析
Origin软件
3H - E2特异性 结合指数—浓度图
13
受试物 E2
2
观
察
指
标
尼古丁
来自百度文库
蒸馏水
浓度(mol/ L)
10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12
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技术路线
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三.【实验内容】
实验步骤 观察指标 预期结果
21
（2） 方法创新
本实验采用相对简单、易于理解的放射 性配基结合分析法作为实验骨架技术。通 过控制单因素变量，绘制竞争性结合曲线 对比实验组和对照组数据结果，直观判断 实验结果。避免过于复杂误差较大的实验 设计方法。
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（3） 实验结果临床意义的创新
进一步探究尼古丁对雌激素竞争性抑制 机制，加深人们尼古丁的认识，通过研究 尼古丁及其类似物对靶组织局部抗雌激素 作用的机制，为雌激素依赖性疾病提供新 的治疗策略。
组别
1（空白）
2
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7
标准蛋白液 /ml
0.9%NaCl/ml
考马斯亮蓝染 液/ml
蛋白质浓度 （μg/ml）
A595nm
11
4)尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验
尼古丁反 应体系
阳性对 照体系
阴性对 照体系
加胞 浆液 及 3H-E2
16小时
加DCC， 混匀
冰浴、离心
FJ-2101G计 数放射活性
17
（1）受试物配制:
尼古丁溶于无水乙醇,配制成3×10 3mol/L 母液,置-20℃保存。
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（2） 实验溶液的配制:
雌激素受体抽提缓冲液: Tris 10mmol/ L ,EDTA
1 mmol/ L ,用1 mol/ L HCl调pH至7.4 ,体积分数为 10 %的甘油,4 ℃保存,临用前每100 ml 缓冲液加
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四.【实验材料】
1 受试物与主要试剂:
95％纯净的烟碱（尼古丁）; 6 ,7 - 3H 雌二醇(3H - E2 ) ,48 Ci/ mmol; 17 -β-雌二醇(estradiol ,E2 ); 2 ,5-二甲基恶唑(PPO); 1 ,4-双-〔2’- 15’-苯基恶唑〕-苯 (POPOP);
因此如何拮抗或减弱雌激素的作用以治疗 雌激素依赖性疾病成为研究热点，并具有重要 的临床意义。
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尼古丁又叫烟碱，是一种吡啶族生物
碱，它可以通过呼吸道、鼻粘膜、皮肤迅 速吸收入人体，并通过尿液、胆汁、唾液、 胃液、汗液和乳汁排泄。
尼古丁作为烟中碱类的主要成分，具有 拮抗雌激素作用。
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二.【设计思路】
点，联想二手烟中的主要成分尼古丁对于人 体的影响。本组成员通过查找各类相关文献，
发现与我们惯性思维所认为的致癌有毒的尼古丁 有差异，研究表明尼古丁不一定是可怕的致癌凶
手，其本身不引起肿瘤，相反，尼古丁在人体 中存在抗雌激素的作用。尼古丁对于由雌激素
诱导的疾病如子宫内膜异位症、子宫肌瘤及乳腺
纤维腺瘤等具有临床治疗意义。
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(2)随着尼古丁浓度的升高,其与家兔子宫胞浆ER结 合的3H-E2没有明显降低。即尼古丁反应体系的 3H - E2特异结合指数(%)几乎不随尼古丁浓度的 改变而变化，而阳性对照E2反应体系中的特异性 结合指数(%)随E2浓度升高，明显降低。 说明，尼古丁可能与雌激素受体结合，但其 作用的配体位点与雌激素明显不同。两者之间不 存在竞争结合；尼古丁可能不与雌激素受体结合 ，而是通过其他未知途径干扰雌激素和雌激素受 体的结合过程。尼古丁各浓度组放射活性与阴性 对照组比较, 差异无统计学意义。
6
1 实验步骤 卵巢切除术
子宫雌激素受体( ER)抽提液的制备 测定子宫雌激素受体( ER)抽提液蛋白含量 尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验
统计学处理 7
1）卵巢切除术
1w 实验动物适应性饲养
双侧卵巢摘除术
1w 阴道脱落细胞学检查
处死
取出子宫剥离脂肪,冻存于液氮
8
2)子宫雌激素受体( ER)抽提液的制备
19
2 实验动物:
采用体重3.0-3.5公斤的新西兰种雌兔 （家兔）,去卵巢一周后取子宫,-80 ℃保存, 一周内测定。整个实验过程中,动物自由摄 食和饮水,室温20～23℃,相对湿度65%75% ,12h/12h 明暗周期。
20
五. 【创新性与可行性】
1 创新性
（1）立题创新
以根据现实生活中普遍存在的二手烟为立足
43ml巯基乙醇。 活性炭-葡聚糖(DCC)悬液: Tris 10 mmol/
L ,DextronT - 70 0.025 g/ L ,用1 moL/ L HCl 调pH 至8.0 ,4℃保存。临用时每100 ml 加入0.25 g 活性 炭,充分搅拌。
闪烁液:PPO 5.5g,POPOP 0.07g,溶于1L二甲苯。
尼古丁抗雌激素作用研究
医学检验1002班
设计参与者: 张志慧 魏冬梅 齐天琪 谷怡珊 冯智才
1
一. 【研究背景及立论依据】
雌激素是一类有广泛生物活性的甾体化
合物,它有促进和维持生殖器官和副性征的生理 作用,可应用临床治疗疾病。雌激素对不仅细胞 增殖起促进作用，还能诱导乳腺癌和子宫内膜 癌的发生及发展。
3H - E2 特异结合指数( %)
14
3 预期结果
(1)随着尼古丁浓度的升高,其与家兔子宫胞浆ER结 合的3H- E2有明显降低。且尼古丁反应体系的3H E2特异结合指数(%)与阳性对照E2反应体系中的变 化趋势趋于一致。说明，尼古丁可以竞争性结合 激素受体。尼古丁各浓度组放射活性与阴性对照 组比较, 差异无统计学意义。
冻存子宫快速剪碎
加入抽提缓冲液
匀浆
差速离心，去沉淀
上清液即为ER胞浆液
9
3)测定子宫雌激素受体（ER）抽提液的制备
每管按编号加入试剂 混匀 (见表一）
静置3分钟
以第1管为空白，于波长595nm 处比色，读取吸光度，
另取试管
作图
样品液
考马斯亮 蓝染液
静置3分钟， 595nm比色
分析
10
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 ——标准曲线测定表
12
5) 统计学处理
SAS12. 0软件
单因素方差分析 及Speaman相关分析
Origin软件
3H - E2特异性 结合指数—浓度图
13
受试物 E2
2
观
察
指
标
尼古丁
来自百度文库
蒸馏水
浓度(mol/ L)
10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12