细胞电转染

细胞电转染

电转的简介 (1)

电穿孔转染的基本原理及过程 (1)

电穿孔转染条件的选择 (1)

1 电参数 (1)

2脉冲时程 (2)

3 脉冲次数 (2)

4 细胞因素 (3)

5 质粒因素 (3)

6 温度 (4)

7．缓冲液以及培养液的成 (4)

仪器常用键区介绍 (5)

Neon TM电转染一般流程 (7)

电转的简介

电穿孔转染，作为物理方法的一种，出现于20世纪80年代中。这种方法不仅能够将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。它是一种高效、简便的基因转移系统，具有其它转移方法无可比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，臻染率高，适用谱广等。尤其对目前一般认为难转染的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。

电穿孔转染的基本原理及过程

电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入胞核的技术。其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并与细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。一旦DNA扩散进入细胞，细胞膜上的小孔可

自动重新闭合。

电穿孔转染条件的选择

1 电参数

电场强度E与电压V有以下关系：V=E×d，在电穿孔实验中，d为两电极之间的距离，是一个定值，故本文所指的电场强度的选择即电压的选择。对于动物细胞

来说，电场强度通常选择1～1000V／cm，并遵循低电场长时程的原则。电场强度的大小对DNA摄入量的影响主要有：在阈电场强度Ec (Ec=Uc／1．5R)以下无R)以下无DNA摄入；适中的场强下DNA的摄入呈电场依赖型，随场强的升高而增大；高场强下，DNA的摄入进入平台期，与电场的大小无关。电场强度的大小对细胞存活率的影响主要有：在阈电场强度以下存活率无变化；在适中的场强下，存活率呈电场依赖型，随场强的升高而下降；存活率在高场强下降为0。因此，要保证较高的转染效率，必须综合考虑DNA摄入量以及存活率两个方面。不同的细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方式除了实验直接测定比较不同场强下(对悬浮细胞来说，取1～3倍的阈电场强度，对贴壁细胞来说可升至5倍)转染率的高低之外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50％左右的电场参数为较理想的参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。

2脉冲时程

时间常数为电容与电阻的乘积，是设定的电压呈指数衰减到37％的时间。电脉冲的时间长短对电转染效率有较大的影响，太长、太短都会使转染效率下降。最佳时间的确定主要取决于细胞的大小，细胞越大，穿透胞膜所需的脉冲时程越长。电转染真核细胞的脉冲时程一般控制在ms级(不小于1 ms)。电脉冲之前，DNA和细胞随机分布于电极之间；电脉冲早期，DNA和细胞向阳极运动；电脉冲后期DNA分子撞向细胞阴极面或末端，并且插入细胞外膜或者进一步进入细胞膜间隙，随后在孵育期间，DNA通过内膜渗透进入胞质。因此电压脉冲有双重效应，即驱使DNA快速向阳极运动以及向受体细胞表面渗透。电脉冲的时间太短，则不能使DNA分子有效进入细胞；而电脉冲时间过长，细胞局部过热可导致不可恢复的损伤，同时电泳所引起的细胞内外的物质进出(如Na+／K+浓度差的破坏)都可引起细胞存活率下降，转染效率的提高被抵消。真核细胞基因转染一般遵循低电场长时程的原则。长时程(一般20～60 ms)可使细胞上的穿孔更大，开放时间更长。此外，适当地延长时程也能降低电穿孔的阈电场值，加大电场依赖性吸收的斜率，提高平台期电场值的放大作用。

3 脉冲次数

脉冲次数的选择一般为1～10次，实验证明对于大多数细胞系较理想的脉冲次数为3～4次。第1次脉冲后，外加的电场开始在细胞膜上穿孔，第2 次脉冲后，

DNA在电泳力以及细胞膜蛋白运输的共同作用下转入细胞，当然脉冲也同样触发电渗透、扩散、内吞等运输方式。理论上，2次脉冲足以使DNA转入绝大多数细胞，再增加脉冲次数，虽仍有助于提高转染效率，但如果次数多于5次，导致细胞损伤直至死亡的负面效应便抵消了对转染效率的提升。两次脉冲之间一般有1 min的间隔时间(稍长也不影响结果)，在这段时间内，电穿孔的细胞可再生一些必需的细胞膜成分，以恢复部分功能，同时，细胞在这段恢复时期发生旋转(Brownian运动)，基本解除胞膜的同一位置被多次电击的危险。

4 细胞因素

用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内，传代后2 d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密度比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源的DNA。因此，处于对数期的细胞转染率和存活率都比衰老的细胞好。当细胞生长到A600为0.72～0.78时，可获得更高的转染效率，故收集细胞的时间十分重要。细胞悬液的密度一般为1×106／ml，当细胞生长密度>3×106／ml(A600>O．85)时，转染效率会骤然下降。原因除了细胞老化之外，细胞过密会使相邻细胞相互作用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一化。细胞体积越大对电击越敏感，所需的电场强度也就越小。

5 质粒因素

从质粒的浓度看，细胞密度为1×106／ml时，DNA用量在2～5ug／ml转染效率最高。转染率在一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但到达一个峰值后，随DNA用量增加而转染率逐渐下降。其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度，过量便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率的提高。从质粒的大小、构象、序列看，一般说来，转染效率随着质粒的碱基对数的增多而上升，同时，线状的DNA比环状DNA的转染效率更高，而且更容易进入核内整合到染色体上，得到稳定表达。所以在电转前一般选择合适的限制性内切酶，将质粒线性化，以期得到较高的转染效率。此外，如CMV、SV40等病毒启动子有助于基因在真核细胞内的高效表达。从质粒的纯度看，用高纯度的DNA才能提高电转的效率，且应注意以下几点：首先DNA／RNA应该超纯(A260／A280>1．8)，其次应不含内毒素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液，