专题三：成体干细胞(前言和间充质干细胞)

诱导分化—心肌细胞
1 体外分化实验
小鼠股骨中获得骨髓MSCs,经5氮 5 胞苷处理,大约30%的MSCs 出现形态学改变,分化为类心肌细胞, 胞苷 并可重复检测到自主起搏细胞。
（视频） 视频）
(1) 分化的MSCs表达出特异性的心房利钠肽 (ANP) 和脑利钠肽 利钠肽(ANP) 利钠肽 (ANP)和脑利钠肽 (BNP)基因 (BNP) 基因。表明分化的细胞含有类心肌收缩蛋白,完全不同于 基因 平滑肌细胞及骨骼肌细胞； (2) 电镜检查 电镜检查类心肌细胞的超微结构时可观察到:特征性的经闰 盘连接的肌节、中心核和心房颗粒； (3) 5氮胞苷处理2～5周后，分化的MSCs 电生理检测到至少有 2 分化的MSCs电生理检测到至少有2 分化的 MSCs电生理检测到至少有 种完全不同的动作电位： 种完全不同的动作电位
图4 第3代 hBMSCs CD29表达阳性×200 表达阳性× 代 表达阳性
图5 第3代 hBMSCs CD90表达阳性×200 表达阳性× 代 表达阳性
图6 第3代 hBMSCs CD166表达阳性×200 代 表达阳性× 表达阳性
图7 hBMSCs诱导后碱性磷酸酶染色 ×400 诱导后碱性磷酸酶染色
存在以下问题
随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能 力大幅度衰退； 制备过程不容易质控； 移植给异体可能引起免疫反应； 取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集， 即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。
干细胞可塑性质疑
自然界真的存在成年组织干细胞的“可塑性”？ 成体干细胞“可塑性”是实验设计不严谨上的失误抑 或一种主观判断错误所致？ 成体干细胞的“可塑性”与全能干细胞或胚胎干细胞 又有何关联？ 这些质疑的实质就是：所谓的成体干细胞的“可塑性” 缺乏科学依据；成体干细胞的“横向分化”是成年组 织中余存的胚胎原始干细胞所为，抑或与自发融合相 关。
讨论课总结
Ppt制作
主题鲜明，重点突出，图文一致 每张内容不宜过多
汇报语言仪态
方式丰富，交流互动
成体干细胞——adult stem cell
在个体的发育过程：
成体干细胞的概念
存在于成年个体的许多组织和器官，比如表皮和造 血系统，具有修复和再生的能力，已经分化组织中的 未分化细胞，能够自我更新并在特定条件下，成体干 细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化， 形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰 退的动态平衡。
成体干细胞的特性
（1）极少量，特定区域 （2）通常处于静息状态，分裂缓慢 （3）自我更新与分化需要特定的微环境
优点分析
获取相对容易 自体成体干细胞避免了移植排斥 理论上，成体干细胞致瘤风险很低 伦理学争议较少
检测方法
科学家尚未就成体干细胞的鉴定标准达成一 致。 经常被采用的鉴定方法包括： 1)体内示踪法 2)体外诱导分化
间充质干细胞生物学特性
形态特征 细胞表面标志
光学显微镜
扫描电镜
核质比高， 图1-8 核质比高，细胞器少的 细胞 ×25 000
核质比较低， 图1-9 核质比较低，细胞器丰 富的细胞 ×25 000
透射电镜
公认的骨髓MSCs表面标记： A:不表达分化相关的细胞标志如脂多糖受体CD34以及 白细胞表面抗原CD45等。 B:但表达CD44 、 CD54、 CD133 、CD105、 CD90等。
移植的方法
通过静脉注射移植。 通过椎管注射移植。 通过介入方法直接移植到病 变部位动脉血管。
常见成体干细胞
间充质干细胞 造血干细胞 神经干细胞 角膜缘干细胞 胰腺干细胞 皮肤干细胞 肠上皮干细胞 肝脏干细胞
间充质干细胞 ——mesenchymal stem cell
来源于发育早期的中胚层和外胚层。 MSC最初在骨髓中发现。 具有多向分化潜能，理想的种子细胞。
间充质干细胞诱导分化
诱导分化—成骨细胞
在MSCs培养体系中加入地塞米松、β-磷酸甘油和抗坏血酸等 地塞米松、 磷酸甘油和抗坏血酸 地塞米松 单独或联合诱导,发现培养的MSCs逐渐形成聚集体或结节,碱性 磷酸酶活性也随之增高,基质钙化明显,可分化为成骨细胞。 透明质酸、骨形态形成蛋白-2 (BMP-2) 以及铜等均可促使 MSCs 向成骨细胞分化。
2 体内分化
由MSCs向类心肌细胞分化过程中,除5氮胞苷外,体内心脏微环境 对MSCs的分化也至关重要。Wang等在其实验中提及心肌微环境 可以支持MSCs移植后的生长和向心肌细胞分化。 “环境依赖性分化”（milieu-dependent differentiation）内容： 认为生长因子、细胞因子、细胞外基质等以及它们在干细胞/宿 主细胞之间的相互作用，在诱导MSCs向心肌分化方面起着重要 作用。 尽管MSCs向心肌分化的具体机制不清楚，但一致倾向认为:组 织损伤和高水平的多能细胞是其分化的两个重要的决定因素。
诱导分化—胰岛细胞
先用bFGF,EGF bFGF,EGF等因子诱导成人MSCs向nestin阳性的祖细胞(NIP) bFGF,EGF 分化； 再用高糖无血清培养基和β细胞调节素、尼克酰胺等诱导NIP向 胰岛样细胞分化 结果表明MSC经第一阶段的诱导后可分化成NIP,继续诱导6天后 变圆的细胞逐渐增多，并聚集成团，双硫腙染色阳性，免疫组 化实验证明经两阶段诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、 生长抑素等内分泌激素，放免分析结果表明，诱导的胰岛样的 细胞团可分泌胰岛素，糖反应性较弱
诱导分化—软骨细胞
（1）三维培养方式 （2）无血清培养基 （ 3 ） 添加转让生长因子 β家族成员
在 成 人 骨 髓 的 MSCs 培 养 体系中加入地塞米松和TGFβ3,在第14天时,在细胞外 基质中检测到Ⅱ型胶原；在 含10 - 7moL/ L 地塞米松的 培养基中培养, 有Ⅱ、Ⅹ型 胶原表达。
诱导分化—脂肪细胞
用异丁基-甲基黄嘌呤 （IBMX）、地塞米松、胰岛素和吲哚 异丁基IBMX） 地塞米松、胰岛素和吲哚 异丁基 IM） 美辛 （IM）联合诱导人的MSCs ,可观察到细胞内逐渐聚集含脂 质丰富的小泡, 多种诱导处理可使95%以上的细胞定向分化为脂 肪细胞,并且细胞内的脂质小泡不断地长大、融合,最终充满细 胞。这些分化的脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月。
间充质干细胞分离培养
采集部位： 采集部位 髂骨上嵴、胫骨和股骨、胸骨和腰椎。 分Fra Baidu bibliotek方法： 分离方法：
细胞帖壁筛选法 密度梯度离心法 细胞分子标记分选法 细胞筛筛选法
第三代hBMMSCs HE染色 ×1000 图1 第三代 染色 图2 hBMMSCs P1,P3,P5代生长曲线 代生长曲线
成骨诱导第10天倒置 图3 hBMSCs成骨诱导第 天倒置 成骨诱导第 相差显微镜 ×400
诱导分化—内皮细胞
血管内皮生长因子(VEGF) 血管内皮生长因子(VEGF) 多能成体祖细胞(multipotentadult progenitor cells,MAPCs)是骨髓 MSCs 的一个亚群。2002 年,首次在体外用血管内皮生长因子(VEGF)把 人骨髓MSCs 诱导分化成具有脉管母细胞表型的细胞, 随后这些细胞分 化成表达内皮细胞标记物的细胞。在培养过程中MAPCs可以不断扩增80 多个群体,倍增时间没有明显衰退表现,所以在临床治疗方面,MAPCs是一 种理想的内皮细胞来源。 牛 垂 体 内 皮 细 胞 生 长 添 加 剂 (endothelial cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS) 国内学者用牛垂体内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS)对兔MSCs进行定向诱导分化， 细胞80%融合时呈现“铺路石”样形态,细胞免疫组化证实扩增细胞表达 CD31和von Willebrand factor(vWF),具有吞噬ac-LDL的功能,且扩增细 胞在体外参与网状血管样结构形成。因此认为,在体外能诱导MSCs向内 皮细胞分化。 此外，在创面微环境下 在创面微环境下,MSCs可分化为血管内皮细胞,并参与创面修复。 在创面微环境下
神经干细胞
侧脑室下层 海马齿状回
神经干细胞特性
形态特征 表面标志 低免疫源性 组织融合性 好
神经干细胞的培养与鉴定
目的：成年大鼠脊髓中神经干细胞培养和鉴定。 方法： 悬浮培养，自我增殖实验和免疫细胞化学技 术进行鉴定。 结果： 培养1～2周时，培养液中即出现神经干细胞 克隆球。该克隆球有很强的自我增殖能力，可多次传 代。免疫细胞化学技术证明该克隆球表达大量神经干 细胞特征性的中间丝——巢蛋白(Nestin)。
诱导分化—神经细胞
在丁化羟基苯甲醚(BHA) 或 β- 巯基乙醇 丁化羟基苯甲醚(BHA) 巯基乙醇作用下, 可诱导大鼠骨 丁化羟基苯甲醚 (BHA)或 髓基质细胞向神经细胞分化 用双丁酰环磷腺苷(dbcAMP)和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理 MSCs可诱导神经分化早期标记的表达 在神经生长培养基中添加EGF和脑源性神经营养因子（BDNF）同 样可诱导神经分化早期标记的表达。 在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可诱导大鼠骨髓基质细胞向神 经细胞分化。