流式细胞术课件

Flow cytometry of apoptotic cell death
Phospholipid redistribution
第七节 细胞周期的检测
Flow cytometry of cell cycle
原理：细胞在有丝分裂的过程中 DNA 会加倍。 （n----2n）

以二倍体细胞为例，流式检测细胞周期的过程。 首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞 （G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的 细胞又有 G1 期，S 期,G2 期和 M 期。
前向角散射光 ——FSC
Forward
Angle Light Scatter
Laser
FALS Sensor
侧向角散射光——SSC

Side Scatter
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
散射光

散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态
上的差异
-
通常使用“散点图”来看散射光信号
法测定端粒长度
第二节 流式细胞仪工作原理
一、工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发
效率；
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检
测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数
信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
基本工作原理
散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒
的数据
散点图——Dot Plot
lysed whole blood
测得的FS与SS信号
通过计算机处理，可得
到FS-SS图，由此可仅用 散射光信号对未染色的
活细胞进行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分析 表面分子。
淋巴细胞 中性粒细胞 单核细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
1. 液流系统

由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 单抗对其染色 受清洁气体压力 流动室形成样本流 荧光染料标记的 从样品管进入


鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包 裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置， 防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
液流系统

液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处
红 色 荧 光 强 度
便于数据统计 不同的细胞群可 以用不同的颜色标 记 主要表达方式
绿色荧光强度
第四节 流式细胞样品制备
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他 实验的不同，选用不同的抗凝剂。 可选的抗凝剂有： EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml
第六节 凋亡细胞的检测
细胞在凋亡时产生的一系列形态学、生物化学 及分子生物学性质的变化,包括细胞皱缩,核染 色质凝聚,细胞膜通透性改变,诱导蛋白酶凋亡 分子激活,线粒体跨膜电位降低,膜磷酯酰丝氨 酸外化,胞质Ca2+浓度升高,DNA片段化及含量 变化等特点,进行定性、定量测试分析,从而实 现对细胞凋亡的准确测定。
第三节 流式细胞术数据显示
参 数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
数据显示方式
直分析方图
单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析

设门分析:REGION和GATE设置
双参数直方图点图
光学系统示意图
Flow Tip SS and FL Detector
FS Detector
Laser
流式细胞仪的光信号
散射光信号
荧光信号
(2) 散射光信号
前向角散射光（FSC,Forward Scatter）
入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。
侧向角散射（SSC, Side Scatter） 入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对 复杂性。
3. 电子系统
主要由计算机及其软件组成
4. 细胞分选系统
Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
FALS Sensor Fluorescence detector
Charged Plates
-
+
Single cells sorted into test tubes
液流系统示意图
喷嘴 鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
2. 光学系统

激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞术
郭素娟
生殖生物学实验室 2018.6.8
第一节 流式细胞术概述
流式细胞术

流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可
以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通 常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群 体加以分选
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及
BD LSR
通过流式细胞仪我们可以得到以下信息
- 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度
- 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成 大小 粒度 细胞功能 细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性
DNA, RNA含量
蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
胞内细胞因子
标本处理时间：
新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析
样本固定方法：
1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。
第五节 流式细胞荧光标记
选择合适的荧光染料

必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发

激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适
范围内

荧光素光谱的重叠应当尽量减少

荧光信号

荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子

荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强
荧光检测器
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Flow cytometry of apoptotic cell death
Baidu Nhomakorabea
Flow cytometry of apoptotic cell death

荧光吸收

细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的 活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、 Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死 细胞和凋亡细胞

线粒体功能的变化

TMP会在凋亡中产生，可以通过一些标记用流 式细胞仪检测。使用有膜穿透性的亲脂性阳离 子荧光染料，如Rh123, DiOC6, JC-1,CMXRos 等，可作为流式检测的探针。
当细胞发生凋亡时，一个线粒体膜表面蛋白— —7A6抗原会出现


Bcl-2/bax family of proteins.
PEcy5
能量传递复合染料
常用的几类荧光染料
名称 异硫氰酸荧 光素 得州红 藻红蛋白 藻青蛋白 别藻青蛋白 能量传递复 合染料 染料 FITC Texas red PE PC APC PEcy5 激发 波长 488 568 488 488 633 488 红 670 红 670 易 不敏感 减少交叉，成本高 荧光颜 色 绿 525 红 615 橙 575 易 不敏感 具较多发光基团，消光 系数和量子产额高 溶解性 易 不易 对PH敏感 性 敏感 不敏感 特点 易溶于水，与抗体结合 不影响特异性 稳定，偶联后量子产额 低
（3）荧光测量

荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后 产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长

选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区
分开，送入不同的光电倍增管。

选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个 不同特征。 线性放大器和对数放大器
Flow cytometry of cell cycle G1 期细胞主要进行 RNA 和蛋白的合成, DNA 数 目为 n. S 期 DNA 开始复制，直到复制结束进入 M 期， DNA 数目从 n 变为 2n. G2 期主要是 RNA 和蛋白的合成,为 M 期做准备 DNA 数目为 2n M 期细胞分裂的过程，直到 M 结束细胞一分为二， DNA 数目也是 2n，分裂后期DNA数目变回n。 从 DNA 的数目上，我们可以将细胞周期分为 G0/G1 期，s 期，G2/M 期
Flow cytometry of cell cycle
一般利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图 来表示，如果 G0/G1 期处于 50 的位置，那么 G2/M 期处于 100 的位置。期间的为 S 期
Flow cytometry of cell cycle
THANK YOU
Flow cytometry of apoptotic cell death

FCM of Caspases
通过抗体和活化的caspase-3片断相结 合来检测 使用特异性的caspase-3荧光底物 新的抗原决定基CK18

Flow cytometry of apoptotic cell death
激素结合位点 酶活性
基础研究
淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血 干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡 相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究 （MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测
定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、
血管内皮细胞研究
临床研究
淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞 分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、 PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因 子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室
形成稳态 单细胞液柱
喷嘴
水平激光与之 荧光染料被 激发发光 垂直相交 放大
荧光检测系统和 散射光感受系统
收集光信号
光电倍增管
脉冲信号
计算机系统 分析结果
现代流式细胞仪包括




液流系统 聚焦细胞以供检测 光学系统 激发和收集光信号 电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机 分析 细胞分选系统
细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，
通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种
信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞仪
流式细胞仪 是测量染色细胞标记物荧光强度
的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础 上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大 小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等） 进行快速测量并可分类收集的高技术。
Flow cytometry of apoptotic cell death

钙离子流和 pH值变化

胞浆内Ca2+ 水平的上升和由于细胞内环境酸化造成的 选择性的pH值的调节降低是伴随着细胞凋亡产生的后果 之一。

使用Ca2+ 选择性荧光探针，如 Quin-2, Fluo-3, Indo-1 通过流式检测是测定细胞内Ca2+浓度的最佳方案 酸化的检测同样可以用对pH敏感的荧光探针，如 DCH, BCECF, BCECF-AM, SNAFLs, SNARFs等进行检测
抗体使用原则

根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光 抗体
低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如 PE、APC 使用双标以上抗体必做荧光补偿


几种常见的荧光染料
细 胞 悬 液
FITC 异硫氰酸荧光素
FL1 FL2 FL3 FL4
激光
Texas red 得州红 PE.PC.APC 藻胆蛋白类