分子生态学在环境微生物领域的应用

分子生态学研究方法与技术在环境微生物领域的应用（专业：09微生物姓名：柴化建学号：s9071005478）摘要：对环境微生物的研究有助于利用环境微生物解决环境污染的问题。微生物是废水处理、城市生活垃圾填埋或堆肥处理等系统中的主要功能生物，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据。通过利用分子生态学的研究方法和技术，从分子的活动变化规律来闸释环境微生物生态变化及生物分子活动过程与机理，从而应用于环境治理领域。

关键字：环境微生物荧光杂交蛋白质组学宏基因组学微阵列环境在不同的生命层次（分子水平，个体水平，种群水平，及群落水平，甚至生态系统水平）对生命活动产生不同的影响，生物体也是通过在不同水平层次上的调节来适应和改变环境。在环境微生物领域，对环境中微生物的主要类群及它们的生理、生态特性、微生物与环境污染的关系、污染物的微生物降解及转化规律等进行研究是重要的。目前研究环境微生物的主要方法仍是基于培养和分离纯化的传统技术，已经无法满足研究者对环境微生物进行快速、准确的分析与鉴定的要求。故从分子生态学方向入手将会给环境微生物的研究起到很大的推动总用。分子生态学应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制。从微观研究层次它主要涉及生态现象与生态规律的发生、演化与发展的分子生物学过程与机理，即怎样利用DNA(基因)，蛋白质(酶)等生物活性分子的活动变化规律来闸释生态变化的生物分子活动过程与机理。利用分子生态学研究方法与技术，从分子种群生物学、分子环境遗传学和分子适应等几个方面的内容对环境微生物进行研究。以求改进微生物处理污染物的工艺、提高处理效率。

一．环境mRNAandrRNA同时荧光原位杂交

Giovannoni等在1988年首次将荧光原位杂交

(fluorescenceinsituhybirdization，FISH)引入细菌学的研究，当时使用的是放射性标记rRNA寡核苷酸探针来检测微生物。随着荧光标记的发展，放射性标记被非同位素染料代替。1989年，DeLong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞，荧光标记寡核苷酸探针比放射性探针更安全和具有更好的分辨力，并且不需要额外的检测步骤。荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪(confocallaserscanningmicroscope，CLSM)下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA或RNA分子在染色体或其它细胞器中的定位。由于rRNA在微生物体内的拷贝数较高、分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性，因此通常使用rRNA 作为探针，但以rRNA作为探针的FISH只能分析群落的遗传结构，不能明确揭示群落结构与功能的关系。Anneliepernthaler等将rRNA和mRNA同时FISH来研究环境细菌结构和某一代谢活性之间的关系，作为一个例证研究，同时检测环境微生物mRNA和rRNA，他们研究了pmoA(编码甲烷单氧化酶A亚基)基因的在环境中的表达，很好地与群落功能活性联系起来。可见，将环境rRNA和mRNA同时FISH来研究微生物群落功能是可行的。FISH技术可确定细胞和组织中特异性转录物定位及其表达的相对水平，它是用一标记生物素或地高辛的非同位素探针，和所制备样本中的RNA进行杂交。地高辛内标记的反义多聚核苷酸探针，在反转录过程中杂交到细菌细胞中，这一技术将是研究复杂群落环境中原位基因表达较为有利的手段。另外，结合报告基因分析的FISH技术对于复杂微生物群落的结构与功能分析也是十分方便有利的。在微生物群落研究中利用FISH技术将原位杂交与功能研究结合是必然的发展趋势，可以进行基因表达和代谢水平的研究。

二．稳定性同位素联合宏基因组技术

宏基因组(metagenomics)或环境基因组(environmentalgenomics)是特定环境内所有生物遗传物质的和，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术。它于1998年首先由Handelsman等¨提出，与传统方法相比，宏基因组学是一种不依赖于纯培养

(cultivation—independent)的技术方法。它直接从环境样品中提取基因组DNA(environmentDNA，eDNA)，以获得某一环境或共生体中所有微生物基因组的集合，然后将环境eDNA克隆到适当的载体上，通常是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和不同类型的广宿主或穿梭载体然后让其在大肠杆菌、链霉菌、假单胞菌或根瘤菌等适宜宿主中表达H，构建一个复杂度极高的宏基因组文库，最后运用各种分析手段筛选出功能基因，并可以进一步对功能基因测序，推测活性产物的结构，建立系统发生树等。宏基因组技术能够基于序列分析得到微生物群落潜在生态功能信息，但是，不能够明确预测功能特别是在特异条件下才表达的基因。而且要从由环境复杂群落构建的宏基因组文库中获得特定的目标基因需要筛选和测序成千上万的克隆。尽管通过宏基因组学的方法筛选到了一些功能基因，但随机性太大。稳定性同位素联合宏基因组技术(SIPenabledmetagenomics)可大大减少克隆的数量。通过稳定性同位素(SIP)实验使参与特定代谢过程(例如甲烷氧化)的生物基因组得到富集，克隆从SIP实验中获得的”C标记的核酸，从而构建出在某一特定的环境过程中执行特定代谢功能(如可吸收或转化、代谢特定的标记基质)的环境微生物的功能宏基因组文库，就可重建一个较小、针对性强的目标微生物功能群基因组，从而极大地减少需要筛选的基因克隆数量。并且可直接利用分离出的”C一核酸构建宏基因组克隆文库。稳定性同位素联合宏基因组技术可用于环境甲基营养菌(甲烷营养菌和甲醇营养菌)、有机污染物降解菌、根际微生物生态(植物．微生物．微动物相互作用)、厌氧环境中互营微生物等群落结构和特定代谢过程功能分析，在微生物的种类鉴定和功能鉴定间建立了直接的联系。

三．微阵列技术

微阵列技术自1995年由Schena创立以来J，已逐渐发展成为功能基因组学研究的最有力的工具之一。它作为一种强有力的基因技术，被广泛地用于研究生物过程。虽然微阵列技术已被成功用于分析纯培养全基因的表达，但是由于特异性、灵敏度和定量等问题，它在环境微生物群落研究中仍存在挑战。根据探针的类型可将环境研究中的微阵列分为3类：功能基因微阵列(functionalgenearrays，FGAs)、群落基因组微阵列