蛋白芯片

SELDI蛋白质芯片技术在肿瘤诊断中的临床应用

SELDI蛋白质芯片技术又称为表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface—enhanced laser desorption／ionization —- time of flight —- mass spec-trumpery。SELDI—TOF —MS)．自2002年13本科学家田中耕一因发明该技术而荣获诺贝尔化学奖后．该

技术发展十分迅速，目前已经广泛应用于生物技术、药学、基因学、临床诊断、生物信息等诸多领域。其在临床实验诊断学中的主要工作原理是利用蛋白质芯片(proteinchip)

和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪对体液中各种蛋白质．包括疾病早期最微小基因表达产物如低分子量蛋白质、多肽等。进行动态、全景的分析。获得待检标本中各种蛋白的含量及其分子量等信息，绘制成蛋白质指纹图谱。再通过计算机软件将正常人、亚健康状态人群、良性疾病和癌症病人的指纹图谱库对照。比较分析差异。就能快速、敏感和特异地发现和捕获新的与疾病相关的蛋白。目前发现通过SELDI蛋白质芯片技术所获得的生物标记物．大多是特异性肿瘤微环境所产生的低分子量的蛋白质，通过对多种肿瘤的检测表明。其敏感性和特异性均优于传统的肿瘤标记物．对某些肿瘤的敏感性已达到100％。特异性也超过95％。因而该技术能在肿瘤早期诊断中具有很重要的临床应用价值。

1 SELDI一TOF—MS系统的组成

1.1 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列(protein microarray)。把制备好的蛋白质样品固定于经化学修饰的玻片或硅片等载体上。蛋白质与载体表面结合。同时仍保留蛋白质的理化性质和生物活性．可以高效地大规模获取生物体中蛋白质的信息。蛋白质芯片技术主要包括四个基本要点：芯片阵列的构建、样品的制备、芯片上的生物分子反应、芯片信号检测及分析。制备蛋白质芯片时由于蛋白质分子的活性依赖于不同的折叠方式。因此对芯片的表面修饰至关重要。要保证被点在芯片上的蛋白质不失活而又能牢固的固定在芯片上。SELDI蛋白质芯片的制备比普通的蛋白质芯片更复杂。首先制备生物原始样品, 把制备好的蛋白质经过亲和作用结合到芯片的化学或生物位点上．再洗去非特异结合的蛋白质和缓冲液中的杂质以消除干扰。待芯片干燥后。每个位点上加能量吸收分子(energy absorb molecule，EAM)，使之与蛋白质结合为混合晶体．以促进蛋白质在SEL-DI 一TOF—MS检测中解吸附和离子化圆。根据定位于芯片表面的物质性质不同．芯片分为化学型和生物型两类：化学型芯片是基于经典的层析原理，通过疏水力、静电力、共价键等结合样本中的蛋白质；生物型芯片则是把生物活性分子结合到芯片表面,用抗原和抗体、受体和配体、酶和底物、蛋白质和DNA之间的相互作用捕获样本中的蛋白质,用以研究这些蛋白质分子之间的相互作用。

1．2 表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪即sELDI一IDF—MS系统的芯片阅读器．芯片上蛋白与EAM形成的晶体。在特异激光照射下，品体发生解离。带电粒子通过电场时被加速。检测仪记录飞行时间，粒子的质量越小，相对所带电荷越多，质荷比(m／z)越小，飞行时间越短，被最先检测到，反之粒子的质量越大。相对所带电荷越少，质荷比(m／z)越大，飞行时间越长，则被后检测到。测到的信号由高速模拟数字转化器转换并记录．被测蛋白就以一系列峰值的形式呈现．这些特异性波峰构成了该疾病特有的指纹图谱。指纹图谱的横轴表示蛋白类型，纵轴为蛋白的丰度．单个蛋白在图谱上的位置取决于飞行时间。

1．3 软件控制分析系统主要有Ciphergensoft-ware3．1和Biomarker Pattern Software 等．软件控制分析系统可以使整个过程变得自动化、简便化。其主要功能包括：数据库的建立、内部信息及外部信息的校准、数据处理和分析。通过对已知两组或多组数据进行差异性分析．从而寻找出数据中有鉴别意义的质谱图。

2 ELDI一rOF-MS技术的特点

目前常用于蛋白质鉴定的质谱技术还有电子喷雾电离质谱测量技术(electros pray ionization—mass spectrometry。ESI—MS)、基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱技术(matrix assisted laser desorption／ionization —time of flight—mass spectrometry．MALDI—TOF—MS)等。ESI—MS可精确地测出蛋白质的分子量．目前也已经成功地用于蛋白质等生物大分

子测定、肽图测定、蛋白质和多糖序列以及翻译后修饰的分析。近几年来出现的ESL—M MS 串联质谱技术还可测定修饰的氨基酸，该技术有很高的准确度，但灵敏度稍低。并且系统复杂、操作要求较高，通常只用于MALDI—TOF—MS不能鉴定的复杂样品。而不作为

常规和高通量分析四。MALDI—TOF-MS技术又称为多肽质量指纹分析（ptide mass finger printing）具有操作简便、分析速度快、敏感度高等优点，但是该技术只能鉴定数据库中已知序列的蛋白质。且要tide求样品纯度尽可能地高．样品中的脂质、碳水化合物等

都会影响蛋白质的有效离子化。从而对测定结果产生较大的影响。

SELDI-TOF-MS技术是由MALDI—TOF-MS改进而成．其实行的表面增强激光解吸离

子化飞行时间质谱．将芯片技术和质谱技术相结合，分析过程中不破坏蛋白质．整合了蛋白质样品处理、生物分子反应、检测分析过程于一体，实现了高效、快速、高通量的检测．在蛋白质鉴定技术中有其独特的优点。该技术可以在不需对生物样本纯化的前提下直接检测其中的含有的蛋白质：样品用量少。具有很高的特异性和敏感性。可以检测出低丰度、小分子量的蛋白质；分析速度快，高通量便于自动化，可以同时发现多个生物标记物；可测定疏水蛋白质特别的膜蛋白；此外也不需要特殊的实验室．有利于技术的推广.

3 SELDI一TOF-MS技术在肿瘤诊断中的临床应用

目前SELDI—TOF—MS技术在医学方面的应用相当广泛．已经开始用于临床疾病的

诊断和疗效监测．而这些疾病之中又以恶性肿瘤研究得最多。利用该技术用于肿瘤研究已经发现了一系列新的肿瘤特异性标志物．使得对恶性肿瘤的诊断敏感性和特异性都取得了极大的提高．同时在肿瘤的发病机制方面也取得了一些新的进展。

3．1 前列腺癌前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PAS)是目前诊断前列腺癌的主要血清学参考指标。PSA敏感性很高，有高度脏器特异性，但其低浓度时对前列腺癌的特异性相对较低．部分良性前列腺疾病(BPH)也能出现血清PSA水平轻度升高。Adam 等学者应用SELDI一TOF-MS技术检测167例前列腺癌患者、77例BPH患者、82例正常人．发现前列腺患者尿液中存在9种特异蛋白质生物标志物(分子量分别为4475、5074、5382、7024、7820、8141、9149、9507、9565)，由这9种特异蛋白质组成的诊断模型可

将前列腺癌、BPH、正常人患者清楚地区分开来。其敏感性达到83％。特异性为97％，

阳性预测值为96％。

3．2 膀胱癌目前膀胱肿瘤的常规检查初检率都普遍较低．而膀胱镜检查操作烦琐。并容易损伤尿道粘膜。术后常有尿道刺痛、血尿发生，病人承受的痛苦很大。Vlahou等

利用蛋白质芯片技术检测了近100例低度恶性膀胱肿瘤患者尿液．发现了5种潜在的低度恶性膀胱肿瘤标记物．其中分子量为3400的特异蛋白在膀胱癌患者尿液亦可被检测到，根据该特异蛋白可以将检测低度恶性膀胱肿瘤的敏感性由传统尿细胞学的43％提高7O％.特异性从70％提高到86％．也证实了SELDI—TOF-MS技术可有效应用于膀胱肿瘤的早期诊断。

3．3 卵巢癌50％的I期卵巢癌和90％的Ⅱ期以上的卵巢癌病人血清CA125升高。CA125值和肿瘤大小、肿瘤分期相关，但是CA125对卵巢癌的特异性很低．子宫内膜癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、直肠癌患者和某些良性疾病如肝炎、肝硬化时也可升高。利用SELDI_．IDF-MS技术发现卵巢癌患者血清中有5个蛋白质峰(m／z分别为534、