第十八章 分子标记辅助选择育种

2.SSR标记的原理
根据微卫星序列两 端互补序列设计引物， 通过PCR反应扩增微 卫星片段，由于核心 序列串联重复数目不 同，从而表现出不同 个体在同一个微卫星 座位上微卫星的长度 多态性。
三、基于DNA芯片技术的分子标记
单核苷酸多态性 (singlenucleotide polymorphism，SNP)： 是指不同个体基因组DNA序列之间单个核苷酸的差异。
在传统育种中，选择的依据通常是表现型而非基因型。
这是因为人们无法直接知道个体的基因型，只能从表现型
加以推断，也就是说，传统育种是通过表现型间接对基因 型进行选择的。理论上，利用分子标记可从DNA水平上直 接鉴定基因型的差异，因此，避免了表现型推断基因型不 准确等缺点。MAS的优越性可以体现在以下方面：
综合性状上应该比较优良，为此，需要对育种世代群
体的每个目标性状一一作鉴定筛选。
（5）可进行性状非破坏性评价和选择：很多性状是在 成熟前进行评价的，这往往带来种子收获的困难。如 对植株进行病虫害抗性的评价，涉及到接种、饲喂幼 虫等环节，对植株生长有较大影响，严重时往往造成 收获到的后代种子减少，甚至收获不到种子。
1.多态性高 2.表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型 3.对主要农艺性状影响小 4.经济方便，容易观察记载
三、遗传标记种类
1.形态标记
形态标记：即植物的外部形态特征。指那些能够用肉 眼明确观测的一 类外观特征性状。 形态标记性状： 植株高矮、粒型、粒色、穗 形、白化、 变态叶、矮秆、紫鞘、卷叶等； 也包括色素、生理特性、生殖特性、 抗病虫性等有关的一些特性。
完成作物育种的任务主要取决于以下三个方面
1.亲本，亲本中必须包括育 种目标所需的基因资源， 并且这种基因资源是可供 育种家方便利用的 2.采用合理先进的育种方法， 将优良基因重组在一起 3.准确、可靠的鉴定技术， 把优良基因型挑选出来并 鉴定出它在一定的自然气 候条件、生产条件下的适 应能力和生产潜力
（1）克服性状表现型鉴定的困难：有些性状的表现型鉴定 相当麻烦，在度量技术上难度较大、程序繁琐或因需要特 定的仪器和设备，费用太高。 （2）允许早期选择：在育种中，某些性状表现出来需要特
定的生长环境和一定生长周期。因此，在对这些性状鉴定
时必须考虑其表达的环境和等待一定生长时期，有时需要 异地加代和特异的环境条件等。用标记鉴定基因型，将不 需考虑（或等待）植株生长状况或环境条件，可以在早期 对幼苗（甚至对种子）进行检测。
第三节 分子标记辅助选择
一、什么是分子标记辅助选择？？
借助分子标记对目标性状基因型进行选择，这就是所谓的“分子 标记辅助选择”（marker-assisted selection，缩写为MAS）。
分离 群体
抗性 鉴定
分子 标记 辅助 选择 结果 抗 感 杂 杂 杂 感 杂 抗 感 杂 抗 杂 杂 抗 感
（6）从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率：
针对有利基因为隐性的性状，如果将有利的隐性
等位基因从一个亲本导入到优良亲本中时，常规表型育 种往往是通过选择保留含有隐形基因的杂合基因型，作 进一步回交，而杂合基因型鉴定通常是通过考察自交后 代分离状况来判断，而且当选择的是抗病性状时，还要 借助繁琐的接种鉴定等，这样会延迟育种进程。分子标 记辅助选择则不受上述限制条件的影响。
第十八章 分子标记辅助选择育种
选择：是指在一个群体中选择符合育种目标要 求的基因型
我们还记得作物育种的任务吗？
按照人们的预定目标，采取相应的育种 程序和方法，诱发、创造和重组遗传变异， 选育出适应当地自然气候条件，符合社会、 生产需要，在遗传组成上相对稳定一致的优 良基因型，并繁育出足够数量个体（种子苗 木）供生产上应用。
在育种实践中经常可以看到这种情形：
采用两个相同的亲本进行杂交，从同一杂交组合中有 人选出了品种，而有些人则一无所获。
为什么？？
道理很简单，每个亲本有许许多多性状，两个亲本杂 交，其后代可出现成千上万种基因组合。如何将最好 的基因型挑选出来，这不仅取决于育种家的理论知识 和正确的育种方案，更重要的是育种家敏锐的眼光和 育种经验。与此同样重要的是还需要具备使优良基因 型充分表达的外界环境条件。
二、分子标记辅助选择育种的遗传基础 1.分子标记辅助选择的根据
借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，主要是
根据与目标基因的紧密连锁的对分子标记基因型的检测来
推测、获知目标基因的基因型。
2.应具备的主要条件
（1）与目标基因紧密连锁的分子标记。 （2）进行分子标记辅助育种需要建立饱和的分子标记图谱 并把目标基因定位于分子图谱上。 （3）简便快捷的标记检测方法。
第四节 分子标记辅助选择育种
一、分子标记辅助选择育种 利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记 对目标性状进行基因型选择的一种现代育种方法。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1.4kb
SCAR特异引物在Pm基因聚合材料DH群体中的扩增结果
M:1kb DNA Ladder 1.CS 2.Pm21 示1.4kb的抗病特异带 3-16. Pm基因聚合材料DH群体
3-16. Pm基因聚合材料DH群体
M:1kb DNA Ladder 1.CS 2.Pm21 示1.4kb的抗病特异带
第一节 遗传标记概述
一、遗传标记概念 遗传标记(Genetic markers): 是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。具有 可遗传的、特殊的、易于识别的表现形式。
二、遗传标记应具备的条件：
③多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需要专门创造 特殊的遗传材料； ④表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状 无必然的连锁；
⑤许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂 合基因型，提供完整的遗传信息。
DNA分子标记技术大致可分为三类：
第一类：以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术。 包括RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）等； 第二类：以DNA聚合酶链式反应 (PCR， Polymerase Chain Reaction)为基础的分子标记技术。 包括RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、序列 特征化扩增区域SCAR等； 第三类：以 DNA测序为核心的分子标记技术。 如：SNP标记、表达序列标签EST标记等；
（3）控制单一性状的多个（等位）基因的利用：在不 同育种材料中，影响同一性状（如抗病、品质）的基 因可能有多个，特别是在同一位点上存在不同（复） 等位基因，利用表型是很难鉴定出这些等位基因的。 （4）允许同时选择多个性状：育种目标性状往往需要 综合考虑，也就是说，当选单株或品系不仅要在单一
的抗病、抗虫、品质、产量等方面表现优良，而且在
广义而言，分子标记辅助选择不仅包括利用分 子标记进行优异种质的鉴定筛选、（自交系）亲本 间的亲缘关系分析、遗传多样性的保持和利用，而 且包括利用分子标记选择、转移、聚合目标基因等 育种的其它诸多环节，如植物系统发育关系分析、 品种注册、专利保护、体细胞杂种鉴定、新品种权 保护等。
二、分子标记辅助选择的优越性
就两个序列的比较而言，可指同一位点的不同等位基因之间个 别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等； 就遗传群体而言，指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种 不同的核苷酸且其出现频率大于1%（若出现频率低于1%， 则视为点突变，是不可能作为标记的）。 它又被称为第三代新型多态性标记。通常我们所说的 SNPs包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失（Indel） 目前，检测SNP的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。 DNA芯片又称生物集成模片、DNA阵列或寡核苷酸微芯片。
凝胶电泳分离，转移到滤膜上
步 Southern杂交 骤 放射性自显影或酶学检测
RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。
二、基于ＰＣＲ技术的分子标记
◆聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外快 速扩增DNA的方法 。 ◆ PCR反应包括三个步骤：
第二节 分子标记技术类型及原理
一、 RFLP 限制性片段长度多态性 (RFLP)是发展最早的分子标记技术。 RFLP是不同 物种、品种甚 至个体间DNA经 核酸限制性内 切酶酶切后产 生的片段长度 的差异 ——这 种差异可以通 过DNA凝胶电泳 的方法直接观 察到。
DNA提取 基 用DNA限制性内切酶消化 本
●变性：在94-95℃使模板DNA的双 链变性成单链。 ●复性：两个引物分别与单链DNA 互补复性，复性的温度在50-60℃ ●延伸：在引物的引导及Taq酶的 作用下，于72℃合成模板DNA的互补 链
◆ 这三个步骤称为一个循环， PCR反应常有25-35个循环。
1、RAPD标记的基本原理
RAPD应用了PCR反应 的原理，以不同的基因组 DNA为模板，以单一的随 机寡聚核苷酸（长度多为 10个核苷酸）为引物而获 得的一定扩增产物。由于 不同基因组DNA序列存在 着差异，其不同区段上可 与引物同源互补的位点不 同，扩增产物的数量、大 小也不同，因而表现出多 态性。这些DNA片段鉴定 后证明可以作为分子标记 的则称之为RAPD标记。
染色体数量特征：
是指细胞中染色体数目的多少，染色体数量上的 遗传多态性包括整倍性和非整倍性的变异。 整倍性的变异：多倍体。 非整倍性的变异：缺体、单体、三体、端着丝点染 色体等
3.生化标记：指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗
传标记系统。 主要包括贮藏蛋白、同工酶、等位酶等标记。
分析方法：从植物组织 的蛋白粗提物中通过电 泳和组织化学染色法将 酶的多种形式转变成肉 眼可辩的酶谱带型。
各种性状的选择鉴定主要靠当地天然环境条件 和多年多点试验，对病虫害和旱涝、盐碱抗性常靠 人工诱发鉴定和连续多代表型选择。而不同年份、 不同地点、不同田块甚至于同一田块中的不同部位， 条件总不会完全相同，这势必影响实验的客观性、 公正性可和可重复性。为提高选择效率，加快育种 进程，育种家们想方设法探究基因型与表型之间的 关系，研究各种性状之间的相关，寻找准确可靠的 鉴定方法和最佳选择方法。
3.分子标记辅助选择育种的基本程序：
第一步，目标基因的精细定位，要求目标基因有一个 与其紧
密连锁的分子标记，并且目标基因座位与分子标记座位之
间的遗传距离小于5源自文库M；
第二步，采用RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子标记进行多态 性检测； 第三步，利用计算机分析多态性； 第四步，应用RFLP、RAPD、AFLP、SSR等标记针对育种群体 进行分子标记辅助选择。
2.细胞学标记(cytological markers)
细胞学标记： 即植物细胞染色体的变异，指能明确显示 遗传多态性的细胞学特征。 染色体结构特征：包括染色体核型（染色体数目、结构、 随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等） 的变化。 核型特征：是指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无 等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位 等遗传变异。 带型特征：是指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深 浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染色体上常染 色质和异染色质的分布差异。
4.分子标记(molecular markers)
分子标记：是DNA水平上的遗传多态性，表 现为核苷酸序列的任何差异。
DNA分子水平研究
优点： ①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时 期均可检测到，而且不受环境限制，不存在是否表达的问 题； ②数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限，DNA标记 在数量上几乎是无限的；
近十年来，分子生物学技术的发展为植物 育种提供了一种基于DNA变异为基础的新型 遗传标记，与形态标记、细胞学标记和生化 标记相比，是从基因型选择基因型。 RFLP RAPD SSR AFLP
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1.4kb
SCAR特异引物在Pm基因聚合材料DH群体中的扩增结果