实验四 植物细胞悬浮培养与同步化

实验五植物细胞悬浮培养与同步化

一、实验目的与意义

学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法以及同步化的方法。

植物离体细胞作为生物反应器具有生产周期短、提取简单、易规模化、不受外界环境干扰，而且产量高、化学稳定性和化学特性好等特点，利用植物离体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到研究者们的重视，也有成功的先例。同时，研究发现，离体培养条件下，细胞系的种类以及培养条件、培养基的组成、植物生长调节剂的种类和浓度对目的产物的产量有很大的影响。

二、基本原理

利用固体培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变。而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。

一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般用100～12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。

在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。

三、实验器材

超净工作台、震荡摇床、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、镊子、锥形瓶、各种接种工具、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管、离心机

四、实验药品

培养基母液、2，4-D、蔗糖、琼脂。

五、实验步骤

1、诱导愈伤组织形成。

2、制备液体培养基：MS+2，4-D 1mg/L+蔗糖3%

3、在超净工作台上，从形成愈伤组织的培养瓶中，挑取质地松弛、生长旺盛的愈伤组织、放

入盛有30ml液体培养基的三角瓶中，用镊子轻轻捏碎愈伤组织。每瓶接入约2g重的愈伤组织，置于震荡摇床固定，在黑暗条件下或弱散射光下100r/min震荡培养。

4、将胡萝卜悬浮细胞培养物摇匀后倒在或滴入孔径较大的尼龙网或不锈钢网漏斗中（孔径47

μm，81μm或更大）。

5、如果网眼被细胞团堵塞，可用吸管反复吸、吹。

6、再用无菌培养基冲洗残留在网上的细胞团。

7、重复步骤4~6。

8、将通过较大孔径的细胞悬浮液，再通过较细孔径的尼龙网过滤（如31μm，26μm），用吸

管反复吸、吹。

9、经过分级过滤的“同步化”细胞离心（50g，5分钟），收集后加入液体培养基进行培养或

进一步同步化。

六、思考题

1、研究细胞悬浮培养的意义何在？挑选愈伤组织进行悬浮培养需注意什么问题？

2、建立细胞悬浮系的步骤包括哪些？一个良好的悬浮细胞培养体系应该具有什么样的特征？