脉冲场电泳(PFGE)数据分析
脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用
脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，该技术是将电泳电场方向交替性改变，并优化脉冲时间和其他条件，可以分辨凝胶中35～10 000 kb的DNA分子。
该方法应用于分子流行病学中，通过观察电泳条带的差异，为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段。
该技术在致病菌溯源（细菌性传染性疾病溯源、细菌性食源性疾病溯源）、医院内感染流行监测等方面都有广泛的应用。
标签：脉冲场凝胶电泳；致病菌分型；致病菌溯源；院感监测[Abstract] Pulsed Field Gel Electrophoresis （PFGE）is a new technique of gelelectrophoresis developed in1980’s. It can be used to separate large DNA molecules ranging from 35 to10 Mb. It has been widely applied to the pathogen molecular typing ，identification of species groups ，Source-tracking of pathogen and nosocomial infection surveillance.[Key words] PFGE；Pathogen molecular typing；Traceability pathogens；Hospital infection surveillance脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，是上世纪80年代后期发展起来的一种新型的电泳技术，主要用来分离大分子量线性DNA。
传统的琼脂糖凝胶电泳技术仅能分离50 kb以下的DNA分子，对于超过50 kb的DNA分子，传统的琼脂糖凝胶其分子筛作用较弱，无法清晰分辨电泳条带[3]。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为：细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），这种酶切后的片段少而大，适合于作PFGE电泳。
McCllelland等通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现，四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的，在他们所试验的16个细菌的染色体中，被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切，每100000bps中不到一次，这些酶的识别序列分别为：XbaⅠ（TCTAGA），SepⅠ（ACTAGT），AvrⅡ（CCTAGG）和NheⅠ（GCTAGC）。
同样地，在许多含G+C<45%的基因组，CCG和CGG更少。
这样用SmaⅠ（CCCGGGG）、R srⅡ（CGGWCGG）、NaeⅠ（GCCGGC）和SacⅡ（CCGCGG）进行酶切，对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察，可因不同研究者而出现较大差异，据此，Tenover等经过多年的研究提出了PFGE的解释标准：(1)相同（indistinguishable）：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关（closelyrelated）：PFGE试验中，其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。
典型的情况下，这种变化可导致2～3条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关（possiblyrelated）：两个独立的基因情况所致的一致的差异，如出现了4～6条带差异，此时能用简单的插入或DNA缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
科室PFGE分析
背景的问题
• • • • • DNA降解 菌量过多 裂解不完全 清洗不足 酶切不完全
谢谢！
PFGE操作及注意事项
金东 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室
PFGE原理与方法
实践表明：长度大于40KB的DNA不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中 分离。脉冲场凝胶电泳解决了这一难题，该法可以分离长至50MB 的DNA分子。其原理是：DNA分子在交替变换方向的电场中做出反 应的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶 中移动也较快，于是不同大小的分子被成功分离。 DNA分子在交替电场作用下的行为可以用分子的延展性和沿电场 方向平行泳动前的重新定向解释。DNA分子以蠕行（reptation） 方式在琼脂糖凝胶的连续孔洞中迁移。当电场变换方向时，DNA 分子在新的方向泳动前必须再定向。
PFGE是一个操作步骤相对复杂的试 验过程，除了保证相关仪器和耗材 的质量外还需要操作人员的仔细认 真和试验程序的标准化
Excellent gels
1. Gel fills the whole TIFF 2. Wells included on TIFF 3. All bands including the last band of the standard appear on the TIFF 4. The last band of the standard is 1-1.5cm from the bottom of the gel 5. The cell concentration is approximately the same in each lane 6. Clear and distinct bands all the way to the bottom of the gel 7. Straight lane 8. Complete restriction in all lanes 9. Clear backgroud 10.No DNA degradation (no smearing in all lanes)
脉冲场凝胶电泳技术_PFGE_在分子分型中的应用现状_王丽丽
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疾病监测 ２００６ 年 ５ 月 ３１ 日第 ２１ 卷第 ５ 期 Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ， Ｍａｙ．３１，２００６， Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．５
·综 述·
脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）在分子分型中的应用现状
王丽丽， 徐建国
关键词： 脉冲场凝胶电泳； 分子分源自； 应用【中 图 分 类 号 】Ｒ－ ３３１
一 ＰＦＧＥ 方法原理
ＰＦＧＥ 以 其 重 复 性 好 ， 分 辨 力 强 而 被 誉 为 细 菌 分子生物学分型技术的＂金标准＂。它可以用于大 分 子 ＤＮＡ 的 分 离 ， 其 分 辨 范 围 达 到 １０ Ｍｂ。 而 普 通 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仅 能 分 离 小 于 ５０ ０ ｋｂ 的 ＤＮＡ 分 子 。ＰＦＧＥ 的 基 本 原 理 是 通 过 电 场 的 不 断 改 变 ， 使 包 埋 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 ＤＮＡ 分 子 的 泳 动 方 向 做 相 应 改 变 ， 小 的 ＤＮＡ 分 子 比 大 的 变 化 快 ，
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。
其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。
具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。
本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。
1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。
PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。
之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。
根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。
基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。
2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。
如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。
如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。
而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。
考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。
3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。
缓冲液的温度会产生一定的影响。
这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。
在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。
脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。
脉冲场凝胶电泳技术对一起肠炎沙门菌疫情分子生物学分析
脉冲场凝胶电泳技术对一起肠炎沙门菌疫情分子生物学分析用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对一起肠炎沙门菌暴发疫情进行病原菌分子特征、菌株之间的遗传相关性分析。
方法对分离到的菌株进行PFGE分析，对菌株进行分子分型，以BioNumerics V4.0软件UPGMA方法进行聚类分析。
结果食物中毒分离4株肠炎沙门菌以Xba I酶切后PFGE可分为同一型别。
结论该次食物中毒的暴发为同一型肠炎沙门菌引起，可能有共同的传染来源。
肠炎沙门菌是一种革兰阴性杆菌，常寄生于人和动物肠道或肠系膜淋巴组织中[1]。
肠炎沙门菌引起的食源性疾病引起了国内外高度重视，世界卫生组织为此建立WHO GSS监测网[2]。
达州市2008-07-28发生一起肠炎沙门菌引起的食物中毒，为查找传染来源、分析传播链，加强监控和阻断，以达到预防和控制疾病的目的，运用脉冲场凝胶电泳(PFGE) [3]等方法对这次肠炎沙门菌暴发疫情中分离的菌株进行分子生物学研究[4]，现将结果报告如下。
1 材料与方法1．1菌株来源4株菌（SCGS08072-SCGS08075）为达州市2008-07-28一起食物中毒暴发疫情中剩余食品和患者肛拭子中分离所得。
VITEK32全自动微生物分析系统和血清凝集鉴定4株菌均为肠炎沙门菌。
PFGE分析用分子量标准参考菌株一沙门菌H9812，为全国病原细菌实验室监测网络PulseNet China的标准菌株[5]。
1．2 试剂和仪器试剂琼脂糖SeaKem Gold Agarose(Cam—braex Bio Science Rockland)、限制性内切酶Xba I(Promega公司)、蛋白酶K(MERCK公司产品)等试剂用于脉冲场凝胶电泳。
引物合成于上海生工生物有限公司。
仪器脉冲场凝胶电泳仪为CHEF—DR nlsystem(Bio—Rad USA)，凝胶成像系统为Gel Doc XR(Bio—Rad USA)，浊度仪为VitekColor／meter(BioMer／eux France)。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
脉冲场凝胶电泳技术
5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
PFGE原理及参数设置..
影响分辨率的因素
影响分辨率的因素包括：脉冲时间、电场夹角、电场强度、 电影温度、缓冲液以及电泳时间等。在脉冲场凝胶电泳中 通常包括脉冲时间、电场强度、温度、缓冲液组成、琼脂 糖类型和浓度以及电场夹角等参数而只是改变脉冲时间来 控制分辨样品的范围，即通过增加脉冲时间分离较大分子， 减少脉冲时间来分离较小分子。
大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用 的电场夹角为120度。
电场角度
120 °
2.2 Mb 1.6 Mb
105 °
100 °
96°
94° 随着电场角度的减 少，两个大片段分 的更开。但是同时 小片段也在逐渐的 压缩。所以为了兼 顾不同大小的片段 需要选择一个合适 的电场角度。
大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120。
脉冲时间
脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间。
例如：脉冲时间为30s，即电场方向将会在30s变换一次。脉冲时
间是脉冲场电泳的核心参数。通常实验中使用的脉冲时间为一个范 围值如：2－20S。这样是为了使一定范围内的DNA片段都可以得 到理想的分离。这种脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的。 线性是指脉冲时间在一定的电泳时间内是均匀变换的；而非线性的 变换可以使一定的脉冲时间相对集中，从而使相应大小的片断得到 更好的分离。
PFGE原理及相关参数
目前常用的脉冲场凝胶电泳仪器为箝位匀强电场系统（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF）
方框代表琼脂糖凝胶，一排长方形小框代表DNA加样孔，六边形代表CHEF系 统的电极（4X6）。当电泳工作时，DNA分子以箭头方向迁移。
通常使用的缓冲液的温度为12℃－15℃。在这个温度内
MLST方法原理、数据处理及应用介绍
MLVA：VNTR位点滑链突变 MLST：管家基因的点突变
ICDC, China CDC
MLST基本原理
abcZ 测序结果 1 2 3 222 222 222
细菌染色体
菌株编号 NM201101
abcZ adk aroE fumC gdh pdhC pgm MLST型 1 1 2 1 3 2 19 ST-7
• 全国范围的、长期的流行情况调查
所有菌株进行PFGE，挑选代表菌株进行MLST分型。
肺炎克雷伯菌院内感染鉴别
ST-11
流脑暴发调查
健康携 带本底 菌株 流脑菌株总携 带率：28.3％
暴 发 相 关 菌 株
暴发相关菌株 携带率：15.7%
健康携 带本底 菌株
谢 谢
扩增片段长度多态性（AFLP）
多位点序列分型（MLST） 脉冲场凝胶电泳（PFGE） 多位点串联重复序列（MLVA）
较好
一般 较好 较好
较好
好 较好 较好
好
好 较好 较好
中等
好 较好 较好
一般
一般 一般 一般
两天
>两天 两天 一天
中等
大 小 大
中等
高 中等 低
ICDC, China CDC
分子分型主要的三种实验数据形式
/ 流感嗜血杆菌MLST数据库
http://mlst.ucc.ie/ 沙门氏菌MLST数据库
/ legionella/legionella_sbt/php/ sbt_homepage.php 嗜肺军团菌SBT（MLST）分型数据库
DNA提取
（1）已分离到细菌：细菌培养，提取DNA。用试剂盒或者水煮法提取均
可以。 （2）未分离到细菌的标本（脑脊液、血液、咽拭子、肺泡灌洗液
副溶血弧菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)标准操作方案
酶 NotI（10U/µl） 4µl 总体积 200µl
9、
每管加入 200µl 混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面 的下面。
10、
在 50℃水浴中孵育至少 4 小时，H9812 的胶块放在 37℃水浴中孵育至少 2 小时。 灌制电泳胶
1、 打开水浴箱，温度调至 55-60℃。 2、 配制 2200ml 的 0.5×TBE。 3、 用 0.5×TBE 配制 1%SeaKem Gold(SKG)胶。 14cm 宽电泳胶框（10-15 加样孔） ：1.0gSKG 胶溶于 100ml0.5×TBE 中； 21cm 宽电泳胶框（≥15 加样孔） ：1.5gSKG 胶溶于 150ml0.5×TBE 中。 4、 熔化时，微波加热 60 秒，混合；每隔 15-30 秒重复一次，直到胶完全熔化。 放在 55-60℃水浴备用（温度至少平衡 30 分钟以后使用） 。 5、从 37℃水浴中取出酶切完的胶块，平衡到室温。 6、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 7、每管加入 200µl 0.5×TBE, 室温平衡 5 分钟。 8、安装胶槽，调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶 槽使其水平。 9、 把梳子平放在胶槽上， 把胶块加在梳子齿上。 把标准菌株 H9812 加在第 1、 5、 10 个齿上（10 齿梳子）或第 1、5、10、15 个齿上（15 齿梳子） 。 10、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约 3 分钟。 11、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在同一条直线上，并且胶块与胶槽的底面 相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入熔化的在 55℃－60℃平衡的 1％SKG。避免 气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固 30 分钟左右。 12、记录加样顺序。
BN软件分析PFGE
BN软件分析PFGE脉冲场凝胶电泳（PFGE）是一种高度区分性的分子分型技术，是一种分离大分子DNA或者染色体的方法。
PFGE是基于大的DNA限制性片段在交替极性的电场中的可变迁移的原理。
在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。
DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。
相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。
因此小分子向前移动的速度比大分子快。
然后通过比较任何两个分离株的指纹图谱，可以研究它们是否属于同一菌株（即两个分离株是克隆的）或在遗传上不相关。
PFGE在国际监测网络（例如PulseNet）中的使用以及在重要食源性病原体（大肠杆菌，李斯特菌，弯曲杆菌等）的标准流程中的使用，促进了该技术的采用。
尽管可以使用最新的分型方法，但PFGE仍然是许多国家和国际监测程序中的金标准。
在实践中，将经过研究的分离株的标准化细胞悬液包埋在琼脂中，以增强该过程中的DNA稳定性。
然后裂解细菌细胞，并通过宏观限制性分析产生细菌染色体的大片段。
在电泳过程中使用交替极性的电场分离DNA片段，然后得到图谱并记录指纹文件。
BioNumerics使用行业领先的数据库引擎Oracle，可以将所有流行病学信息和凝胶图像存储在一个数据库中。
使用便捷的向导可以定义新的指纹类型，选择最佳设置以进行标准化、分辨率、背景消除、平滑和条带查找。
BioNumerics软件提供了用于分析PFGE指纹数据的集成平台。
通过轻松简单的拖放，将指纹数据链接到BioNumerics数据库中的分离株。
只需单击几下鼠标即可创建数据比较：一个可帮助您使用BioNumerics丰富的统计工具集来计算相似度矩阵和树状图的向导：包括基于条带的相似系数：Jaccard、Dice、Jeffrey's X、Ochiai、不同条带的数量。
在各种聚类分析方法之间进行选择：UPGMA、Ward、邻位相邻、单链接、完整链接、创建图。
厦门市副溶血性弧菌的脉冲场电泳分析及数据库建立
・论
著 ・
厦 门市副溶血性弧菌 的脉 冲场 电泳 分析 及数据库建立
翁琴 云 游 小伟 张建梅 黄建 炜
厦 门市疾病 预防 控制 中 心 ， 厦门 要】目的 建 立厦 门市 副 溶血 性 弧菌 分 离株 的脉 冲场 凝 胶 电泳 （ Ｐ Ｆ ＧＥ ） 数据库， 分 析不 同来 源菌 株 的同源 性关 系。 方法 ２ ０ ３株菌 株 的基 因组 Ｄ Ｎ Ａ经 Ｉ酶切 、 脉 冲 场 电泳 后 ， 利用 Ｂ ｉ ｏ ｎ ｕ ｍｅ ｒ ｉ ｃ ｓ 软 件 分 析 电 泳 图谱 。 结 果
ｈ ａ ｅ ｍ ｏ ｌ ｙ ｔ ｗｕ ｓ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ黼 Ｉ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｎ ｗ ｅ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｎ ｕ ｍｅ ｒ ｉ ｃ ｓ ｓ ｏ ｆ ｔ ｗ ａ ｒ ｅ ． Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ２ ０ ３ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ Ｗ ｅ ｒ ｅ ｄ ｉ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ １ ４ ９ ｄ ｉ ｓ ｔ ｉ ｎ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ ｐ ａ ｔ ｔ ｅ ｒ ｎ ｓ ９ １ ． １ ３ ％ （ １ ８ ５ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ） ｏ ｆ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｗ ｎ ｅ ｄ ｕ ｎ ｉ ｑ ｕ ｅ Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ ｐ ａ ｔ ｔ ｅ ｒ ｎ ，
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基于脉冲场凝胶电泳的DNA分子量测定研究
基于脉冲场凝胶电泳的DNA分子量测定研究DNA分子量是衡量DNA分子长度大小的重要参数，对于研究基因组学、生物化学和遗传学等领域具有极其重要的意义。
在DNA测序、DNA分离、核酸电泳等实验中，准确测定DNA分子量是很关键的，因此发展高精度、高效率的DNA分子量测定方法一直是研究的热点和难点。
脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）是一种高分辨率的DNA分子量测定和分离方法，广泛应用于肿瘤基因、微生物基因、人类遗传病等的研究中。
它通过在高疏水性琼脂中进行电泳，可以将大分子DNA按大小远远超过传统电泳技术所能实现的范围分离和分析。
然而，PFGE技术仍然存在局限性，例如需要长时间实验、样品数量受到限制、样品处理繁琐等。
此外，由于PFGE中的电场强度和时间的影响，有时候难以准确测定DNA分子量，因此需要进行优化。
基于脉冲场凝胶电泳技术的DNA分子量测定方法（PFGE-SD）是近年来得到广泛研究的一种方法。
该方法不仅能够克服PFGE技术的局限性，而且能够提高分辨率和精度，使得测定DNA分子量更加准确和可靠。
PFGE-SD方法是在PFGE基础上发展起来的一种新型方法。
它通过在PFGE过程中使用特殊的脉冲场和凝胶体系，在不同电压下进行电泳，并且借助凝胶中DNA高分子链的伸缩和收缩特性，使得测定结果更加准确和可靠。
PFGE-SD方法的关键在于优化PFGE实验条件和凝胶体系。
首先，需要选择适合的脉冲电场强度和时间，以实现最佳的分辨效果。
其次，需要选用适当的凝胶材料和缓冲液，使得电泳过程中DNA分子链更加稳定，减少DNA断裂和扯碎等问题。
此外，还需要控制凝胶厚度和DNA浓度，以最大程度地保证实验结果准确，避免其他干扰因素的影响。
总体而言，PFGE-SD方法是一种具有很高潜力的DNA分子量测定技术。
它可以克服传统PFGE技术的局限性，提高分辨率和精度，使得测定DNA分子量更加准确和可靠。
未来，随着技术的进一步发展和优化，PFGE-SD技术有望成为一种主流的DNA分子量测定方法，广泛应用于生物医学、生物化学和遗传学等领域的研究中。
脉冲场凝胶电泳检测电离辐射诱发DNA损伤及其修复
脉冲场凝胶电泳检测电离辐射诱发DNA损伤及其修复王芹;岳井银;穆传杰【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2006(34)6【摘要】目的:评价脉冲场凝胶电泳(PFGE)法检测电离辐射诱发小鼠脾细胞DNA损伤及其修复的可行性.方法:采用PFGE法测定不同剂量γ射线诱发小鼠脾细胞DNA单、双链断裂及4 Gyγ射线照射后不同时间脾细胞DNA单、双链断裂及其修复情况,并与未照射组(对照组)进行比较.结果:γ射线照射小鼠后,脾细胞DNA单、双链断裂数目随照射剂量的增加均呈增加趋势,单链断裂数目多于双链,1 Gy所致DNA双链断裂及2 Gy所致DNA单链断裂显著高于对照组(t=2.668,P＜0.05;t=5.117,P＜0.01).以4 Gy照射后经过不同时间修复,单、双链断裂均呈下降趋势,起初DNA链断裂的修复为快速修复,1 h后大多数损伤已得到修复.单链断裂的修复速度高于双链,当修复时间超过2 h后,单链断裂又呈现上升趋势.结论:本实验方法有可能成为一种快速、敏感地检测活体动物细胞DNA损伤及其修复的方法.【总页数】3页(P399-401)【作者】王芹;岳井银;穆传杰【作者单位】300192,中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所;300192,中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所;300192,中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所【正文语种】中文【中图分类】R4【相关文献】1.DNA组织在电离辐射诱发DNA损伤中的作用研究进展 [J], 刘晓麒2.电离辐射诱发DNA链断裂及其修复动力学 [J], 穆传杰3.电离辐射对沉默ATRX的HeLa细胞DNA损伤修复的影响 [J], 唐庚;史耀庭;孔维轩;柯希扬;李成想;邱禹淇;于雷;杨艳明;王志成4.电离辐射和核酸内切酶诱发DNA双链断裂作为致癌致畸致突和细胞死亡的临界损伤 [J], Obe G;孙元明5.电离辐射诱发小鼠脾细胞DNA链断裂及修复 [J], 王芹;岳井银;李进;穆传杰;樊飞跃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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细菌分子分型技术服务(PFGE/MLVA/MLST)
一、产品描述信息
过去20年的实践证明，分子分型方法在细菌的分子流行病学、种群结构分析、基因多态性分析等方面显示了很好的应用能力，在疾控、医药、农业、食品、环境、出入境检验检疫等领域发挥重要作用。
其中脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）三种技术是目前应用最广泛的细菌分子分型方法。
PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。
它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb。
PFGE选用识别低频率酶切位点的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型，从而实现对菌株分型以检测菌株的基因多态性。
MLST是基于细菌核苷酸序列比对的一种分子分型方法，其原理是通过比较细菌个体7个或者更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其基因多态性，同时通过划分序列群和构建最小生成树来揭示细菌群体遗传结构。
MLVA是基于细菌基因组中多个位点的数目可变化的串联重复序列核心序列的拷贝数的差异来对不同细菌个体进行分型的一种技术。
MLVA具有快速高通量易于操作等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示细菌群体遗传结构特征。
使用PFGE、MLST、MLVA中的一种或者综合使用多种分型方法，可以揭示细菌的基因多态性和群体遗传结构，结合细菌的三间分布信息以及其他生物学信息（如耐药特征、特殊表型、毒力基因检测）等可以进行细菌的流行特征、传播机制、变异特征分析，以及特殊意义克隆群的甄别等研究，另外还可以为后续的研究，如全基因组测序、致病机制研究等项目筛选具有基因组代表性的测试菌株。
二、产品详细信息
1、技术路线
2、技术优势
1.技术成熟，本团队具有丰富的实践经验，可为客户提供详细先进的实验方案；
2.有多种分型方法组合供不同的实验目的选择；
3.性价比高，适合开展大样本量的实验项目；
4.快速高效，只需一个月时间可以完成100株细菌的基因多态性和种群结构分析。
3、样本要求
1.细菌（PFGE用）
冻存或者平板培养状态均可。
2.细菌DNA（MLST和MLVA用）
浓度≥ 30 ng/μL；总量100μL；纯度达到可开展常规PCR扩增要求。
三、数据分析服务
BioNumerics主要应用：
◆PFGE typing
◆RiboPrinter typing
◆MLST analysis、MLVA typing
◆MALDI、AFLP、RFLP、RAPD
◆REP-PCR、ARDRA、DGGE、TGGE
◆Whole genome MLST
◆Whole Genome Map Types
◆Antibiotic resistance profiling
◆Community fingerprinting
◆Diversilab genotyping
◆Hetero-Duplex Analysis (HDA)
◆HIV drug resistance prediction
◆ISSR-PCR using QIAxcel
◆ITS typing
◆MIRU-VNTR typing
◆MLPA analysis
◆Molecular surveillance
◆Sequence-based typing
◆Sequence repeat typing
◆SmartFinder data analysis
◆spa-typing
◆T aqman-based SNP genotyping
四、服务咨询及技术支持
电话: 021 - 6488 7580 QQ:327 162 799
E-mail：info@。