藻蓝蛋白 实验报告

藻蓝蛋白的分离与纯化

姓名：郭均

学院：食品与生物工程

班级：食安 09-2

学号：200906041069

藻蓝蛋白的分离与纯化

一、实验目的和要求

1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法；

2、掌握蛋白含量测定方法；

3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。

二、实验原理

藻蓝蛋白（PC）是一类普遍存在于藻蓝蛋白中的光合辅助色素，也是一种天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作视频着色剂。此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外它还有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。

利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸收水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。研究表明可用25%硫酸铵饱和度沉淀除去杂质，55%硫酸铵沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用脱盐的方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，故不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂志透析掉。

蛋白质含量测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm变为595nm，在一定范围内，蛋白质含量与595nm处吸光值成正比。

离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙胺基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子的交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大

小取决于彼此间相反基团的静电引力，这又与溶液的pH有关,因为pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质相反电荷之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质先从层析柱中洗脱下来。

本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3，在pH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。

三、试剂与仪器

1、试剂

螺旋藻藻粉

0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.5）: 配置0.2 mol/L pH6.5硫酸缓冲液；称取磷酸二氢钠32.21g溶于蒸馏水稀释至1000 mL为A液。称取磷酸二氢钠71.64g溶于蒸馏水稀释至1000 mL为B液。取A液68.5mL,B 液31.5mL,混匀后即可。稀释0.2 mol/L pH6.5硫酸缓冲液20倍得0.01 mol/L pH6.5硫酸缓冲液。

标准蛋白（0.1mg/mL）:结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成0.1mg/mL的蛋白质标准溶液。

考马斯亮蓝G-250：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，加蒸馏水稀释至1000mL。

0.5 mol/L NaOH

0.5 mol/L HCI

NaCl

硫酸铵

透析袋

DEAE-纤维素

奈氏试剂：将10g碘化汞和7g碘化钾溶于水中，另将24.4氢氧化钾溶于

内有70mL水的100mL容量瓶中，并冷却至室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液注入容量瓶中，边加边摇动。加水至刻度，摇匀，放置2天后使用。试剂保存在棕色试剂瓶中，暗处。

四、实验步骤

（一）藻蓝蛋白的提取及初步纯化

1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。

具体操作：取螺旋藻粉1g，加入0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液10ml，充分搅拌均匀。室温浸泡30min-1h后，在-20℃和38℃之间反复冻融数次（3-5次）。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min，4000r/min离心20min，上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。

2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。

具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4℃盐析30min，然后4000r/min 离心20min，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵4℃盐析24h，4000r/min离心20min，弃去上清液，离心收集得到的沉淀即为藻蓝蛋白。

3、透析去盐

得到的沉淀用10ml 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为10kD）中在500mL 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液（或H

0）中透析袋中倒出纯化后的藻蓝蛋白，于4℃下保存备用。

2

（二）藻蓝蛋白含量测定

1、制作标准曲线；

2、样品含量测定；

3、计算结果。

具体操作步骤如下：

取洁净干燥的试管若干，按表1-1比例配置标准蛋白溶液。原始标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。

表1-1 标准溶液配置