酵母转化手册(译自Yeastmaker
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
新转化的酵母菌株的储存 1. 如果要保存新转化的酵母菌株，用接种环（牙签）接种单菌落。 2. 用包含 15–30% 无菌甘油的 0.5 ml YPD 或 YPDA 液体培养基（或者适宜的 SD 培养基）重悬菌体，接入 2mL 离心管 3. 用封口膜封紧盖子，轻轻混匀，速冻后放入‐70℃冰箱保存。 4. 如需使用该菌株，在冰上充分溶解后，挑适量菌液，在 YPD 或 YPDA 固体 培养基（或者适宜的 SD 培养基）上划线培养。（在划线前要充分混匀菌液）
PEG/LiAc 溶液（聚乙二醇 3350/醋酸锂 溶液） 先配置母液：50% PEG 3350、10X TE Buffer 和 1 M LiAc (10X)，转化前再配置工作液，
现配现用。
母液
工作液各组分 配置 10mL 工作液所 要求的终浓度 需各组分母液体积
50% PEG 3350
40%
8 ml
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
6. 酵母转化方法 A． 方法：酵母感受态细胞的制备 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Cat. No. 630439) 1.1x TE/LiAc (Section 4) YPDA 固体培养基 YPDA 液体培养基 适宜的 SD 筛选培养基 酵母细胞 (S. cerevisiae)冷冻保存液 无菌（去离子）水（去离子水就是超纯水） 2. 挑酵母菌株（Y1HGold）在 YPDA 固体培养基上划板，30℃倒置培养，待菌生长至 适宜大小（约 3 天）。 注意：此时可以暂停实验，将平板转入暗下，4℃可保持 1 个月，待继续实验时将 平板再放入 30℃，菌落会继续生长。 3. 挑单菌落（直径 2–3 mm，储存时间<4 周），接种于有 3 ml YPDA 液体培养基的三 角瓶（规格：15mL）中。 （温馨提示：同时挑 4 个单菌落，接种到 4 个三角瓶中，最后挑生长速度最快的 菌落继续实验） 4. 在 30℃摇床中，以 250rpm 摇 8–12 小时。 5. 转大瓶：吸取 5uL 菌液转入有 50mL YPDA 液体培养基的三角瓶（规格：250mL）中。 6. 在 30℃摇床中，以 250rpm 继续摇 16–20 小时，期间测 OD，待 OD600 达到 0.15–0.3 时停止摇菌。 注意：一定要持续摇菌至 OD 值合适时停止，但培养时间不能过长。 7. 室温下，700 g 离心 5 min 收集菌体，弃上清，用滤纸吸干残余液体，加入 100mL YPDA 液体重悬菌体。 8. 在 30℃摇床中，以 250rpm 继续摇 3–5 小时至 OD600 达到 0.4–0.5。 注意：一定要持续摇菌至 OD 值合适时停止，但培养时间不能过长。 9. 将菌液分装至 2 个灭过菌的 50mL 离心管中，室温下 700 g 离心 5 min 收集菌体。 弃上清，用滤纸吸干残余液体，2 个离心管中各加入 30mL 灭过菌的超纯水，重悬 菌体。 10. 室温下 700 g 离心 5 min 收集菌体。弃上清，用滤纸吸干残余液体，2 个离心管中 各加入 1.5 ml 1.1xTE/LiAc 重悬菌体， 11. 将菌液分别转至 2 个 1.5mL 离心管中，高速离心 15s。 12. 弃上清，2 个 1.5mL 离心管各加入 600 µl 1.1xTE/LiAc，重悬菌体，酵母感受态细胞 已制备好，可用于转化质粒 DNA。 注意：为了使转化效率尽可能的高，感受态要现配现用，但是此感受态细胞在冰 上储存几个小时并不会明显降低转化效率。
（**变性方法： 用 95–100°C 高温处理 5 min，迅速置入冰上数分钟，待温度降至 4℃再重复一次此步骤）
3. 加入感受态细胞，轻柔混匀 4. 加入 PEG/LiAc，轻柔混匀 5. 置于 30℃恒温箱孵化
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 10min，Library‐Scale 每隔 15min，轻轻倒混几次）
高速离心 15s 700 g 离心 5 min
12. 弃上清，加入 0.9% (w/v) NaCl 溶液重悬菌体
1 ml
15 ml
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
C. 方法：涂板、判定转化效率 1. 将菌液分别稀释 10 倍、100 倍，分别吸取 100 µl 稀释液，涂布到相应的 SD 筛选 培养基上。例如： pGBKT7 载体用 SD/‐Trp 培养基 pGADT7 载体用 SD/‐Leu 培养基 pGBKT7 和 pGADT7 共转，用 SD/‐Leu/‐Trp 培养基 注意：不要直接用未稀释的菌液涂板。
50 µl 500 µl 30 min
600 µl 2.5 ml 45 min
6. 加入 DMSO，轻柔混匀
20 µl
160 µl
7. 在 42℃水浴锅中温浴
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 5 min，Library‐Scale 每隔 10 min，轻轻倒混几次）
15 min
20 min
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B． 方法：转化酵母感受态细胞 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2. 将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。
2. 30℃恒温箱倒置培养 3–5 天，待菌落长至适宜大小 3. 用下列公式计算转化效率
转化效率 = 单菌落数 X 悬浮细胞液总体积（mL） 涂板的菌液体积（mL) X DNA 总量（ug)
（如果是用 10 倍稀释液或 100百度文库倍稀释液涂板，还要乘以相应的倍数）
例如：转化 100 ng pGBT9 空载体（Yeastmaker Yeast Transformation System 2 的阳性对照质粒），将 1 ml 菌液稀释 10 倍，吸取 100 uL 涂板，培养 3 天后，在 SD/Trp 上长出 300 个单菌落，其转化效率为：
10X TE Buffer
1X
1 ml
1 M LiAc(10X)
1X
1 ml
0.9% (w/v) NaCl 溶液 称取 0.9g NaCl，溶解于 80mL 超纯水中，用容量瓶定容至 100mL，过滤灭菌。
5. 酵母菌株储存条件 如果想要了解更多关于酵母的知识，推荐去看 Guide to Yeast Genetics and Molecular
2. 组分内容
3. 所需的附加材料 A． Clontech 的 Ready‐to‐Go Media Pouches Clontech 提供提供预先混合好的培养基，以方便使用 表 1 酵母转化实验所需要的培养基组分
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B．培养基的配法 配置好的培养基溶于 500mL ddH2O，121℃高压蒸汽灭菌 15min，在使用前要降 至常温，（液体培养基也可以过滤灭菌）。灭菌时间不能过长。
8. 离心收集菌体
高速离心 15s 700 g 离心 5 min
9. 弃上清，加入 YPD Plus 培养基
（注意：使用 YPD Plus 可提高转化效率 50‐100%，此步骤不要使用普通 YPD 培养基）
1 ml
3 ml
10. 30° C 摇床震荡培养
可忽略此步骤 90 min
11. 离心收集菌体
Clontech 公司提供的预先混合好的培养基不需要调 pH，但是如果配置使用的 ddH2O 偏酸性，就要将 pH 调到 5.8。
关于培养基配置的更多细节可以查询 Clontech Yeast Media Protocol‐at‐a‐Glance (PT4057‐2)。
4. 酵母转化所需溶液 1.1X TE/LiAc 溶液 先配置母液：10X TE buffer 和 1 M LiAc (10X)，转化前再配置工作液，现配现用。 混合 1.1 mL 10X TE buffer 和 1.1 mL 1 M LiAc (10X)，再加入 8.8mL 灭过菌的超纯水， 定容至 10mL，混合均匀。
质粒 DNA（浓度、纯度高） 变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100 ng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
Biology, by Guthrie & Fink (1991) and Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts, edited by Heslot & Gailardin (1992).
酵母菌在用封口膜封住的 YPD 或 YPDA 培养皿上，4℃可以保持 2 个月。但是新 鲜的菌种（1‐3 周）接菌到液体培养基上后活力更佳。
转化效率=
300 x 1 x 10(稀释倍数） 0.1 x 0.1
=3x105 cfu/μg
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
酵母转化手册 译自 Clontech Yeastmaker™ Yeast Transformation 目录 1. 简介 2. 组分内容 3. 所需的附加材料
A． Clontech 的 Ready‐to‐Go Media Pouches B． 培养基配方 4. 酵母转化所需溶液 5. 酵母菌株储存条件 6. 酵母转化方法 A． 方法：酵母感受态细胞的制备 B． 方法：转化酵母感受态细胞 C． 方法：涂板、判定转化效率 7. 参考文献
System 2
User Manual（PT1172‐1）
图表 表 1：酵母转化实验所需要的培养基组分
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
1. 简介
Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 提供了一种高效的 PEG/醋酸锂 酵母细胞转化法，本方法适用于所有的酵母转化，包括酵母单杂交系统和酵母双 杂交系统。 此方法提供了一种比常规转化方法更为高效，转化效率更高也更为可信的技术， 如果要筛文库，较高的转化效率是必要的条件，你的文库包含的克隆数越多，你 就越有可能发现新的、稀有的相互作用，此方法之所以较其他方法转化效率更高， 是因为该方法包含一个特殊又重要的步骤：在加入 DNA 和 DMSO 处理后，加入 YPD Plus 液体培养基培养酵母细胞（帮助酵母细胞摄取更多的质粒 DNA）。使用此方 法，可以获得≥3 X 105 转化子/ug 质粒 DNA。
PEG/LiAc 溶液（聚乙二醇 3350/醋酸锂 溶液） 先配置母液：50% PEG 3350、10X TE Buffer 和 1 M LiAc (10X)，转化前再配置工作液，
现配现用。
母液
工作液各组分 配置 10mL 工作液所 要求的终浓度 需各组分母液体积
50% PEG 3350
40%
8 ml
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
6. 酵母转化方法 A． 方法：酵母感受态细胞的制备 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Cat. No. 630439) 1.1x TE/LiAc (Section 4) YPDA 固体培养基 YPDA 液体培养基 适宜的 SD 筛选培养基 酵母细胞 (S. cerevisiae)冷冻保存液 无菌（去离子）水（去离子水就是超纯水） 2. 挑酵母菌株（Y1HGold）在 YPDA 固体培养基上划板，30℃倒置培养，待菌生长至 适宜大小（约 3 天）。 注意：此时可以暂停实验，将平板转入暗下，4℃可保持 1 个月，待继续实验时将 平板再放入 30℃，菌落会继续生长。 3. 挑单菌落（直径 2–3 mm，储存时间<4 周），接种于有 3 ml YPDA 液体培养基的三 角瓶（规格：15mL）中。 （温馨提示：同时挑 4 个单菌落，接种到 4 个三角瓶中，最后挑生长速度最快的 菌落继续实验） 4. 在 30℃摇床中，以 250rpm 摇 8–12 小时。 5. 转大瓶：吸取 5uL 菌液转入有 50mL YPDA 液体培养基的三角瓶（规格：250mL）中。 6. 在 30℃摇床中，以 250rpm 继续摇 16–20 小时，期间测 OD，待 OD600 达到 0.15–0.3 时停止摇菌。 注意：一定要持续摇菌至 OD 值合适时停止，但培养时间不能过长。 7. 室温下，700 g 离心 5 min 收集菌体，弃上清，用滤纸吸干残余液体，加入 100mL YPDA 液体重悬菌体。 8. 在 30℃摇床中，以 250rpm 继续摇 3–5 小时至 OD600 达到 0.4–0.5。 注意：一定要持续摇菌至 OD 值合适时停止，但培养时间不能过长。 9. 将菌液分装至 2 个灭过菌的 50mL 离心管中，室温下 700 g 离心 5 min 收集菌体。 弃上清，用滤纸吸干残余液体，2 个离心管中各加入 30mL 灭过菌的超纯水，重悬 菌体。 10. 室温下 700 g 离心 5 min 收集菌体。弃上清，用滤纸吸干残余液体，2 个离心管中 各加入 1.5 ml 1.1xTE/LiAc 重悬菌体， 11. 将菌液分别转至 2 个 1.5mL 离心管中，高速离心 15s。 12. 弃上清，2 个 1.5mL 离心管各加入 600 µl 1.1xTE/LiAc，重悬菌体，酵母感受态细胞 已制备好，可用于转化质粒 DNA。 注意：为了使转化效率尽可能的高，感受态要现配现用，但是此感受态细胞在冰 上储存几个小时并不会明显降低转化效率。
（**变性方法： 用 95–100°C 高温处理 5 min，迅速置入冰上数分钟，待温度降至 4℃再重复一次此步骤）
3. 加入感受态细胞，轻柔混匀 4. 加入 PEG/LiAc，轻柔混匀 5. 置于 30℃恒温箱孵化
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 10min，Library‐Scale 每隔 15min，轻轻倒混几次）
高速离心 15s 700 g 离心 5 min
12. 弃上清，加入 0.9% (w/v) NaCl 溶液重悬菌体
1 ml
15 ml
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
C. 方法：涂板、判定转化效率 1. 将菌液分别稀释 10 倍、100 倍，分别吸取 100 µl 稀释液，涂布到相应的 SD 筛选 培养基上。例如： pGBKT7 载体用 SD/‐Trp 培养基 pGADT7 载体用 SD/‐Leu 培养基 pGBKT7 和 pGADT7 共转，用 SD/‐Leu/‐Trp 培养基 注意：不要直接用未稀释的菌液涂板。
50 µl 500 µl 30 min
600 µl 2.5 ml 45 min
6. 加入 DMSO，轻柔混匀
20 µl
160 µl
7. 在 42℃水浴锅中温浴
（注意：期间 Small‐Scale 每隔 5 min，Library‐Scale 每隔 10 min，轻轻倒混几次）
15 min
20 min
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B． 方法：转化酵母感受态细胞 1. 材料 Yeastmaker Yeast Transformation System 2 酵母感受态细胞(Section 6.A) PEG/LiAc (Section 4) 0.9% (w/v) NaCl DMSO 2. 将下列组分加入到已经预冷的无菌离心管中，混合均匀。
2. 30℃恒温箱倒置培养 3–5 天，待菌落长至适宜大小 3. 用下列公式计算转化效率
转化效率 = 单菌落数 X 悬浮细胞液总体积（mL） 涂板的菌液体积（mL) X DNA 总量（ug)
（如果是用 10 倍稀释液或 100百度文库倍稀释液涂板，还要乘以相应的倍数）
例如：转化 100 ng pGBT9 空载体（Yeastmaker Yeast Transformation System 2 的阳性对照质粒），将 1 ml 菌液稀释 10 倍，吸取 100 uL 涂板，培养 3 天后，在 SD/Trp 上长出 300 个单菌落，其转化效率为：
10X TE Buffer
1X
1 ml
1 M LiAc(10X)
1X
1 ml
0.9% (w/v) NaCl 溶液 称取 0.9g NaCl，溶解于 80mL 超纯水中，用容量瓶定容至 100mL，过滤灭菌。
5. 酵母菌株储存条件 如果想要了解更多关于酵母的知识，推荐去看 Guide to Yeast Genetics and Molecular
2. 组分内容
3. 所需的附加材料 A． Clontech 的 Ready‐to‐Go Media Pouches Clontech 提供提供预先混合好的培养基，以方便使用 表 1 酵母转化实验所需要的培养基组分
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
B．培养基的配法 配置好的培养基溶于 500mL ddH2O，121℃高压蒸汽灭菌 15min，在使用前要降 至常温，（液体培养基也可以过滤灭菌）。灭菌时间不能过长。
8. 离心收集菌体
高速离心 15s 700 g 离心 5 min
9. 弃上清，加入 YPD Plus 培养基
（注意：使用 YPD Plus 可提高转化效率 50‐100%，此步骤不要使用普通 YPD 培养基）
1 ml
3 ml
10. 30° C 摇床震荡培养
可忽略此步骤 90 min
11. 离心收集菌体
Clontech 公司提供的预先混合好的培养基不需要调 pH，但是如果配置使用的 ddH2O 偏酸性，就要将 pH 调到 5.8。
关于培养基配置的更多细节可以查询 Clontech Yeast Media Protocol‐at‐a‐Glance (PT4057‐2)。
4. 酵母转化所需溶液 1.1X TE/LiAc 溶液 先配置母液：10X TE buffer 和 1 M LiAc (10X)，转化前再配置工作液，现配现用。 混合 1.1 mL 10X TE buffer 和 1.1 mL 1 M LiAc (10X)，再加入 8.8mL 灭过菌的超纯水， 定容至 10mL，混合均匀。
质粒 DNA（浓度、纯度高） 变性的**Yeastmaker 宿主 DNA (10 µg/µl)
Small‐Scale （1.5 ml tube） 100 ng 5 µl
Library‐Scale （15 ml tube） 5–15 µg* 20µl
（* For example, use 5 µg of bait + 10 µg of prey for yeast two‐hybrid library cotransformation. ）
Biology, by Guthrie & Fink (1991) and Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts, edited by Heslot & Gailardin (1992).
酵母菌在用封口膜封住的 YPD 或 YPDA 培养皿上，4℃可以保持 2 个月。但是新 鲜的菌种（1‐3 周）接菌到液体培养基上后活力更佳。
转化效率=
300 x 1 x 10(稀释倍数） 0.1 x 0.1
=3x105 cfu/μg
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
酵母转化手册 译自 Clontech Yeastmaker™ Yeast Transformation 目录 1. 简介 2. 组分内容 3. 所需的附加材料
A． Clontech 的 Ready‐to‐Go Media Pouches B． 培养基配方 4. 酵母转化所需溶液 5. 酵母菌株储存条件 6. 酵母转化方法 A． 方法：酵母感受态细胞的制备 B． 方法：转化酵母感受态细胞 C． 方法：涂板、判定转化效率 7. 参考文献
System 2
User Manual（PT1172‐1）
图表 表 1：酵母转化实验所需要的培养基组分
本手册仅供学习交流，不做其他用途，如需 word 版本请发送站内信。
1. 简介
Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 提供了一种高效的 PEG/醋酸锂 酵母细胞转化法，本方法适用于所有的酵母转化，包括酵母单杂交系统和酵母双 杂交系统。 此方法提供了一种比常规转化方法更为高效，转化效率更高也更为可信的技术， 如果要筛文库，较高的转化效率是必要的条件，你的文库包含的克隆数越多，你 就越有可能发现新的、稀有的相互作用，此方法之所以较其他方法转化效率更高， 是因为该方法包含一个特殊又重要的步骤：在加入 DNA 和 DMSO 处理后，加入 YPD Plus 液体培养基培养酵母细胞（帮助酵母细胞摄取更多的质粒 DNA）。使用此方 法，可以获得≥3 X 105 转化子/ug 质粒 DNA。