猪卵母细胞化学诱导去核研究

猪卵母细胞化学诱导去核研究

摘要

体外受精（IVF）和单精子注射（ICSI）对于受精机理的研究、野生濒危动物的保护以及男性不育的治疗等方面具有重大意义。但该技术产生的胚胎其卵裂率和囊胚发育率都很低，是目前制约其应用的瓶颈因素。而X精子分选的低效率、高成本、解冻后低活率使它的应用也受到很大的限制。因此，为了提高性控X精子的利用率，充分发挥高产淘汰奶牛的繁殖潜能，本项目将优化和改进IVF和ICSI中比较成熟的一些技术环节，而对卵裂率和囊胚发育率低的关键难题，开展较为详细的研究，以便形成比较完善的性控胚胎体外生产的技术体系，指导性控X精子与高产淘汰奶牛的卵母细胞完成理想的受精，为加速良种奶牛的高效扩繁利用提供新的技术途径。

关键词：奶牛，单精子注射，人工受精

英文翻译部分

1 前言

近年来，体细胞核移植在多种哺乳动物获得成功，相继产生克隆羊、牛、小鼠、山羊、猪、猫、兔、骡子和大鼠，为生命科学、医学制药等诸多领域提供了一个崭新的研究手段。

卵母细胞核物质的去除是克隆技术成败的关键环节之一，卵母细胞的体外成熟是决定克隆胚胎能否最终发育成正常个体的关键。去核效率

的高低与卵母细胞所处的成熟时期及采用的去核方法有密切关系。因此掌握卵母细胞体外成熟时间，快速而准确的去核，对提高去核成功率有重要意义。目前动物克隆中普遍使用是机械去核法（盲吸法），该方法对细胞的机械损伤较大、耗时、技术要求高。如何既能完全去掉卵母细胞的核，又不致对细胞造成更大的损伤是研究者们一直在探索的问题。“化学诱导去核法”去核首次建立于小鼠卵母细胞，用脱羰秋水仙碱（DC）处理激活的卵母细胞，使染色体和极体牢固结合，然后用诱导第二极体排出的放线菌酮(CHX)处理卵母细胞，成功得到克隆小鼠[1~3]。Yin 等把该法也应用于猪卵母细胞的去核[4]。在我国，杜卫华等首次利用化学诱导去核法用于小鼠卵母细胞的去核研究[5]，但对体外成熟培养的猪卵母细胞化学诱导去核研究目前国内尚未见报道。

本研究使用盲吸法和化学诱导去核对不同成熟培养时间的猪卵母细胞进行去核，旨在确定最佳的去核时间；建立猪卵母细胞化学诱导去核方法；同时，通过两种方法的去核效率的比较，为克隆技术研究中卵母细胞去核这一关键环节提供理论依据。

二实验设备及步骤

2.1 所需仪器和设备

CO2培养箱,电子天平，离心机，高压锅，实体显微镜，超净工作台，培养皿，注射器，水浴锅，96孔微量板，试纸，移液器，干燥箱，冰箱。

2.2 实验试剂

TCM199，犊牛血清(FCS)，牛血清蛋白，双抗(青霉素、链霉素)，石蜡油，葡萄糖，丙酮酸钠，L-半胱氨酸，乳酸钠，山梨醇，酚红，L-谷氨酰胺，FSH,NaHCO3,MgCO2.6H2O,CaCl2,生理盐水，LH, PMSG, HEPES .

2.3 溶液配方

（1）mTCM199(卵母细胞成熟培养液)

以TCM199为基础液+3.05mmol/L葡萄糖+0.91mml/L丙酮酸钠+0.57mml/L L-半胱氨酸+75ug/ml青霉素+50ug/ml链霉素+FSH,LH各2mg，溶后通过0.22um滤膜过滤分装，4℃保存备用，培养前加入血清激素，调PH值。

（2）TL-HEPES(洗卵液)

用双蒸水配制，114 mmol/L NaCl；3.2 mmol/L KCl；2 mmol/L NaH CO3；0.34 mmol/L KH2PO4；10 mmol/L 乳酸钠；0.5 mmol/L MgCl2·6H2O；

2 mmol/L CaCl2；10 mmol/L HEPES；0.2 mmol/L丙酮酸钠；12 mmol/L 山梨醇；75ug/ml 青霉素；50ug/ml 链霉素，定容后通过0.22um滤膜过滤分装，4℃保存备用。

三材料和方法

3.1 猪卵母细胞的采集

实验所用卵巢均来自于阿拉尔市屠宰场屠宰的初情期前小母猪。将获取宰场屠废弃的猪卵巢，从胎盘上用剪刀剪下来，置于37℃灭菌生理盐水中（同时加青链霉素），4h 内送回实验室。先用70%的酒精冲洗三次，然后用生理盐水冲洗三次，至于37℃的恒温板上，然后将处理

好的卵巢至于高温灭菌过的培养皿中，用手术刀或者剪刀划破卵泡用事先配好的TL-HEPES(洗卵液)冲洗，冲洗完成后取出残余的卵巢，将培养皿至于显微镜下，寻找卵母细胞然后用移液枪洗出来放在另外一个盛有洗卵液的培养皿中。

3.2卵母细胞的处理

按以下三个方案进行处理，然后观察并统计卵母细胞的成熟情况

1方案一：

10%血清+10ug/ml FSH+10ug/ml LH+1ug/ml E2+（0、5、10、15、20ug/ml EGF 表皮生长因子）

方案一结果统计

方案二

10%血清+10ug/ml FSH+10ug/ml LH+1ug/ml E2+（0、0.5、1、1.5、2ug/ml 谷胱甘肽）

方案二结果统计

方案三

10%血清+10ug/ml FSH+10ug/ml LH+1ug/ml E2+（0、5、10、15、20ug/ml EGF 安纳咖）方案三结果统计