第五章 固定化酶讲解
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1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、 明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子 化合物
网格型
微囊型
聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
高。
3．对不同pH稳定性、对蛋白酶稳定性、 贮存稳定性和操作稳定性都有提高。
青霉素酰化酶于不同温度下保温6小时
稳定性提高的原因：
① 固定化后酶分子与载体多点连接，可防 止酶分子伸展变形。
② 酶活力的缓慢释放。
③ 抑制蛋白酶的降解, 阻挡了外界不利因 素对酶的侵袭.
（三）固定化酶的最适温度变化 最适温度提高。 （四）固定化酶的最适pH变化 对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发 生偏移。
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的 高聚物网络。 海藻酸钠：
可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。 卡拉胶：
冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。
• 优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收 率较高。
• 缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小 分子底物和产物的酶。
• 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落 等。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
3）叠氮法
• 对含有羧基的载体，与肼作用生成含有酰肼的载 体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于 酶偶联 。
4．交联法 • 用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交
联的固定化方法。
• 不使用载体 • 常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双
重氮联苯胺等。
• 酶的反应基团：N末端的α -氨基或赖氨 酸ε -氨基、酚基、 巯基和咪唑基等。
2．分配效应和扩散限制效应
• 分配效应：是由于固定化载体所带电荷 及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以 及其他效应物在微观环境与wenku.baidu.com观体系间 发生了不等分配，改变了酶反应系统的 组成平衡，从而影响酶反应速度的一种 因素。
扩散限制效应：指底物、产物以及其他 效应物的迁移和运转速度受到限制的一 种效应。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
泵 反应产物
消
离心机
旋
反
应
器
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
二 、固定化方法
1．物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化 方法。
• 常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、 纤维素、树脂。
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏 和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定； ③可以在较长时间内进行反复分批反应 和装柱连续反应； ④ 酶反应过程能够加以严格控制； ⑤ 较游离酶更适合于多酶反应。
原因：微环境表面电荷性质的影响。 • 带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，
即向碱性偏移。 • 带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。 • 载体与底物电荷相同：表观Km值显著
上升；
• 载体与底物电荷相反：Km ？
四、影响固定化酶性能的因素
能力。 • 活力单位：定义为每毫克干重固定化酶
(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μ mol·min-1·mg-1。 • 如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的 反应初速度来表示．即μmol·min-1·cm-2。
二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的 百分数
偶联效率
加入的蛋白量- 溶液中残留的蛋白量 100%
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
• 立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或 是由于固定化的方式与位置不当，给酶 的活性中心或/和调节中心造成了空间障 碍，底物与效应物等无法直接和酶接触， 从而影响酶活性的一种效应。
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团
被交联，酶活损失大，颗粒较小，机械 强度差，使用不便。
5.包埋法
酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透 膜中。
载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、 明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子 化合物
网格型
微囊型
聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶
白高级结构变化，破坏部分活性中心。
常用载体： • 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等
• 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、 咪唑基、酚基等。
常用的活化方法：
1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。
2）溴化氰法： • 载体：含羟基，即多糖类物质。 • 酶的反应基团：氨基
高。
3．对不同pH稳定性、对蛋白酶稳定性、 贮存稳定性和操作稳定性都有提高。
青霉素酰化酶于不同温度下保温6小时
稳定性提高的原因：
① 固定化后酶分子与载体多点连接，可防 止酶分子伸展变形。
② 酶活力的缓慢释放。
③ 抑制蛋白酶的降解, 阻挡了外界不利因 素对酶的侵袭.
（三）固定化酶的最适温度变化 最适温度提高。 （四）固定化酶的最适pH变化 对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发 生偏移。
三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因：
① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
② 固定化后，空间位阻会直接影响到活性 中心对底物的定位作用；
③ 扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻；
(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提
液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之 开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的 高聚物网络。 海藻酸钠：
可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。 卡拉胶：
冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。
• 优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收 率较高。
• 缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小 分子底物和产物的酶。
• 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落 等。
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。
• 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤 维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶 高级结构变化少，酶活力损失很少。
3）叠氮法
• 对含有羧基的载体，与肼作用生成含有酰肼的载 体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后于 酶偶联 。
4．交联法 • 用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交
联的固定化方法。
• 不使用载体 • 常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双
重氮联苯胺等。
• 酶的反应基团：N末端的α -氨基或赖氨 酸ε -氨基、酚基、 巯基和咪唑基等。
2．分配效应和扩散限制效应
• 分配效应：是由于固定化载体所带电荷 及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以 及其他效应物在微观环境与wenku.baidu.com观体系间 发生了不等分配，改变了酶反应系统的 组成平衡，从而影响酶反应速度的一种 因素。
扩散限制效应：指底物、产物以及其他 效应物的迁移和运转速度受到限制的一 种效应。
• 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿 过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞 的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限 制。
• 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到 颗粒内部酶所在位点所受到的限制。
第二节评价固定化酶(细胞)的指标
一、固定化酶(细胞)的活力 • 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。
① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生 偶联反应。
② 在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二 醛），然后将酶偶联上去。
• 优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化酶 柱子
泵 反应产物
消
离心机
旋
反
应
器
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
二 、固定化方法
1．物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化 方法。
• 常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、 纤维素、树脂。
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏 和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定； ③可以在较长时间内进行反复分批反应 和装柱连续反应； ④ 酶反应过程能够加以严格控制； ⑤ 较游离酶更适合于多酶反应。
原因：微环境表面电荷性质的影响。 • 带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，
即向碱性偏移。 • 带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。 • 载体与底物电荷相同：表观Km值显著
上升；
• 载体与底物电荷相反：Km ？
四、影响固定化酶性能的因素
能力。 • 活力单位：定义为每毫克干重固定化酶
(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μ mol·min-1·mg-1。 • 如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的 反应初速度来表示．即μmol·min-1·cm-2。
二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的 百分数
偶联效率
加入的蛋白量- 溶液中残留的蛋白量 100%