水稻转化培养基组份
培养基的种类
培养基;1、麸皮培养基:（黄曲霉）100g麸皮，900g水，煮沸20分钟，用四层纱布过滤，得到的清液中加入1g酵母粉，加水定容至1L, 121℃灭菌30 min.2、( 马铃薯琼脂 )培养基（禾谷镰刀菌）马铃薯2 0 0克琼脂1 5~一2 0 克自来水2 0 0 0毫升将去皮切片的 2 0 0克马铃薯,放入1 0 0 0毫升水中煮沸,3 0分钟,以纱布滤取汁液,补足水量,再加琼脂,热溶,经 1 21 ℃,2 0 ~ 3 0分钟高压灭菌3 、察氏培养基 (曲霉）硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4•7H2O) 0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。
用途：青霉、曲霉鉴定及保存菌种用。
4、瓦克斯曼培养基（Waksmen培养基）：选用商品培养基或按如下方法配制。
：蛋白胨 5.0gKH2PO4 1.0gMgSO4•7H2O 0.5g琼脂 20.0g蒸馏水 1000ml加热溶解后，用0.5mol/L H2SO4调节pH到3.8～4.0，加入10g葡萄糖，121℃蒸汽灭菌10分钟。
5、在察氏琼脂培养基上菌落生长较快，10d—14d直径3cm—4cm或4cm～7cm,最初带黄色，然后变为黄绿色，老后颜色变暗，平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。
在低倍显微镜下观察可见分生孢子头疏松放射状，继变为疏松柱状。
分生孢子梗多从基质生出，长度一般小于1mm。
有些菌丝产生带褐色的菌核。
制片镜检观察可见分生孢子梗极粗糙，直径10um～20um。
顶囊烧瓶形或近球形，直径10um～65um，一般多为25um—45um。
全部顶囊着生小梗，小梗单层、双层或单、双层同时生在一个顶囊上；梗基（6um—10um）*（4um～5.5um)，小梗（6.5um—10um）*（3um—5um）。
分生孢子球形、近球形或稍作洋梨形，3um—6um，粗糙。
1.3镰刀菌属本属的产毒舞茵主要包括禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、雪腐镰刀菌、三线镰刀菌、梨孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌等。
常用缓冲液及培养基配方
常用缓冲液及培养基配方LB液体培养基：Bacto-蛋白胨10g酵母抽提物5g氯化钠10g加950ml蒸馏水溶解，用5N氢氧化钠调pH至，定容至1000ml，高压灭菌后保存。
LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入12g琼脂粉，高压灭菌后保存。
SOB液体培养基Bacto-蛋白胨20g酵母抽提物5gNaCl加950 ml水溶解，加入250mmol/L KCl 溶液10ml，用5 N NaOH调pH至，定容至1000 ml，高压灭菌后保存。
使用前加入5ml经灭菌的2mol/LMgCl2。
SOC液体培养基SOB中加入经灭菌的葡萄糖溶液至终浓度为20mmol/L。
麦康凯固体培养基每1000ml水中加52g培养基粉，煮沸溶解后分装，高压灭菌。
NA固体培养基牛肉浸膏3g酵母浸膏1g蛋白胨蔗糖琼脂粉5g 10g 15g加950ml蒸馏水溶解，调pH至，定容至1000ml，高压灭菌后保存。
TB培养基：将以下组分溶解在0.9L水中：Bacto-蛋白胨12g酵母抽提物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。
冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4 mol/L K2HPO4的溶液。
高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌。
溶液Ⅰ葡萄糖g 50mmol/L1mol/L Tris·Cl(pH8.0) 6.25ml 20mmol/L0.5mol/L EDTA(pH8.0) 5ml 10mmol/L调pH至后，用水定容至250 ml，高压灭菌后保存。
溶液Ⅱ10 mol/L NaOH 2ml10% SDS 10ml用水定容至100 ml，现配现用。
溶液Ⅲ5 mol/L 醋酸钾60ml冰醋酸水高压灭菌后保存。
高盐TE缓冲液10mmol/L Tris.Cl, pH 8.0*0.1mmol/L EDTA, pH 8.0*1mol/L NaCl于室温保存〔可在几年内保持稳定〕CTAB抽提液2%〔w/v〕CTAB(古立烷基三乙基溴化铵)100mmol/L Tris.Cl,pH 8.0 *于室温保存〔可在几年内保持稳定〕CTAB/NaCl 溶液〔10% CTAB/0.7mol/L NaCl〕在80ml H2O中溶解4.1g NaCl,缓慢加入10一CTAB〔十六烷基三乙基溴化铵〕，同时加热并搅拌。
水稻农杆菌转化方法
方法1NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L)KNO3 2830 mg/L(NH4)2SO4 463 mg/LKH2PO4 400 mg/LMgSO4.7H2O 185 mg/LCaCl2.2H2O166 mg/LFeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8H3BO3 3 mg/L 1.6ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025KI 0.75 mg/L 0.8盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5肌醇myo-inositol 100 mg/L 100水解酪蛋白300 mg/L谷氨酰胺500 mg/L脯氨酸500 mg/L蔗糖30,000 mg/LPHytagel 2.6 mg/LpH 5.8Basic培养基B N6（大量）50ml （20倍）A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/LS B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/LC proline 0.5g/L glutamine 0.5g/LN6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀.3 CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O4 配好后放于棕色瓶4℃保存MS(大量籼稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO31900 mg/L38g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L养NH4NO3 1650 mg/L33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L8.8 g/L基KH2PO4170 mg/L 3.4 g/L制备1 KNO3, NH4NO3, Mg SO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,3 CaCl2.2H2O同KH2PO44 配好后放于棕色瓶4℃保存Ms(大量花药用)终浓度母液(20倍) 终浓度母液元素KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L培养(NH4)2SO4 231 mg/L 4.62 g/L CaCl2.2H2O 160 mg/L3.2 g/L基KH2PO4641 mg/L12.82 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O3 配好后放于棕色瓶4℃保存YM脓杆菌培养基KH2PO4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine2g/LNaCl 0.2g/L M g SO40.2g/L Yeast extract0.3g/LAgar 15g/L PH=7.0诱导愈伤、继代培养基basic+2,4-D(2mg/L) PH=5.8共培养培养基液体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)+ 肌醇2g/L+ CH500mg/L+phytogel+0.1%AS固体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同) + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+2,4-D (2mg/L)+ phytogel +0.1%ASPH=5.5 加2,4-D前后都要调PH值.灭完菌,温度降下来后加AS筛选培养基诱导愈伤+cef(300mg/L)+hyg(50mg/ml) PH=5.5一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降分化1: basic+KT(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)培养2: basic+KT(0.5mg/L)+NAA(0.25mg/L)+6-BA(2mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)基PH=5.8分化培养基NB培养基：6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg壮苗培养基(生根)sucrose 30g/L N6 25ml/L MS-Fe盐10ml/LB5vita 10ml/L agar 7g/LMS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)终浓度母液(100倍)FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/LNa-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L制备1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4℃保存2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.配好后4℃保存NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4℃保存PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存6-BA母液(1g/ml) 用HCl溶解, 加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解AS（乙酰丁香酮）用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管KT 母液(5mg/ml)用1NKOH溶解，用水稀释定容到10ml，过滤灭菌后分装到EP管中，冰冻保存B5 vitamin终浓度母液(100倍) 终浓度母液(100倍)肌醇100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l0.1g/lpyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L1 g/l棕色瓶4℃保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中B5(micro)KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/LNa2MnO4.2H2O 0.25mg/LCuSO40.025mg/L CoCl20.025mg/L程序1.种子去皮，挑成熟完整健康的种子2.用70%乙醇清洗浸泡2-3分钟，洗3-4次，用0.1%升汞浸泡20-40分钟3.无菌水洗3至4次4.置于虑纸上吹干,吹3小时以上5.摆放到诱导愈伤培养基上，黑暗中培养15-20天，直到长出黄色较大的愈伤6.剥下愈伤，转至继代培养基上，黑暗培养2周7.共培养。
水稻转化方法
水稻转化方法1．愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
转基因的步骤
1.5 农杆菌介导的水稻快速转化1.5.1 各种培养基成分水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。
其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。
1.5.2 种子的消毒（1）水稻成熟种子去壳；（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。
1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
1.5.4 浸染液的制备（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。
1.5.5 愈伤组织侵染和共培养（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；（6）在25℃、黑暗条件下共培养3d。
1.5.6 抗性愈伤的筛选（1）共培养愈伤组织的洗涤：取出共培养的愈伤组织，放入含400mg/L 羧苄青霉素的抑菌液中清洗，共洗 5 次，每次浸泡6min左右；（2）倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；（3）将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出，需两周左右。
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。
仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。
挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。
离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。
将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。
转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。
将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
农杆菌介导转化水稻所用培养基-1-1 626蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。
水稻的遗传转化
水稻的遗传转化1）种子消毒：用75%乙醇浸泡去皮的水稻种子1min（剧烈摇动），再用2.5%的次氯酸钠分别处理两次，每次15min，然后用无菌水冲洗3-5次后均匀铺于诱导培养基上，不宜过多，一个培养皿大概14-20粒。
2）水稻愈伤组织的诱导和继代培养：消毒好的成熟种子在诱导培养基上28℃暗培养25-28天。
待愈伤组织长至合适大小，在培养基中来回剧烈摇动几次，使一些小块愈伤从大的组织块上脱离，从中挑选光滑、淡黄色、较硬、大小在2-3mm的胚性愈伤，均匀铺放在继代愈伤培养基上，28℃避光培养7-8天，即可用于农杆菌转化。
3）农杆菌介导的水稻愈伤组织转化及共培养：刮取已活化3天的农杆菌，放入液体共培养培养基中，用力打散，置摇床摇培0.5-2h，使得菌液的OD600在0.1-0.15（0.125最宜）之间。
将挑选的愈伤组织小粒放入已加农杆菌的液体培养基中，轻轻摇动几次，放置15-20min。
倒去菌液，用无菌滤纸吸干均匀的铺在已加滤纸的共培养基中。
愈伤在共培养培养基中22℃条件下暗培养3天。
4）转化愈伤组织的选择培养：共培养后的愈伤先用灭菌水洗涤三次，后用含头孢500mg/L的灭菌水浸泡30min，期间轻轻摇动，之后用滤纸吸干，均匀铺放在选择培养基上，28℃暗培养10天，之后进行第二次筛选，挑选淡黄色、生长状态良好的愈伤，均匀铺放在含潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃暗培养15天。
5）愈伤组织的分化培养：挑选黄色、圆形的愈伤组织，均匀铺放在预分化培养基上，28℃暗培养7天。
之后挑选生长状态良好、淡黄色的胚性愈伤，放入分化培养基上，28℃光照培养30-60天左右，直至转基因小苗长出。
中间每隔25天左右将愈伤转移到新鲜的分化培养基上。
6）水稻的壮苗培养与移栽：将长出的小苗去掉周围的愈伤，在无菌条件下转移到1/2MS的壮苗培养基中，使根部浅插入培养基中，28℃光照培养（14h光/10h暗）。
当苗长至瓶口、约10cm以上时，打开瓶口所覆塑料膜，瓶内加入约1/3 的水，使苗暴露于空中炼化培养。
水稻育苗基质配方
水稻育苗基质配方
水稻育苗基质配方是指在水稻育苗过程中所使用的培养基配方。
水稻育苗基质的配方不仅能直接影响到水稻的生长发育，还能影响到水稻的产量和品质。
因此，选择合适的水稻育苗基质配方非常重要。
水稻育苗基质的配方通常由多种材料组成，包括有机材料、无机材料和微生物材料等。
有机材料可以提供水稻所需的营养元素和有机质，常用的有机材料有腐殖土、腐熟堆肥等。
无机材料可以提供水稻所需的无机元素和矿物质，常用的无机材料有珍珠岩、蛭石等。
微生物材料可以提供有益微生物，对水稻的生长发育有积极作用。
在配方设计中，需要考虑水稻在不同生长期的需求，以及不同基质材料之间的相互作用。
在实际应用中，要根据具体情况进行调整，才能达到最佳的育苗效果。
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水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因一、实验目的1.学习水稻组织培养的方法2.学习水稻转基因的方法二、实验原理目的基因克隆到双元载体中，双元载体转入农杆菌，然后携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，通过T-DNA插入，把我们的目的基因整合到水稻染色体上。
历史：农杆菌感染受伤的植物产生冠瘿瘤病，发现是由Ti质粒引起，同时做杂交，发现只有T-DNA（transferred DNA）这一部分被整合到植物染色体上了。
三、试验步骤：一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
水稻遗传转化步骤
实验流程：种子灭菌（ms+, 28天，暗培养，28℃）---愈伤继代（ ms,7天，28℃自然光照）--转化共培养（co,暗培养3天，上面放一层滤纸19℃，很重要！）---第一次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第二次选择（S500，暗培养15天，28℃）---第三次选择（选抗性愈伤，S250，暗培养7天，28℃）---预分化（m,暗培养8天，28℃）---第一次分化（f,先暗培养2天，28℃，后光照13天）---第二次分化（ f，光照15天）---壮苗（1/2，光照，时间不定）种子灭菌：（1）用75%酒精泡5分钟，倒出酒精，加2.5%次氯酸钠摇10分钟以上（2）倒出次氯酸钠，再加2.5%次氯酸钠15-20分钟，猛烈摇动，在超净台上倒去次氯酸钠，用灭菌水洗10次以上，然后放于滤纸上吸干，接种于ms+培养基。
共培养处理：种子愈伤处理28天左右，挑优质愈伤继代培养一次，挑颗粒用农杆菌浸泡15分钟，共培养三天后，挑无褐色愈伤颗粒，用灭菌水洗三次，放入NBL中，摇床摇2小时（200rpm），滤纸吸干后放入筛选培养基S中。
培养基配制；接种培养基（ms+）MS大量，微量，有机，2，4-D（2mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸2.8g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l接种继代培养基（ms）MS大量，微量，有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Phytagel 3g/l共培养培养基（co，pH5.3）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l），蔗糖30g/l，葡萄糖10g/l，phytagel（3g/l），灭菌后加AS20mg/lNBL：就是co加上头孢500mg/l，不加AS选择培养基S500N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢500mg/l，潮霉素50mg/l抗性愈伤继代培养基（S250）N6大量，B5微量，B5有机，2，4-D（1mg/L）Fe-EDTA，硝酸银1ml/l，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l成熟培养基（m）N6大量，B5微量，B5有机，NAA1mg/l，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l, 脯氨酸0.5g/l, 水解酪蛋白0.3g/l, phytagel3g/l灭菌后加头孢250mg/l，潮霉素50mg/l，ABA3mg/l，BA2mg/l分化培养基（f）N6大量，B5微量，B5有机，NAA0.5mg/l, Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l,水解酪蛋白0.3g/l, phytagel4.6g/l灭菌后加BA3mg/l壮苗培养基（1/2）MS大量，微量，有机，Fe-EDTA，肌醇（0.1g/l）,蔗糖30g/l，Agar5.8g/l 注：2，4-D浓度为2mg/l，溶于0.1NNaOH或酒精硝酸银浓度为0.85mg/ml，避光保存。
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果，通过构建基因表达载体，将目的基因导入水稻细胞中，从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料：水稻品种为南桂占，农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105，目的基因（GFP基因）载体为pBI121。
2. 试剂：农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆：将GFP基因从质粒载体pBI121中切出，插入到农杆菌载体pBin19中，构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化：将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中，在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合，用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上，28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒：将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染：将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上，用无菌滤纸轻轻擦拭叶片，使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导：将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中，28℃条件下培养5-7天，诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选：将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中，28℃条件下培养3-4周，筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生：将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中，28℃条件下培养2-3周，诱导再生植株。
9. 抗性鉴定：将再生植株种植于田间，对植株进行潮霉素筛选，筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测：对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测，验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆：成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化：农杆菌转化效率较高，大部分叶片出现愈伤组织。
常用缓冲液及培养基配方
常用缓冲液及培养基配方LB液体培养基：Bacto-蛋白胨10g酵母抽提物5g氯化钠10g加950ml蒸馏水溶解，用5N氢氧化钠调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。
LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入12g琼脂粉，高压灭菌后保存。
SOB液体培养基Bacto-蛋白胨20g酵母抽提物5gNaCl 0.5g加950 ml水溶解，加入250mmol/L KCl 溶液10ml，用5 N NaOH调pH至7.0，定容至1000 ml，高压灭菌后保存。
使用前加入5ml经灭菌的2mol/LMgCl2。
SOC液体培养基SOB中加入经灭菌的葡萄糖溶液至终浓度为20mmol/L。
麦康凯固体培养基每1000ml水中加52g培养基粉，煮沸溶解后分装，高压灭菌。
NA固体培养基牛肉浸膏3g酵母浸膏1g蛋白胨蔗糖琼脂粉5g 10g 15g加950ml蒸馏水溶解，调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。
TB培养基：将下列组分溶解在0.9L水中：Bacto-蛋白胨12g酵母抽提物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。
冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/ 0.72 mol/L K2HPO4的溶液。
高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌。
溶液Ⅰ葡萄糖2.25 g 50mmol/L1mol/L Tris·Cl(pH8.0) 6.25ml 20mmol/L0.5mol/L EDTA(pH8.0) 5ml 10mmol/L调pH至8.0后，用水定容至250 ml，高压灭菌后保存。
溶液Ⅱ10 mol/L NaOH 2ml10% SDS 10ml用水定容至100 ml，现配现用。
溶液Ⅲ5 mol/L 醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml高压灭菌后保存。
高盐TE缓冲液10mmol/L Tris.Cl, pH 8.0*0.1mmol/L EDTA, pH 8.0*1mol/L NaCl于室温保存（可在几年内保持稳定）CTAB抽提液2%（w/v）CTAB(古立烷基三乙基溴化铵)100mmol/L Tris.Cl,pH 8.0 *1.4mol/L NaCl于室温保存（可在几年内保持稳定）CTAB/NaCl 溶液（10% CTAB/0.7mol/L NaCl）在80ml H2O中溶解4.1g NaCl,缓慢加入10一CTAB（十六烷基三乙基溴化铵），同时加热并搅拌。
水稻原生质体制备及转化实验方法
单子植物叶片原生质体分离与转化水稻原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片40um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机（水平转子）滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2.材料准备水稻种子，先用75%乙醇漂洗1分钟，再用30%次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上。
放在1/2 MS培养基上培养2周左右，26℃，12h光照（150 umol m-2s-1）。
使用大玻璃培养杯培养，每瓶可放15粒种子。
40~60株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个质粒。
3.原生质体分离（1）选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，去除水稻顶部的叶子和茎干小的叶鞘，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块，可以20~30个放在一起切开；比例大约15ml酶解液/1g材料；（2）切开后立刻转移到0.6M Mannitol溶液中，避光放置10分钟；（3）过滤掉Mannitol溶液，将其转移到配好的酶解液中，避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光酶解5-6小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用40um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）250 g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清；（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（8）加10ml W5重悬原生质体，250g离心3分钟，弃上清；（9）加适量MMG溶液重悬，原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。
（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。
）4.原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10~20分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，250g水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或28℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
水稻转化方法
水稻转化方法配置1升诱导培养基：1.水解酪蛋白300 mg/L2.谷氨酰胺500 mg/L3.脯氨酸500 mg/L4.肌醇100 mg/L5.蔗糖30g/L6.PHytagel 2.6 mg/LN6大量50毫升，B5微量5毫升，B5维生素5毫升，铁盐毫升，2,4-D母液2毫升，pH 5.85.1水稻转化受体的准备5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟，进行表面灭菌。
(灭菌时要经常搅拌)用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。
在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。
约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
5.1.2水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。
约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。
以后每两周继代培养一次。
挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。
成熟季节的天气；颖壳和种皮表面没有麻点（病斑）；按成熟度分开（青米优于完熟米）注意：粳稻不适宜用NaClO灭菌。
5.2农杆菌的培养将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线，28℃黑暗培养2-3天，用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为CM液体培养基中，调整菌体浓度至OD600100mΜ，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
水稻原生质体分离及转化
水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。
溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2•2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。
2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
发酵培养基组分构成
发酵培养基组分构成
发酵培养基的组成可以根据不同需求而有所差异，以下是一般发酵培养基的常见组分构成：
1. 碳源：提供微生物进行代谢的碳源，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖等。
2. 氮源：提供微生物进行蛋白质合成等代谢活动所需的氮源，常见的有氨基酸、蛋白胨、尿素等。
3. 矿质盐：提供微生物进行生长和代谢所需的矿质元素，如钠、钾、镁、铁等。
4. 生长因子：某些微生物对于生长需要特定的生长因子，例如维生素、核酸等。
5. 缓冲剂：维持培养基的酸碱度，常见的有磷酸盐缓冲剂、琼脂糖等。
6. 氧气：某些微生物需要氧气进行呼吸作用，因此需要提供适量的氧气。
7. pH指示剂：用以指示发酵培养基的酸碱度，方便监测微生物的生长情况。
以上是一般发酵培养基的常见组分构成，根据具体需要，可能还会添加其他特殊的组分。
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水稻转化培养基组份
N6D2: 1L pH5.8
1)N6 Nutrient Stock
N6大量(20X) 50ml
N6微量(20X) 50ml
2) Iron Stock (100X) 10ml
3) Vitamine Stock
烟酸1mg/ml 0.5ml
VB1 1mg/ml 0.1ml
VB6 1mg/ml 0.5ml
Glycine 2mg/ml 1ml
肌醇50mg/ml 2ml
4) Sucrose 30g
5) 2,4-D 2mg/ml 1ml
6) Casein Enzymatic Hydrolysat 1g/l
7) Phytagel 2.0—2.5g/l
N6D2C (for co-culturing)
N6D2 medium
Glucose 10g/l
AS (20mg/ml) to 20mg/l final conc.
N6D2S1（for selecting）
N6D2 medium
Hygromycin to 25mg/l final conc.
Cefotaximine to 300—400mg/l final conc. (现用300mg/l)
N6D2S2 (for selecting)
N6D2 medium
Hygromycin to 50mg/l final conc.
Cefotaximine to 200mg/l final conc.
预分化
200ml ddH2O中加入0.5g phytagel, 灭菌
再依次加入Higrow Rice Medium 50X Salts I, II, III 各4ml,
微波炉加热消毒灭菌, 加入hygromycin 50mg/l,
Cefotaximine 200mg/l.
分化培养基MSRCH pH 5.8
1)MS
2)0.25g/l 水解酪蛋白CH (可不加)
3)Sucrose 30g/l
4)phytagel 2.5g/l
5)激素终浓度
6-BA 2mg/l
NAA 0.2mg/l
Zeatin 0.2mg/l
KT 0.5mg/l
6)Hygromycin 50mg/l
Cefotaxime 200mg/l
*MS 培养基1L
1. MS大量(20X) 50ml
MS微量(100X) 10ml
2. Fe-EDTA (100X) 10ml
3. Vitamine
烟酸0.5mg/l
VB6 0.5mg/l
VB1 0.1mg/l
Glycine 2mg/l
肌醇100mg/l
1/2MS培养基(生根培养基) 1L pH5.8
1. 1/2MS盐分
MS大量(20X) 25ml
MS微量(100X) 5ml
Fe-EDTA (100X) 5ml
2. MS维生素
3. 多效唑1mg/l
4. NAA 0.5mg/l
5. Sucrose 30g/l
6. Phytagel 2.g
7. Hygromycine 50mg/l
AAM培养基1L pH5.2 8磅灭菌
1. AA大量(20X) 50ml
2. AA微量(100X) 10ml
3. Fe-EDTA (100X) 10ml
4. Vitamine
烟酸0.5mg/l
VB6 0.5mg/l
VB1 1mg/l
Glycine 2mg/l
肌醇100mg/l
5. AA
L-Gln 880mg/l
L-Asp 270mg/l
L-Arg 230mg/l
L-Gly 80mg/l
6. CH (水解酪蛋白) 500mg/l 可不加
7. Sucrose 68.5g/l
8. Glucose 36g/l
AB 1L pH7.2 8磅灭菌
AB大量(20X) 50ml
AB微量(100X) 10ml
Fe-EDTA (100X) 1ml
Glucose (无水) 5g
*N6培养基母液：
Nutrient Stock: (20X) Stock conc. Final conc.
大量: KNO3 56.6g/l 2.83 g/l (NH4)2SO4 9.26g/l 463 mg/l
KH2PO4 8.0 g/l 400 mg/l
MgSO4.7H2) 3.7 g/l 185 mg/l
CaCl2.2H2O 3.3 g/l 166 m g/l
微量: MnSO4.H2O 66 mg/l 3.3 mg/l ZnSO4.7H2O 30 mg/l 1.5 mg/l
H3BO3 32 mg/l 1.6 mg/l
KI 16 mg/l 0.8 mg/l
*Iron Stock (100X)
FeSO4.7H2O 2.8 g/l 28 mg/l
Na2EDTA 3.7 g/l 37 mg/l
Macronutrients (20x): g/L
*独立溶解后加入。
Micronutrients (100x) : mg/L。