3-8高效液相色谱法应用举例
高效液相色谱法及其应用
高效液相色谱法
基本概念 分离原理 系统结构 分析方法 实际应用
色谱法（Chromatography）
希腊语chroma(色)和graphos(谱)
石
油
1903年
醚
俄罗斯植物学家
Tsweet茨维特
植物色素 玻璃柱 CaCO3 石油醚淋洗
色谱分析法的定义
色谱分析法是一种物理化学 分离方法,其分离原理是：溶于流 动相(石油醚)中的样品(植物色素) 各组分经过固定相 (CaCO3)时，其 与固定相发生吸附、分配、离子吸 引、排阻、亲和等相互作用，且其 作用的大小、强弱不同，导致在固 定相中滞留的时间也不同，从而先 后从固定相中流出，实现了不同组 分的分离。当分离后的组分由流动 相携带进入检测器时，就得到了一 个一个的色谱峰。
• （3）内标物的性质和浓度尽量与预测定峰的接 近。
• （4）内标物是样品中不存在的，与样品各组分、 柱填料和移动相不发生化学反应。
• 根据组分百分含量与其色谱峰面积成正比的 关系进行计算：
HPLC的日常操作条件
最好是恒温、恒湿 温度：15—30℃ 相对湿度<80%
房间应有良好的通风 避免光线直射 远离高电磁干扰、高振动设备
色谱柱的选择应考虑：
➢固定相类型的选择, 主要取决于样品及其分离模式； ➢ 柱填料的结构, 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表 面、平均孔径和孔容等； ➢ 柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度
色谱柱的分离效率（简称柱效），可定 量地用理论塔板数N来表示。
柱
效
检
测
次序：尿嘧啶/苯酚/ 4-氯硝基苯/甲苯
用待测组分标准物制备一系列标准溶液，在选定的色 谱条件下取一定体积的标准溶液进样分离，用待测组分的 峰面积对浓度做标准曲线，此标准工作曲线应是通过原点 的直线。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。
高效液相色谱仪分析应用实例
高效液相色谱仪分析应用实例《高效液相色谱仪分析应用实例》由南京科捷为您收集提供,液相色谱应用实例包括环境气体分析、药物分析、食品分析、生物制药等方面的液相色谱应用实例。
例 1.稠环芳烃分析 (环境气体分析样品:含六苯并苯等 8种稠环芳烃的混合物色谱仪:“南京科捷LC600”液相色谱仪,配有色谱工作站检测器:UV 紫外检测器, 340nm色谱柱:C 18键合相(ODS-224 ,5μm ,柱长 25cm ,柱径 4.6mm流动相:甲醇 -二氯甲烷(8:2混合溶剂流速:1mL/min进样:20μL结果:所有组分在 25min 之内全部流出,各组分完全分离,组分出峰顺序为:六苯并苯,二苯二萘嵌苯,三苯二萘嵌苯,苯萘并二萘嵌苯,四苯二萘嵌苯,萘六苯并苯,二苯萘并二萘嵌苯,苯菲并五苯。
例 2.磺胺分析(药物分析样品:磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲基异噁唑和甲氧苄氨嘧啶的混合物色谱仪:“南京科捷LC600”液相色谱仪, 740色谱数据处理机检测器:UV 481型紫外检测器,波长 240nm色谱柱:μ-Bondapak C18 , 5μm ,柱长 25 cm,柱径 4.6 mm流动相:由 KH 2PO 4(0.05mol/L和 Na 2HPO 4(0.05 mol/L以及 MeOH 所组成,其用量比例为 200:10:165, 流速:1mL/min进样:10μL结果:所有组分在 6min 之内全部流出, 各组分完全分离, 组分出峰顺序为:磺胺保留时间为 2.60 min, 磺胺嘧啶保留时间为 3.18 min、磺胺甲基异噁唑保留时间为4.33 min,甲氧苄氨嘧啶保留时间为 5.19min 。
例 3.银杏内酯分析(药物分析样品:含银杏苦内酯等 4种物质的混合物色谱仪:“南京科捷LC600”液相色谱仪配有 570自动进样器, Rheadyane 77251进样阀, HP 化学工作站检测器:500型 ELSD Alltech 蒸发光散射检测器漂移管温度为 91℃,氮气流速为 2.75L/min色谱柱:Platinum OPS, 5μm ,柱长 25cm ,柱径 4.6mm流动相:水 :甲醇 :四氢呋喃 = 75:20:10流速:1mL/min进样:10μL结果:所有组分在 15min 之内全部流出,各组分完全分离,组分流出顺序为:峰 1为银杏苦内酯 C, 峰 2为白果内酯 , 峰 3银杏苦内酯 A, 峰 4为银杏苦内酯 B 。
高效液相色谱仪应用实例
高效液相色谱仪应用实例
高效液相色谱仪（HPLC）作为一种常用的分析仪器，在许多领域都有广泛的应用。
下面将介绍几个HPLC的应用实例。
1. 药物分析：HPLC可以用于药物分析，例如分离和定量分析常用的药物成分、药代动力学研究等等。
同时，HPLC在药物筛选中也有广泛的应用。
2. 食品分析：HPLC可以用于检测食品中的添加剂、污染物以及营养成分等等，例如酸奶中的乳酸、果汁中的维生素C等等。
3. 生化分析：HPLC在生化领域也有广泛的应用，例如分离和定量分析蛋白质、核酸、糖类等等。
4. 环境分析：HPLC可以用于环境污染物的检测和分析，例如空气中的有机污染物、水中的有机物和重金属等等。
总之，HPLC作为一种常用的分析仪器，具有广泛的应用前景，可以帮助科学家们更好地了解和探索各个领域的问题。
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高效液相色谱方法及应用
高效液相色谱方法及应用
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是现代分离科学与分析技术领域中最常用的高效分离方法之一。
这种方法是在正常压力下，通过液相在固定的填料（指填充某种化学柱内的多孔性固体）中进行分离和分析的一种方法。
通过选择不同的填料和溶剂体系，可以对各种化合物进行有效的分离和测量。
高效液相色谱在医药制造、食品工业、环境监测等领域中具有广泛应用。
例如，在医药制造中，高效液相色谱可用来监测成分，以确保产品的质量和一致性。
在食品工业中，高效液相色谱可用来检测食品中的添加剂、残留物和化学污染物。
在环境监测中，高效液相色谱可用于监测水和土壤中的化学污染物和有害物质。
除了分离和分析外，HPLC还可用于制备纯度高、精确含量的化合物。
HPLC方法的发展还为分析化学领域的发展提供了新的思路和技术，如串联质谱（MS/MS）和毛细管电泳（CE）等分离技术的发展和应用，更无疑地推动了生命科学和制药领域的进步。
实例解析——高效液相色谱(HPLC)
实例解一一高效液相色谱(HPLC)一、原理利用不同物质在两相中(液液、液固、离子交换、尺寸排阻)具有不同的分配系数，当二者相对运动时候，物质在两相中反复多次分配，从而使得物质得到完全分离二、适用范围高沸点、热不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物、离子型样品、生化样品三、特点高压、高效、高灵敏度四、仪器组成流动液贮存提供脱气，输液系统、进样系统、分离系统、检测系统，控制记录系统贮液瓶、高压泵、进样器、分离柱、检测器、记录仪五、仪器选择由实验条件确定是选用二元高压还是四元低压、一般来说，二元高压的准确度较高。
四元低压是先将样品按比例混合再泵入，而二元高压是先泵入不同比例的溶剂再混合。
确定采用的脱气系统，一般采用在线脱气。
确定进样方式，人工手动六通阀进样，还是进样针自动进样，一个适用于少量样品，一个适用于大量样品。
选择检测器，如果是有较强的紫外吸收的可用紫外可见检测器(二极管阵列检测器)，如果是芳香族化合物，可选用荧光检测器，对于离子可采用电导检测器。
六、实验条件优化配置待测物质的标准溶液1、色谱柱的确定分析样本确定是采用何种类型的色谱柱(1)分配色谱，两项间分配系数流动相选用极性的物质(甲醇、乙腈、水)则固定相选择非极性物质。
一般用C18 ODS 柱。
(2)吸附色谱，(3)离子交换色谱各种离子与树脂上交换集团的交换能力不同。
固定相：离子交换树脂，流动相为无机酸、无机碱。
常用于分离离子或者可解离的化合物(4)排阻色谱法配置含待测物质的标准品溶液，采用不同C18柱分离，检测，对照不同色谱图像，可得到分离效能最高的色谱柱2、最佳流动相梯度洗脱程序的确定梯度洗脱：按照一定的程度，不断改变流动相中个溶剂组成的比例以改变流动相的极性。
将色谱柱上不同的组分洗脱出来。
配置不同的梯度洗脱方案，用标准溶液进行试验，并选取能达到最高分离效能的梯度洗过方案作为最佳流动相梯度洗脱程序3、流动相的确定在分离效能相似条件下选择更经济、毒性小的流动相4、流速确定流速太大，待分离组分来不及与固定相充分作用，故其中的组分较易被洗脱下来，出峰时间变短，而且柱压比较高，会引起泵负荷的增加，进而导致色谱柱的使用命的缩短，色谱峰的分离度变差。
高效液相色谱法的应用
在药品分析鉴定的作用
3 在西药鉴别中的应用 在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中 国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品 主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以 及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别. 4.在体内药物分析中的应用 HPLC由于测定迅速准确，流动相选择范围广，灵敏度高(10-12 g／mL以上)，填充柱种 类多，且可供选择的检测器也多。所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法。在 国内外都很受重视．大多数药物都有紫外吸收，所以最常用的检测器是紫外检测器。 多数药物及内源性物质极性均较大，利用其极性差，可以采用RP-HPLC色谱柱，可获 得良好分离效果。
在药品分析鉴定的作用
1.天然药物分析 天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成 分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标 准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行式，可以判定药材的质量高低。 2..天然药物及复方成药分析 复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当 归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋 补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪 ，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑 血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。 由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民 族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人 口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％ ，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％ 以上的速度增长。HPLC分析 必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。
高效液相色谱在生物制药中的应用
高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。
高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。
以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。
于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。
鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。
随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。
高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。
1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。
高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。
②高效：分离效能高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。
⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。
高效液相色谱有5种类型：1、吸附色谱（Adsorption Chromatography）2、分配色谱（Partition Chromatography）3、离子色谱（Ion Chromatography）4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）5、亲和色谱（Affinity Chromatography）此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点。
高效液相色谱法原理与应用(详细版)课件PPT
保留时间(tR):
调整保留时间(t’R): tR' tR tM
死体积(VM): VMtMF0
保留体积(VR): VR tRF0
调整保留体积(V’R): V R ' tR ' F 0(tRtM )F 0
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2. 色谱分离基本方程
R tR(2) tR(1)
1 2
(W1
W2
)
R: 分离度 tR: 保留时间 t0：死时间 W：峰底宽度
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不同R值的峰重叠情况示意图
R>1.5可以得到基线分离
分离度R反映的是相邻两个峰的分开程度
R太小，两个峰无法彻底分离
R太大，分离时间过长，工作效率低下
一般要求R>1.5，也可遵循行业特殊规定
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色谱分离基本方程
高效液相色谱法原理与应用
参考书 《高效液相色谱及其应用》 《液相色谱检测方法》 《实用高效液相色谱法的建立》
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第1章 色谱基本原理
一、色谱法概述 1. 色谱法的定义与特点 2. 色谱法的分离原理 3. 色谱法的特点 4. 色谱法的分类
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1.色谱法的定义
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校正归一化法
➢推导：
Ci%m mi 100m1
mi m2 mn
100
Ai fi
100
A1f1 A2f2 An fn
Ci%fifA iA i i 10% 0
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➢应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，
高效液相色谱仪(HPCL)的演示应用
（1）类胡萝卜 素的HPLC色 谱行为特征： 通常会选择 450nm左右 的波长。当其 吸光系数已知 时,就可以根 据其峰面积对 化合物进行定 量分析。
（2）固定相 的选择： 在类胡萝卜 素的正相HPLC 分离中,最常 用的固定相是 硅胶
（3）温度 由于其线型 和刚性结构, 类胡萝卜素 分子HPLC条 件的改变比 其它化合物 要敏感的多
食品的化学安全性问题是人们关注的热门课题。食品 是人类生活中不可缺少的必需品。各种食品具有不同的 特性和营养成分，直接关系人体的健康。在食品生产过 程中往往需要添加防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素、 甜味剂、保鲜剂等化学物质，其含量过高对人体健康不 利。此外食品在生产、包装和运输过程中可能会被化学 物质污染，如发生农药残留[1]、兽药残留[2]等危害人 体健康。通过食物链的富集，人类从食品中摄取了种类 繁多且浓度高于环境浓度的有毒、有害物质，而这些有 害物质的化学结构与性质经动植物体后变得更为复杂。 因此，食品分析的重要性日益重要。
（1）材料破碎
天然类胡萝卜素是 存在于生物组织细胞 中的。如不把细胞破 碎，是不可能将其中 的类胡萝卜素有效地 萃取出来的。因此， “材料的破碎”，准 确地讲是指细胞的破 碎，破碎的程度应达 到“亚细胞级”。
（2）萃取 类胡萝卜素的 萃取一般与材料 的破碎同步进行， 方法包括研磨和 剪切。（化合物 的相似相容原理） 应注意的事项包 括:快速、除氧、 温度、PH
1.绿色蔬菜和水果：所有绿色植物组织的细胞的叶 绿体内包含有同样的主要色素:叶绿素a和b、β-胡 萝卜素、叶黄素、紫黄质和新黄质。 2.黄-橙-红色水果和蔬菜：黄-橙-红色水果中类胡 萝卜素的组分是十分多样化的。同样的颜色可以由 不同的类胡萝卜素来产生。最典型的例子为番茄(番 茄红素)和红辣椒(辣椒红素)。
高效液相色谱方法及应用
高效液相色谱方法及应用摘要高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
本文着重以分析赖氨酸铜为例介绍高效液相色谱方法及应用。
关键词：高效液相色谱法的发展历史；特点及应用；赖氨酸螯合铜一、高效液相色谱法的发展历史[1]1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。
高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。
在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。
高效液相色谱方法及应用共36页
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
高效液相色谱方法及只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
高效液相色谱在生物分析中的应用
高效液相色谱在生物分析中的应用高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析和分离技术，广泛应用于生物化学、生物技术和药物研究领域。
该技术具有灵敏度高、分离效率好、速度快、重复性好等优点，在生物分析中发挥着重要作用。
一、高效液相色谱工作原理高效液相色谱利用固体相、液相和气相之间的相互作用进行分离分析。
采用多种不同材料制成的载体填充在柱子里，样品在载体表面通过其与固相之间的作用相互分离。
在高效液相色谱中，溶剂是关键因素之一，不同的溶剂可以产生不同的分离效果。
另外，色谱柱的选用也非常关键，不同的柱子具有不同的固相材料和粒径大小，影响着色谱柱的分离能力。
二、高效液相色谱在生物分析中的应用1、生物大分子分析：高效液相色谱可以用来分析生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等，利用反相色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、尺寸排列色谱、亲和色谱等模式对这些生物分子进行分离和鉴定。
2、药物研究：高效液相色谱在药物研究方面的应用非常广泛，可以用来分析药物代谢产物和药物结构，以及药物浓度等参数。
此外，还可以进行药物的固相萃取和样品的前处理等工作。
3、生物活性物质的分离：高效液相色谱也被广泛应用于分离生物活性物质，如植物中的生物碱等。
通过对样品进行前处理，可以分离出不同的成分，进一步鉴定其活性成分。
4、生物质量分析：高效液相色谱可以与质谱联用，用于测定生物标志物如脂质、多肽、核苷酸等的分子量和精确化学结构。
通过质谱检测，可以分析出不同的样品组分及其比例等信息。
三、高效液相色谱在生物分析中的优势1、快速准确：高效液相色谱可以在短时间内对所需分析物进行分离和定量分析，极大地缩短了分析时间和劳动力投入。
2、灵敏度高：高效液相色谱对于微量样品的检测灵敏度较高，可以检测到极小的分析物含量。
3、重复性好：高效液相色谱的重复性好，可以保证结果的准确性和可靠性。
4、分离效率高：高效液相色谱对于复杂样品的分离效率高，可以获得高品质的分离结果。
四、结论高效液相色谱在生物分析中应用广泛，并且优秀的工作原理和技术优势使其成为了生物化学、生物技术和药物研究领域中的重要分析手段。
高效液相色谱法—高效液相色谱法的应用(仪器分析课件)
二、流动相的制备
• 新型的高效液相色谱仪多用专用的在线真空 脱气技术。真空脱气装置串联到储液系统中， 并结合膜过滤器，实现流动相在进入输液泵 前的连续真空脱气。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱仪使用操作技 能
02 掌握高效液相色谱仪各部分操作技能 相关标题文字
高效液相色谱法实验技术
学生分组练习
根据实验室的实际情况，安排学生分组练习， 一部分学生练习配制流动相，一部分学生练习 操作仪器(以苯试样为例）。
仪器分析
模块三 高效液相色谱法
项目三高效液相色谱法应用
目标
01 掌握高效液相色谱法的应用技
术
02 掌握流动相配制及制备技术
项目三 高效液相色谱法应用
03
——流动相的配制
·流动相的配制 ·流动相的脱气方法
复习： 高效液相色谱仪是以液体为流动相，高压泵将贮 液瓶中流动相经过进样器送入到色谱柱，然后从 废液口中流出；样品经进样器注入后，流动相将 样品带入到色谱柱进行分离，分离后的组分依次 先后顺序进入检测器。记录仪将检测器的信号记 录下来，得到液相色谱图。
➢2.取混合均匀的溶液， 经0.45µm的有机膜过滤， 再脱气15分钟即可
二、流动相的制备
➢3.将过滤好的流动相装入到流动相的储液瓶中， 然后进行脱气
二、流动相的制备
• 4.脱气方法：
• 常用的方法有吹氦脱 气法、加热回流法、 抽真空脱气法、超声 脱气法。以上几种方 法是离线脱气法，在 流动相存放过程中又 会有空气重新溶解在 储液系统中，
高效液相色谱法实验技术 操作过程演示3
观察废液出口，若没有气泡，按“Purge”鍵，停止排 放，关闭排放阀。
3-8高效液相色谱法应用举例
3.8.2 反相键合相色谱法
3.8.2.1 反相键合相色谱法测定水中荧蒽
1.仪器和试剂 1.仪器和试剂
(1)Agilent 1100高效液相色谱系统;四元泵;梯度阀;紫外可变 波长检测器. (2)色谱柱:Zorbax Ecplipse XDB-C8柱,长150 mm,内径4.6 mm, 粒度为5μm. (3)SPE固相萃取装置;SPE固相萃取小柱:填料为C18键合相500 填料为C18键合相500 填料为C18键合相 mg,长6 cm;固相萃取抽滤装置. mg, (4)荧蒽标准溶液:质量浓度为33μg/mL(国家标准物质研究中心 提供). （5）荧蒽标准使用液:质量浓度为330μg/L,吸取荧蒽标准储备 液1.0 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度. （6）甲醇、二氯甲烷、异丙醇均为色谱纯;硫代硫酸钠;本实验 用水均为二次蒸馏水
3.8.4.4免试剂离子色谱法测定饮用水中阴离子 3.8.4.4
1.仪器
• 美国戴安ICS-90离子色谱仪 离子色谱仪 • Chromeleon6.40色谱工作站 • ASll-HC色谱柱(4mmx250mm) • MMSlll型抑制器 • 电导检测器 • RFC-30淋洗液发生器
3.8.4.5 离子色谱法在油气田水分析中的应用
• Metrohm761型便携式离子色谱仪 • 电导检测器 • 离子色谱交换柱Metrosep Anion Supp 5(6. 1006.510); • Millipore纯水系统; • 万分之一电子天平; • AutoScienceAL系列溶剂过滤器; • 以顶端加滤芯(0·45µm)的国产一次性医用注射器 (2mL)作为进样器.
5. 精密度实验 • 取上述对照品溶液(14. 3mg/50mL),在测定条件下 进样8µL(色谱图见图2),重复进样5次。以头孢他啶 侧链酸的峰面积计算,其RSD为0. 12%,精密度很理 想。
高效液相色谱法原理和应用共138页文档
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
高效液相色谱法原理和应用
6
、
露
凝
无
游
氛
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7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
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9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
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谢谢！
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3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.8.4 3.8.5 正相键合相色谱法 反相键合相色谱法 反相离子对色谱 离子色谱法 空间排阻色谱法
3-8 高效液相色谱法应用举例
3.8.1 正相键合相色谱法
3.8.1.1 正相键合相色谱法测定柴油烃族组成
1 • • • • • • 仪器 HP1050高效液相色谱仪; TFJ-Y100烃族分析仪; 9300型色谱工作站; 7125进样阀、7000六通切换阀; 氨基键合柱,Pherisorb NH2,5μm,4.6mm×200mm; 氰基柱,4.6mm×20mm。
5. 精密度实验 • 取上述对照品溶液(14. 3mg/50mL),在测定条件下 进样8µL(色谱图见图2),重复进样5次。以头孢他啶 侧链酸的峰面积计算,其RSD为0. 12%,精密度很理 想。
6. 回收率的测定 • 将头孢他啶侧链酸对照品定量加入已准确 测定含量的头孢他啶侧链酸中,在选定的实 验条件下,测其回收率,结果见表1。
3 标准曲线制备
• 精密称取一定量的对照品置于100mL容量瓶中,用 流动相稀释至刻度,用超声波振荡溶解,然后用移 液管精密移取5、10、15、20、25mL置于5个50mL 容量瓶中,用流动相稀释至刻度(其浓度分别为 2.86,5.72,8.58,11.44,14.3mg/50mL)。分别取 8μL制备好的对照品溶液进行分析,以色谱峰面积 为纵坐标Y,进样量为横坐标X(mg),绘制标准曲线, 回归方程为:
2 色谱条件
• AlltechODS色谱柱, 250mm×4. 6mm。 • 流动相:溶液A与溶液B以5: 8的比例混合后, 用 2mol·L-1 NaOH 溶液调节pH值至7. 0+0.1, 并过 滤、脱气; 其中: 溶液A为0. 8g溴化四丁基铵和 1. 5 g 聚氧化乙烯月桂醚溶解于250mL乙腈中; 溶液B为0. 1mol·L-1NaH2PO4溶液。 • 检测波长: 263nm;流速: 0. 8mol·min-1;柱温:室 温。
4
试样分析
（1）试样溶液的制备 • 称取试样(本院研制的小试样品,为了使杂质峰更清 晰,选取了研制过程杂质含量较高的样品)约0. 01g(精确至0. 0002g)置于50mL容量瓶中,用流动相 稀释至刻度,用超声波振荡溶解。 （2）试样溶液的测试 • 取8µL制备好的试样溶液进行分析。根据保留时间 及加入对照品后峰高增加定性,依据标准曲线进行 定量。色谱图见图1。
3.8.4.4免试剂离子色谱法测定饮用水中阴离子 3.8.4.4
1.仪器
• 美国戴安ICS-90离子色谱仪 离子色谱仪 • Chromeleon6.40色谱工作站 • ASll-HC色谱柱(4mmx250mm) • MMSlll型抑制器 • 电导检测器 • RFC-30淋洗液发生器
3.8.4.5 离子色谱法在油气田水分析中的应用
• 取1 000 mL水样, 本法的最小检出浓度为15.84 ng/L.
3.8.2.2酰胺型反相键合色谱法用于碱性 3.8.2.2 物质的分离
1 仪器与试剂
（1）仪器 HPLC色谱系统由日本岛津LC-10AD泵 SPD-10A多波长紫外分光检测器 Rheo-dyne7125进样阀 江申色谱工作站JS-3000 （2）试剂 Kromasil-5µm硅球(孔径10 nm,比表面积340 m2/g) 氨丙基三乙氧基硅烷(纯度99%,Fluka) 辛酰氯(纯度99%,Fluka) 甲醇(色谱纯,山东禹城化工厂) 水(二次蒸馏,0·45µm微孔膜过滤) 。
• Na2CO3, NaHCO3, NaF, NaCl, NaNO2, NaBr, NaNO3, CH3OH, Na3PO4·12H2O, 以上均为优级纯; 某品牌牙膏。
2. 仪器条件
• 离子色谱仪: 分析柱为AS14 (4 mm×250 mm)阴离子交换柱,保护柱为AG14 (4 mm ×50mm);淋洗液为过水系0.22μm微膜的3. 5 mmol/LNa2CO3- 1.0 mmol/L NaHCO3溶液; 流速为1.0 mL/min;色谱工作站为变色龙; 进样量为25μL; • 抑制器类型为阴离子微膜自动再生抑制器 ASRS; 检测器类型为电导检测器。
3.8.2 反相键合相色谱法
3.8.2.1 反相键合相色谱法测定水中荧蒽
1.仪器和试剂 1.仪器和试剂
(1)Agilent 1100高效液相色谱系统;四元泵;梯度阀;紫外可变 波长检测器. (2)色谱柱:Zorbax Ecplipse XDB-C8柱,长150 mm,内径4.6 mm, 粒度为5μm. (3)SPE固相萃取装置;SPE固相萃取小柱:填料为C18键合相500 填料为C18键合相500 填料为C18键合相 mg,长6 cm;固相萃取抽滤装置. mg, (4)荧蒽标准溶液:质量浓度为33μg/mL(国家标准物质研究中心 提供). （5）荧蒽标准使用液:质量浓度为330μg/L,吸取荧蒽标准储备 液1.0 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇稀释并定容至刻度. （6）甲醇、二氯甲烷、异丙醇均为色谱纯;硫代硫酸钠;本实验 用水均为二次蒸馏水
• Metrohm761型便携式离子色谱仪 • 电导检测器 • 离子色谱交换柱Metrosep Anion Supp 5(6. 1006.510); • Millipore纯水系统; • 万分之一电子天平; • AutoScienceAL系列溶剂过滤器; • 以顶端加滤芯(0·45µm)的国产一次性医用注射器 (2mL)作为进样器.
3.8.4.2离子色谱法测定地表水中六种无机阴离子 3.8.4.2 1仪器及试剂
（1）仪器 • DX-600型离子色谱仪(美国戴安公司) • GP50梯度淋洗泵 • ED50电导检测器 • PeakNet IA色谱数据工作站 • 超纯水系统 • 配以Ionpac AG11-HC保护柱、Ionpac AS11-HC分离柱; ASRS-4MM抑制器。 （2)试剂 • NaOH;F-标准溶液(1000 mg/L),Cl-标准溶液(1000mg/L),NO2标准溶液(100 mg/L),NO3-标准溶液(100 mg/L), SO42-标准溶 液(1000 mg/L),PO43-标准溶液(500 mg/L),均由国家标准物 质研究中心提供。溶液均用电阻大于18.2 MΩ超纯水配制。 过滤膜为Auto-science 0.45μm水系膜。
2. 色谱条件
• AG11-HC (50 mm×4 mm)阴离子保护柱, AS11-HC (250 mm×4 mm)阴离子分离柱; ASRS-ULTRA(4 mm)型阴离子抑制器; 抑制电流为59mA, 流动相淋洗 液浓度为20 mmol/L NaOH, 流速1. 0 mL/min; 进样量 为25µL; 此时色谱系统压力为10 342. 5 kPa; 测定温 度为18~28℃。柱温为室温; 电导检测; 以保留时间 定性, 峰面积定量。
3. 结论 • 采用ED50电导检测器,离子色谱法对地表水 中常见阴离子的测定,在选定的色谱条件下, 一次进样25μL,可在15分钟内检测F-, Cl-, NO2-,NO3-, SO42-, PO43-六种阴离子,具有较 高的灵敏度和准确度,重复性好,该方法操 作简便,具有较高的实用价值。
3.8.4.3 离子色谱法测定降水中常见阴离子 1. 仪器
3.8.5 空间排阻色谱法
3.8.5.1 分子排阻色谱对蛋白质的分离
1. 仪器
• Waters209型高效液相色谱仪 • 检测器为SPD-1型UV-vis可变波长检测器，检测波长λ=254 SPD-1 UV-vis λ=254 nm, • 色谱柱为150mm×4·00 mm i.d.不锈钢柱, ZTJ-型装填机。
2 试剂
• 正己烷 分析纯,活化后经硅胶脱芳烃、过 滤、除气后使用; • 二氯甲烷 经蒸馏、分子筛脱水、过滤、除 气后使用。 3.氢火焰检测器(FID) 3.氢火焰检测器(FID) 主要操作参数 氢火焰检测器 • 催化炉温度350℃;氧化炉温度750℃;清洁 炉温度800℃;喷雾压力0.04 MPa; H2流速 45ml/min; N2流速17ml/min。
2. 结果与讨论
(1) 分别配制不同含量的荧蒽标准溶液, 按样品测定方法作校 正分析, 得到不同的荧蒽峰面积, 以各组分的峰面积对浓度 作图, 各点在试验范围内线性良好, 其线性回归方程为 Area=0.038 182 5 Amount-0.333 916, 相关系数为0.999 9. (2)为了考察方法的精密度, 对几个浓度的样品进行了平行测 定, 得到其相对标准偏差为0.98%~5.70%。 (3)最小检出浓度的测定: 在样品测定的色谱条件下, 待仪器稳 定后, 记录空运行时的色谱图和数据, 打印信噪比报告, 按 下式计算最小检出浓度:
（1）采用液相色谱分离、移动丝氢火焰检测器分析柴油 馏分(180-370℃)的饱和烃和烯烃总量、单环芳烃、双 环芳烃、多环芳烃和胶质类组分的含量是可行的。该法 具有简单、快速、准确、分析时间短 简单、 简单 快速、准确、分析时间短等优点。 （2）通过方法的准确性和可靠性检验,饱和烃和芳烃在较 宽的范围内均有良好的线性。 （3）移动丝氢火焰检测器 移动丝氢火焰检测器与解决了不同油品响应因子不 移动丝氢火焰检测器 同的问题,提高了测定结果的准确性,是目前测定重馏分 油最合适的检测器,但相对而言该检测器的操作较繁琐。 总之,该方法的建立对柴油加工工艺的优化及柴油产 品的质量评价有着积极的作用,它也可作为柴油烃族组 成基础数据的测定手段,为快速近红外光谱分析打下基 础。
7. 操作条件及注意事项
• 头孢他啶侧链酸是一个极性物质,用普通的反相色 谱难以分离,采用离子对色谱可达到满意的分离效 果。在样品峰的前面有未知杂质峰, 流动相采用 水、乙腈溶液, 磷酸盐做缓冲溶液, 溴化四丁基 氨做为离子对试剂。 氨做为离子对试剂。 • 流动相的pH值定为7, pH值过高、过低分离效果都 不好。 • 检测波长选用263nm,曾用过254、260nm,稳定性 263nm最好。 • 由于流动相中含有无机盐, 容易析出结晶而堵塞 或磨损色谱柱和仪器, 因此, 每次测试完毕要用 水和甲醇充分冲洗仪器和色谱柱。