杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)

外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
2. 病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成10倍关系的关键。
3. 整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。 4. 实验完毕3 h后数斑，效果更佳。 5. 结果判定：
疫 苗 免 疫 动 物 后 免 疫 效 力 评 价
ELISA抗体 体液免疫检测
中和抗体
细胞因子mRNA水平检测—qPCR 细胞免疫检测 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA 淋巴增殖实验—MTT法
距离比例=(高于50%的保护率-50% )/(高于50%的保护率-低于50%的保护率) =(66.7-50)/(66.7-16.7) =0.33 lgPD50=高于50%保护率的血清稀释度的对数 +距离比例×稀释度对数的差 =-1.2+0.33×(-0.3) =-1.299
PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20 即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞不出现CPE
重组pFastBac质粒的构建
选择合适的载体
重组Bacmid的产生
重组Bacmid的鉴定
Bacmid DNA ≥135kb
PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert
用途
疾病诊断 病毒分离株的鉴定
不同病毒株的抗原关系研究
疫苗免疫原性的评 免疫血清的质量评价 测定实验动物血清中是否存在抗体
材料
1. 病毒
（1）冻存的病毒不能重复使用 （2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定 进行病毒定量
来自百度文库
2. 血清样品
（1）血清样品分装冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 （2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。 （3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。
BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在
光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数
的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
注意事项：
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
将96孔细胞培养板放入37 ℃ 5% CO2培养箱中作用
45 min—60 min。
感作完成后每孔加入100 µ l细胞悬液，继续臵37℃
5% CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要
观察4-5天。 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
中和效价(PD50)的计算：
6. 每份血清做3个生物学重复。
细胞免疫的检测
首先要完成淋巴的分离和体外刺激 包括脾淋巴细胞/外周血单核细胞的分离
脾细胞的分离：
1.处死的小鼠经消毒后，放臵于泡沫板右侧卧固定，剪开左 侧背腹交界处皮肤，分三套镊子/剪刀无菌取脾脏 2.将脾脏转入匀浆器中，加少量不完全1640，轻轻研磨。 3.静臵，吸上清液入15 ml离心管中，1000rpm×10 min。 4.弃上清，加入5 ml的8.3g/l NH4Cl，静止5 min (去除红细 胞)，1000 rpm ×10 min。 5.弃上清，用不完全RPMI-1640洗涤，1000 rpm ×10 min。 6. 细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。 7.调整浓度为4×106 cells/ml。
ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 （2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and
supplemented with（pH 6.5）：
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。
2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。
中和抗体
微量中和实验技术
中和实验原理
分类
固定病毒—稀释血清法 固定血清—稀释病毒法（用的很少）
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
Primer-Forward（IFN-γ/IL-4/β-actin）
Primer-Reverse（IFN-γ/IL-4/β-actin） 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix cDNA ROX H2O
1µ l（10 µ M）
1µ l（10 µ M） 12.5 µ l 1µ l 0.05 µ l 9.45 µ l 总25 µ L
细胞免疫检测注意事项：
1. 分离淋巴细胞的速度要快，避免体外长时间操作导致
过多淋巴的活性降低和死亡。
2. 台盼蓝染色计数，保证实验组间有效细胞的数量相同。 3. 准备免疫原性较好的刺激，并通过预实验确定最佳刺 激剂量。 4. RNA提取时，不丢弃24孔板中淋巴细胞上清。 5. 严格按照细胞因子ELISA试剂盒操作步骤实验。
病毒扩增&蛋白表达
扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI
一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107
PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml
比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量
2×107cells，那么
蛋白表达：接毒量为 1—5 MOI
固定血清—稀释病毒法
在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对 照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每 一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。
注意事项：
1. 待检血清需56℃灭活30分钟。
2. 需重复测定抗体时，血清应分装后冻存，以免反复冻融。
3. 细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化，细 胞 活力≥ 95%。 4. 牛血清有中和病毒感染力的作用，实验过程中切勿将细胞 培养液与病毒稀释液混淆使用。 5. 病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1小时。但针对不 同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。
3. 细胞和细胞培养试剂
（1）对数生长期细胞 （2）DMEM/血清/胰酶/抗生素
固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病（200TCID50、 EID50或LD50）混合，适当的条件下感作一定时间以后， 再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物， 测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生 病毒感染的能力及其效价。以能保护50%组织培养细胞、 鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀 释倍数，作为该血清的50%中和效价(PD50)。
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
3330 mg/L lactalbumin hydrolysate 3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO3 10% heat-inactivated fetal bovine serum
昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100%
Temperature：27.0—28.0 ℃
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变 慢或不增殖 脱落 或 融合(VSV/G) 裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
Subculturing：
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒表达系统 & 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测
杆 状 病 毒 表 达 系 统
昆虫细胞的培养
重组pFastBac质粒的构建
重组Bacmid的产生与鉴定 获得重组杆状病毒
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
谢谢