转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组后的草甘膦抗性分析

转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组

后的草甘膦抗性分析

水稻是世界上重要的粮食作物,在我国国民经济中占有重要地位。稻田除草贯穿于水稻的整个生产过程中,增加了相当一部分劳动力和经济投入。

化学除草剂的使用为降低水稻生产成本具有非常重要的意义,草甘膦是广谱、高效、低毒、廉价的内吸传导型除草剂,但因其对水稻也具有致死作用而无法在稻田大面积使用。通过基因工程手段培育具有草甘膦抗性的转基因水稻不仅能够节约稻田除草的成本、减少劳动力投入、降低除草剂使用量还能提高农民收入具有非常好的应用前景。

但是随着转基因技术的不断发展,转基因安全性问题也受到广泛关注,尤其

是花粉介导的的外源基因飘流问题,一直是公众和部分科研界人士的关注热点,

通过基因拆分技术能够在很大程度上降低转基因飘流的频率。因此,本研究将表达G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因转入水稻,培育抗草甘膦转基因水稻,探索转

G2-aroA基因水稻对草甘膦的抗性。

并通过基因拆分技术研究通过Intein介导拆分的G2-EPSPS蛋白在转基因水稻杂交后代中重新组装后的草甘膦抗性与转完整G2-aroA基因水稻抗性的区别,研究拆分后蛋白质重新组装效率,为基因拆分技术限控水稻基因飘流的应用提供数据支撑。研究结果如下:1.抗草甘膦水稻的培育及转化事件特异性检测方法的建立1)将转基因水稻G2-6、G2-7与非转基因对照中花11分别浸入到0、50、100 ppm草甘膦溶液中,进行萌芽期草甘膦耐受程度测试,发现50 ppm下中花11的萌发受到明显抑制,在100 ppm下,萌出的胚芽很快腐烂。

与之相比,G2-6和G2-7在50 ppm和100 ppm下的生长均与对照组无明显差

异,说明G2-aroA基因的转入使水稻获得了草甘膦抗性,且50 ppm的草甘膦可以作为萌芽期草甘膦水稻快速筛选的筛选浓度。2)通过苗期喷施草甘膦实验,发现中花11在1000 ppm草甘膦浓度下即枯萎死亡,而G2-6和G2-7在20000 ppm下依然能够存活,说明G2-aroA基因至少将水稻苗期的草甘膦抗性提高了20倍。

通过测量喷施后株高,并进行统计分析,发现喷施草甘膦后地上部分的生长受到一定抑制,3000 ppm和5000 ppm浓度处理下生长高度无显著差异,但显著低于对照组,8000 ppm-20000ppm处理组生长高度无显著差异,显著低于3000ppm和5000 ppm处理组。3)通过在水培溶液中加入不同浓度的草甘膦,引入草甘膦计量反应曲线,分析G2-6、G2-7和中花11不同处理组的株高,判定株高对草甘膦浓度的响应曲线,计算株高被抑制程度达到50%时的草甘膦浓度,即I₅₀。

中花11的I₅₀为0.93、G2-6的I₅₀为96.4、G2-7的I₅₀为114.07,即G2-6和G2-7的草甘膦抗性分别提高了104和123倍。4)扩增G2-6的T-DNA 5’端侧翼序列,获得该转化事件的外源基因正向插入到水稻8号染色体的23685037处。

下载插入位点上下游基因组序列,设计特异引物G2-OsF,G2-OsR,在T-DNA的LB附近序列上设计下游引物G2-TR,建立了G2-6转化事件特异性PCR检测体系,以及三引物法检测G2-6纯合系植株的PCR体系。2.基因拆分技术在水稻中的应用效果1)通过侧翼序列和拷贝数分析,筛选到外源基因插入到2号染色体的

En-1,En-12,Ec-26,以及插入到6号染色体的Ec-22四个单拷贝转化事件作为后续研究的植物材料。

2)分别以En-1和En-12为母本,以Ec-22和Ec-26为父本,通过人工杂交获得EPSPSn-In和Ic-EPSPSc插入到同源染色体的转基因水稻杂交系

En-1/Ec-26,En-12/Ec-26,获得EPSPSn-In和Ic-EPSPSc插入到非同源染色体的转基因水稻杂交系En-12/Ec-22。3)通过苗期喷施草甘膦实验,发现转基因水稻杂交系En-1/Ec-26能够耐受5000 ppm的草甘膦,但是其株高的生长速度显著低于未处理组。

4)通过在水培溶液中加入不同浓度的草甘膦,分析转基因水稻杂交系

En-1/Ec-26、En-12/Ec-26、En-12/Ec-22、转完整基因的水稻G2-6、G2-7和中花11不同处理组的株高,通过计量反应曲线计算I₅₀,En-1/Ec-26的I₅₀为23.78,En-12/Ec-22的I₅₀为

20.62,En-12/Ec-26的I₅₀为17.81,与中花11相比分别提高了25.6倍、22.1倍和17.81倍,与G2-6和G2-7相比草甘膦耐受能力降低的程度在4-6.8倍之间。5)大田中喷施草甘膦分析不同类型转基因植株的草甘膦抗性,发现转基因水稻杂交后代与G2-6在喷施2000 ppm草甘膦时表现出一致的抗

性,En-1,En-12,Ec-22,Ec-26同中花11在喷施草甘膦十天后枯萎死亡。

说明G2-EPSPS蛋白拆分后的两个片段独立存在时不具有抗草甘膦的功能活性;在杂交材料En-1/Ec-26、En-12/Ec-26和En-12/Ec-22中,拆分后的G2-aroA 基因表达的蛋白片段被Ssp DnaE Intein介导发生了剪接反应,产生了有功能的EPSPS蛋白,抗性株率达到100%。6)总蛋白western blot分析,在蛋白水平检测到了杂交材料中完整EPSPS蛋白的存在,说明杂交材料中完成了Intein介导的蛋白质剪接作用,将拆分后的蛋白片段重新组装成完整的有功能的蛋白;In-N抗和Ec抗分别检测到了杂交材料中未参与组装的EPSPSn-In蛋白片段和Ic-EPSPSc 蛋白片段,EPSPSn-In的利用效率分别为91%、67%、90%,Ic-EPSPSc的利用效率分别为83%、81%和87%。