转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组后的草甘膦抗性分析
转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组
后的草甘膦抗性分析
水稻是世界上重要的粮食作物,在我国国民经济中占有重要地位。稻田除草贯穿于水稻的整个生产过程中,增加了相当一部分劳动力和经济投入。
化学除草剂的使用为降低水稻生产成本具有非常重要的意义,草甘膦是广谱、高效、低毒、廉价的内吸传导型除草剂,但因其对水稻也具有致死作用而无法在稻田大面积使用。通过基因工程手段培育具有草甘膦抗性的转基因水稻不仅能够节约稻田除草的成本、减少劳动力投入、降低除草剂使用量还能提高农民收入具有非常好的应用前景。
但是随着转基因技术的不断发展,转基因安全性问题也受到广泛关注,尤其
是花粉介导的的外源基因飘流问题,一直是公众和部分科研界人士的关注热点,
通过基因拆分技术能够在很大程度上降低转基因飘流的频率。因此,本研究将表达G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因转入水稻,培育抗草甘膦转基因水稻,探索转
G2-aroA基因水稻对草甘膦的抗性。
并通过基因拆分技术研究通过Intein介导拆分的G2-EPSPS蛋白在转基因水稻杂交后代中重新组装后的草甘膦抗性与转完整G2-aroA基因水稻抗性的区别,研究拆分后蛋白质重新组装效率,为基因拆分技术限控水稻基因飘流的应用提供数据支撑。研究结果如下:1.抗草甘膦水稻的培育及转化事件特异性检测方法的建立1)将转基因水稻G2-6、G2-7与非转基因对照中花11分别浸入到0、50、100 ppm草甘膦溶液中,进行萌芽期草甘膦耐受程度测试,发现50 ppm下中花11的萌发受到明显抑制,在100 ppm下,萌出的胚芽很快腐烂。
与之相比,G2-6和G2-7在50 ppm和100 ppm下的生长均与对照组无明显差
异,说明G2-aroA基因的转入使水稻获得了草甘膦抗性,且50 ppm的草甘膦可以作为萌芽期草甘膦水稻快速筛选的筛选浓度。2)通过苗期喷施草甘膦实验,发现中花11在1000 ppm草甘膦浓度下即枯萎死亡,而G2-6和G2-7在20000 ppm下依然能够存活,说明G2-aroA基因至少将水稻苗期的草甘膦抗性提高了20倍。
通过测量喷施后株高,并进行统计分析,发现喷施草甘膦后地上部分的生长受到一定抑制,3000 ppm和5000 ppm浓度处理下生长高度无显著差异,但显著低于对照组,8000 ppm-20000ppm处理组生长高度无显著差异,显著低于3000ppm和5000 ppm处理组。3)通过在水培溶液中加入不同浓度的草甘膦,引入草甘膦计量反应曲线,分析G2-6、G2-7和中花11不同处理组的株高,判定株高对草甘膦浓度的响应曲线,计算株高被抑制程度达到50%时的草甘膦浓度,即I50。
中花11的I50为0.93、G2-6的I50为96.4、G2-7的I50为114.07,即G2-6和G2-7的草甘膦抗性分别提高了104和123倍。4)扩增G2-6的T-DNA 5’端侧翼序列,获得该转化事件的外源基因正向插入到水稻8号染色体的23685037处。
下载插入位点上下游基因组序列,设计特异引物G2-OsF,G2-OsR,在T-DNA的LB附近序列上设计下游引物G2-TR,建立了G2-6转化事件特异性PCR检测体系,以及三引物法检测G2-6纯合系植株的PCR体系。2.基因拆分技术在水稻中的应用效果1)通过侧翼序列和拷贝数分析,筛选到外源基因插入到2号染色体的
En-1,En-12,Ec-26,以及插入到6号染色体的Ec-22四个单拷贝转化事件作为后续研究的植物材料。
2)分别以En-1和En-12为母本,以Ec-22和Ec-26为父本,通过人工杂交获得EPSPSn-In和Ic-EPSPSc插入到同源染色体的转基因水稻杂交系
En-1/Ec-26,En-12/Ec-26,获得EPSPSn-In和Ic-EPSPSc插入到非同源染色体的转基因水稻杂交系En-12/Ec-22。3)通过苗期喷施草甘膦实验,发现转基因水稻杂交系En-1/Ec-26能够耐受5000 ppm的草甘膦,但是其株高的生长速度显著低于未处理组。
4)通过在水培溶液中加入不同浓度的草甘膦,分析转基因水稻杂交系
En-1/Ec-26、En-12/Ec-26、En-12/Ec-22、转完整基因的水稻G2-6、G2-7和中花11不同处理组的株高,通过计量反应曲线计算I50,En-1/Ec-26的I50为23.78,En-12/Ec-22的I50为
20.62,En-12/Ec-26的I50为17.81,与中花11相比分别提高了25.6倍、22.1倍和17.81倍,与G2-6和G2-7相比草甘膦耐受能力降低的程度在4-6.8倍之间。5)大田中喷施草甘膦分析不同类型转基因植株的草甘膦抗性,发现转基因水稻杂交后代与G2-6在喷施2000 ppm草甘膦时表现出一致的抗
性,En-1,En-12,Ec-22,Ec-26同中花11在喷施草甘膦十天后枯萎死亡。
说明G2-EPSPS蛋白拆分后的两个片段独立存在时不具有抗草甘膦的功能活性;在杂交材料En-1/Ec-26、En-12/Ec-26和En-12/Ec-22中,拆分后的G2-aroA 基因表达的蛋白片段被Ssp DnaE Intein介导发生了剪接反应,产生了有功能的EPSPS蛋白,抗性株率达到100%。6)总蛋白western blot分析,在蛋白水平检测到了杂交材料中完整EPSPS蛋白的存在,说明杂交材料中完成了Intein介导的蛋白质剪接作用,将拆分后的蛋白片段重新组装成完整的有功能的蛋白;In-N抗和Ec抗分别检测到了杂交材料中未参与组装的EPSPSn-In蛋白片段和Ic-EPSPSc 蛋白片段,EPSPSn-In的利用效率分别为91%、67%、90%,Ic-EPSPSc的利用效率分别为83%、81%和87%。
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤 一、水稻愈伤组织的诱导 （一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒： 1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷； 2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作） 3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中； 2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 （二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周 （2周愈伤组织更为松散）。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）
植物转基因育种概述
植物转基因育种概述 https://www.360docs.net/doc/541510763.html, 来源：中学生物学 作者：李志翔 日期：2007-10-1 为了培育高产、优质、抗逆性强的作物新品种，需将一种植物的优良遗传性状转移到另一种植物体中。若采用传统的杂交育种法进行随机筛选或通过组织培养、理化诱变、细胞融合等方法定向筛选优良性状培育新品种，其盲目性较大，筛选效率低，又有明显的种属界限而产生一定的生殖障碍，成功率不高。目前发展起来的植物基因工程技术则能有效地解决上述难题。通过特定目的基因的定向转移，其遗传变异频率比自发突变高出102～104倍，选择效率高，大大地避免了盲目性；又由于基因来源广泛，打破了种属界限，可以克服杂交育种过程中的生殖障碍，成功率提高。因此，植物基因工程技术已成为作物遗传育种的有效新途径，倍受重视。通过基因工程技术定向转移基因后获得的植物，称为转基因植物。 自1983年世界上首次成功获得第一株转基因植物以来，植物基因工程技术已广泛应用于作物品质改良、抗病性、抗虫性、抗病毒性、抗除草剂、杂种优势的利用等方面。迄今，全世界至少有300多种基因（性状）用于转化植物、微生物和动物。许多转基因产品已陆续投放全球市场，经济效益显著。 1 抗病毒转基因植物 植物病毒病是我国农业生产上最主要的病害之一，对我国的粮食作物、经济作物及果树蔬菜均造成严重危害， 经济损失巨大，但迄今缺少有效的化学防治方法。目前
人们已经可以通过植物基因工程技术，获得抗病毒转基因植物，以控制植物病毒的危害。其原理是： 一是利用植物生物技术，将病毒外壳蛋白基因或卫星RNA基因转入到植物基因组中，并获得转基因植株。这些植株叶片细胞中就会有病毒外壳蛋白或卫星RNA的表达和积累，就能够抑制相应的侵染病毒的RNA复制，从而可以减弱病毒病的症状或推迟病毒病发生时间，即具有一定的抗病毒能力。二是将病毒的反义RNA的相应DNA序列重组到植物的基因组里，使其合成反义的RNA。当植物被相应的病毒感染时，病毒的mRNA就可能与植物细胞中合成、积累的病毒反义RNA结合而无法反向复制和转录，从而控制病毒对植物的危害。 1.1 抗烟草花叶病毒的转基因植物 烟草花叶病毒（TMV）是一种RNA病毒，由单链RNA及外壳蛋白组成。研究证明，TMV侵染植物后，其外壳蛋白具有抑制新侵染相应病毒释放mRNA的作用。目前已成功地将TMV外壳蛋白基因转入到烟草细胞中，表达了病毒蛋白并对该病毒产生了抗性。 1.2 抗黄瓜花叶病毒转基因植物 黄瓜花叶病毒（CMV）对农作物危害极为严重，可侵染上千种植物。目前人们已成功地将CMV的卫星RNA基因转入到烟草、辣椒、甜瓜、番茄和矮牵牛等植物中，在植物体内合成、累积的卫星RNA，可以抑制相应的病毒RNA的复制，能显著减轻病毒的危害。 此外，人们还培育出了抗苜蓿花叶病毒（AMV）、抗烟草环斑病毒（TobRV）的转基因植物，抗病毒效应都非常显著。
转基因抗虫棉的抗性研究与利用
棉铃虫是棉花生产的主要害虫之一，在抗虫棉没有推广应用前，当棉铃虫大发生时，均会给农民以及棉花产业带来严重的损失。由于棉铃虫防治只能依靠农药，而棉铃虫也逐渐对农药产生抗性，致使1992年棉铃虫在我国棉区大爆发，我国当年杀虫剂纯农药的生产量只有20万t，其中为防止棉铃虫就消耗15万t左右。出现了农药打不死棉铃虫，反而还威胁到人畜及生态的安全，也导致整个国家出现“棉荒”现象，造成严重的经济损失。1991年国家“863”计划开始启动转基因抗虫棉的研究，充分利用生物分子技术来解决常规育种技术难以解决的问题。经过二十多年的努力，我国已初步形成了基础研究、应用研究到产品开发的较为完整的技术体系，目前我国转基因抗虫棉整体发展处于国际先进水平。 1转基因抗虫棉创新与发展 1.1 转基因抗虫棉研究与创新 转基因抗虫棉是利用分子生物学技术将外援基因或经修饰的基因转移到棉株中，从中分离得到所需要的基因。常规杂交育种也属于一种转基因技术，但是它只能在有限的范围内对作物的遗传基因进行改良，并不能做到针对某一优良性状进行定向改造。因此，转基因技术是传统遗传育种技术的发展与创新，也将是我国未来农业发展的必然趋势。 1983年，世界首例转基因烟草培育成功；1986年，抗虫和抗除草剂的转基因棉花进入田间试验阶段；1990 《种子法》规定：销售的种子必须进行包装，而且要附有标签。购种时一看种子袋表面是否印有“作物种类、品种名称、生产商、质量指标、净含量、生产年月、警示标志(一般是对包衣种子而言)和‘转基因’标准”等内容(这些项目必须外标)，如果没有可认为是假种子；二看种子袋内是否装有内标牌，标牌上是否印有种子经营许可证、生产许可证、检疫证编号、生产商地址、联系方式和使用说明，如果没有、不全或与实物不符，说明种子来历不明或者是假种子。 3.3 注意检查种子包装是否规范 查看包装物的质地、印刷质量、字迹是否清楚、有无粘贴等。代销点不能随意拆袋，以防混入假劣种子。有的包装袋上注明严禁拆口销售。 3.4 仔细查看种子 正常的当年种子大小一致、籽粒饱满、色泽鲜亮，近闻有正常的谷香味。谷物类种子还要摸一摸、看一看含水量是否超标。双手插到种子袋中间感到凉、不粘手、掰开后茬口齐的种子含水量较低，反之含水量高，贮存时容易霉变。注意种子的生产年月，避免购买超过一个生长周期的种子，种子保存的时间长短，将影响其发芽率。 3.5 选择适宜品种 要根据当地气候、茬口选择适宜品种。不可只注重品质、产量等因素，盲目选择。 3.6 索取销售发票 购买时与商家索取销售发票，并在发票上注明品种名称、数量、价格、地点及时间，妥善保管。销售发票是购种的凭证，是有效的证据。播种开始时保存少量购买的种子作为样本，以备用。如果种子质量有问题，可以委托种子质量监督检验部门检验，凭检验报告要求种子经营单位予以赔偿，或到种子管理部门投诉。 3.7 仔细阅读种子使用说明和注意事项 仔细阅读种子使用说明和注意事项，不明事项要及时咨询，以免操作失误，影响产量和品质。对于瓜菜类及反季节栽培用的种子，一定要注意适宜的栽培时间(温度)和地点(气候类型)。 （收稿日期：2013—12—15） （本栏责任编辑：刘中漱） 徐福海1 许 泉1，2 王元慧1 康 勇1，2 张 莉1 金夏红1，2 （1 南京神州种业有限公司 210095 2 南京农业大学） 摘 要 转基因抗虫棉是我国唯一获准商品化生产的转基因作物，本文对抗虫基因的分离与转基因棉株的获得及抗虫棉的抗性原理进行了探讨。转Bt基因抗虫棉不同生育阶段，不同部位对棉铃虫的抗性，抗虫棉的研制成功与大规模产业化保障我国棉花稳步发展，增加农民收入保护环境作出了重要贡献。 关键词 转基因抗虫棉 抗性研究 利用技术 doi:10.3969/j.issn.1000-8071.2014.03.011
草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 ［５６］ＸｕＨ，ＣａｉＺＣ，ＪｉａＺＪ，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｌａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔｉｎｗｉｎｔｅｒ ｃｒｏｐｓｅａｓｏｎｏｎＣＨ４ｅｍｉｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｆｌｏｏｄｅｄａｎｄｒｉｃｅ－ｇｒｏｗｉｎｇｐｅｒｉｏｄ［Ｊ］．ＮｕｔｒｉｅｎｔＣｙｃｌｉｎｇｉｎＡｇｒｏｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ，２０００，５８（１／２／３）：３２７－３３２． ［５７］熊正琴，邢光熹，鹤田治雄，等．豆科绿肥和化肥氮对双季稻稻 田氧化亚氮排放贡献的研究［Ｊ］．土壤学报，２００３，４０（５）：７０４－７１０． ［５８］徐昌旭，谢志坚，曹卫东，等．翻压绿肥后不同施肥方法对水稻 养分吸收及产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１１（３）：３５－３９． ［５９］黄 晶，高菊生，刘淑军，等．冬种紫云英对水稻产量及其养分 吸收的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１３（１）：８８－９２． ［６０］徐昌旭，谢志坚，许政良，等．等量紫云英条件下化肥用量对早 稻养分吸收和干物质积累的影响［Ｊ］．江西农业学报，２０１０，２２（１０）：１３－１４，２３． ［６１］郭晓彦，宋晓华，刘春增，等．紫云英翻压量和化肥用量对水稻 生长、产量及经济效益的影响［Ｊ］．山地农业生物学报，２０１４，３３（５）：７－１２． ［６２］高菊生，曹卫东，董春华，等．长期稻－稻－绿肥轮作对水稻产 量的影响［Ｊ］．中国水稻科学，２０１０，２４（６）：６７２－６７６．［６３］曾庆利，龚春华，徐永士，等．紫云英不同翻压量对水稻产量和 产值的影响［Ｊ］．湖南农业科学，２００９（６）：７６－７７，８８．［６４］谢志坚，徐昌旭，许政良，等．翻压等量紫云英条件下不同化肥 用量对土壤养分有效性及水稻产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１１（４）：７９－８２． ［６５］李双来，李登荣，胡 诚，等．减施化肥条件下翻压不同量紫云 英对双季稻生长和产量的影响［Ｊ］．中国土壤与肥料，２０１２（１）：６９－７３． ［６６］卢 萍，杨林章，单玉华，等．绿肥和秸秆还田对稻田土壤供氮 能力及产量的影响［Ｊ］．土壤通报，２００７，３８（１）：３９－４２． 陈银竹，丁 伟，刘胜男，等．草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１６）：５６－５９．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１６．０１３ 草甘膦对转基因抗草甘膦大豆的安全性研究 陈银竹１，丁 伟１，刘胜男１，ＭｕｈａｍｍａｄＳｈａｈｉｄｋｈａｎ １，２ （１．东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨１５００００；２．白沙瓦农业大学，巴基斯坦白沙瓦１５９９１０７） 摘要：采用草甘膦种子和茎叶处理研究转基因抗草甘膦大豆的安全性，为减少草甘膦用量和转基因抗草甘膦大豆的安全应用提供理论依据。以转基因抗草甘膦大豆为试材，采用田间随机区组设计方法，测定转基因大豆的生理指标 和杂草防除效果。结果表明，５６２．５ｇ．ａ．ｉ．／ｈｍ２草甘膦种子处理和１１２５ｇ．ａ．ｉ．／ｈｍ２ 草甘膦茎叶处理后，除莽草酸含 量不受影响，转基因大豆的株高、鲜质量、干质量、叶绿素含量以及光合速率各项生理指标均在施药初期受到抑制，茎叶处理后２８ｄ、种子处理播种后６１ｄ时各生理指标均可恢复正常；草甘膦茎叶处理对杂草具有显著的防除效果，草甘膦施用后７ｄ，杂草防效为９４．６７％，２８ｄ，杂草防效为７２．３３％，且对大豆安全。草甘膦种子和茎叶处理对转基因抗草甘膦大豆均具有较好的安全性，且茎叶处理能有效控制杂草。 关键词：草甘膦；转基因抗草甘膦大豆；安全性；杂草防除效果；生理生化 中图分类号：Ｓ４５１．２２＋４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）１６－００５６－０４ 收稿日期：２０１７－０３－０７ 基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（编号：２０１５ＺＸ０８０１１－００３）；黑龙江省留学归国人员基金（编号：ＬＣ２０１１Ｃ０１）。 作者简介：陈银竹（１９９２—），男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事杂草生物学与转基因作物安全评价研究。Ｅ－ｍａｉｌ：９４００８１８２２＠ｑｑ．ｃｏｍ。 通信作者：丁 伟，博士，教授，研究方向为农药生态安全与转基因作物安全评价。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｗｅｉ＠ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 近年来，基因工程技术发展势头迅猛，种植业中以转基因抗草甘膦大豆的发展最为迅速。而大豆为我国重要的粮食作物，杂草防除一直是大豆种植过程中的重点问题。化学除草是大豆田防除杂草的重要手段，近几年大豆田化学除草面积 已达其播种面积的９０％以上［１］ 。转基因抗草甘膦大豆的出 现便为人们提供了一种能有效控制杂草的新途径，不仅大大降低了除草成本和劳动强度，并且有效延缓了大豆田抗性杂草的出现，除草剂药害的发生也明显降低，已成为美洲地区大 豆田杂草防除的重要方法之一。草甘膦由美国孟山都公司研 制开发，目前是世界上除草剂使用量最大的品种之一［ ２］ 。草甘膦通过抑制莽草酸途径中的５－烯醇式丙酮莽草酸－３－磷酸合成酶（ＥＰＳＰＳ），使微生物和植物不能合成生存必需的 芳香族氨基酸而导致死亡［３－４］ 。其特点是杀草谱广、传导性 好、残效低，在转基因抗草甘膦大豆整个生育期都可以使用。国内外普遍将草甘膦应用于茎叶处理，而对应用草甘膦进行种子处理的安全性和杂草防除效果鲜有研究。本试验通过草甘膦种子处理和茎叶处理研究草甘膦的安全性，为减少草甘膦的用量和我国当前自主研发的转基因抗草甘膦大豆的安全应用提供理论依据。 已有的研究表明，一定浓度的草甘膦会造成转基因大豆叶片的叶绿素含量降低、叶绿体结构变化和光合速率下降，叶绿素恢复过程需要２周左右， 莽草酸含量几乎没有变化［ ５－１１］ 。Ｂｅｌｌａｏｕｉ等研究表明，草甘膦会影响转基因抗草甘膦大豆的碳代谢和氮代谢［１２］ 。种子用草甘膦溶液浸泡后播 于土壤中，敏感的大豆种子浸泡４ｈ后不能发芽，而转基因种 —６５—江苏农业科学 ２０１８年第４６卷第１６期
水稻转基因组织培养步骤的具体事宜
农杆菌介导的转化 一．试剂 1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-5898 2 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-0753 3 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-0640 4 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-5148 5 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-8407 6 Kanamycin USB Cat No. 17924 7 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-7290 8 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-010 9 Cn (Carbenicillin) 国产分装 10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-0765 11 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-8666 12 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-3902 13 Inositol Sigma Cat No. I-3011 14 Phytagel Sigma Cat No. P-8169 15 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-5879 16 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-3783 17 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG 二．溶液 1.MS max NH4NO316.5g KNO319.0g KH2PO4 1.7g MgSO4?7H2O 3.7g CaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g 逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。 2.MS min母液(100×) KI 0.083g H3BO30.62g MnSO4?4H2O 2.23g 或MnSO4? H2O 1.69g ZnSO4?7H2O 0.86g Na2MoO4? 2H2O 0.025g CuSO4? 5H2O 0.0025g CoCl2? 6H2O 0.0025g 注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。 加dH2O定容到1000ml室温保存。 3.N6max母液(10×)
转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组后的草甘膦抗性分析
转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组 后的草甘膦抗性分析 水稻是世界上重要的粮食作物,在我国国民经济中占有重要地位。稻田除草贯穿于水稻的整个生产过程中,增加了相当一部分劳动力和经济投入。 化学除草剂的使用为降低水稻生产成本具有非常重要的意义,草甘膦是广谱、高效、低毒、廉价的内吸传导型除草剂,但因其对水稻也具有致死作用而无法在稻田大面积使用。通过基因工程手段培育具有草甘膦抗性的转基因水稻不仅能够节约稻田除草的成本、减少劳动力投入、降低除草剂使用量还能提高农民收入具有非常好的应用前景。 但是随着转基因技术的不断发展,转基因安全性问题也受到广泛关注,尤其 是花粉介导的的外源基因飘流问题,一直是公众和部分科研界人士的关注热点, 通过基因拆分技术能够在很大程度上降低转基因飘流的频率。因此,本研究将表达G2-EPSPS蛋白的G2-aroA基因转入水稻,培育抗草甘膦转基因水稻,探索转 G2-aroA基因水稻对草甘膦的抗性。 并通过基因拆分技术研究通过Intein介导拆分的G2-EPSPS蛋白在转基因水稻杂交后代中重新组装后的草甘膦抗性与转完整G2-aroA基因水稻抗性的区别,研究拆分后蛋白质重新组装效率,为基因拆分技术限控水稻基因飘流的应用提供数据支撑。研究结果如下:1.抗草甘膦水稻的培育及转化事件特异性检测方法的建立1)将转基因水稻G2-6、G2-7与非转基因对照中花11分别浸入到0、50、100 ppm草甘膦溶液中,进行萌芽期草甘膦耐受程度测试,发现50 ppm下中花11的萌发受到明显抑制,在100 ppm下,萌出的胚芽很快腐烂。 与之相比,G2-6和G2-7在50 ppm和100 ppm下的生长均与对照组无明显差
【转基因水稻讲义】转基因抗虫水稻
【转基因水稻讲义】转基因抗虫水稻 前言：水稻是三大粮食作物之一，世界上近一半人口，都以水稻为主食，它是人类营养和能量摄入最重要的谷物，提供全世界五分之一以上热量消耗。 概况：早在上世纪八十年代早期国际水稻生物技术的研发就在洛克斐勒基金的资助下开展。至今在水稻生物技术方面的专利超过三百项，涉及四百多个组织和机构。从1993年起，在美洲、欧洲、亚洲和澳洲的许多国家陆续开始了转基因水稻的田间试验。目前，已有6个转基因水稻品种获得了不同的批准认可，涉及种植、食用、饲用、进口和加工等方面。全球已培育出近50个转基因抗虫水稻品系，大部分均已进入田间试验阶段，鉴于其环境安全性及食品安全性，还未进行商业化种植，除了2004年伊朗批准抗虫转基因水稻的商业化种植。国内转基因水稻主要是华中农业大学张启发院士课题组在研究，其研发的抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt 汕优63”于2009年8月获得农业部转基因生物安全证书，但是目前并没有获批进行商业化种植。除抗虫水稻外，一些药用或耐除草剂水稻陆续被批准进口或商业化应用。1998年起，美国批准Ventra Bioscience公司研发的转溶菌酶，乳铁蛋白、人血清白蛋白基因的3个药用转基因水稻的商业化种植。美国批准安万特公司的转bar基因耐除草剂水稻及先正达公司的黄金大米等。 我们组通过上网查找资料、借阅图书馆书籍以及询问老师的方式对转基因水稻有了进一步的了解，现在和大家一起来揭开转基因水稻的神秘面纱。 首先要介绍的是目前人类对转基因水稻研发所能达到的技术水平。 技术比较成熟的有以下四种水稻： 1、抗虫转基因水稻 2、抗除草剂转基因水稻
3、抗花粉过敏转基因水稻 4、金稻 技术还在研发中的水稻主要有抗逆性转基因水稻、高产和优质性状转基因水稻这两种。 表格 接下来介绍转基因水稻的工艺流程。 我们知道，基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术主要是对外源基因的重组设计，分为以下几步： 1、切（获取目的基因） 2、接（构建基因表达载体） 3、转（将目的基因导入受体细胞） 4、增（扩增DNA重组分子） 5、检（目的基因的检测与表达产物的测定） 每一步具体的操作方法会根据供体、受体细胞的不同而改变，越具体到可以直接指导我们的实际操作的资料信息就越高精尖，目前我们的能力无法理清这些，所以只总结了一般可以选择的几种方法。 第一步获取目的基因主要有三种方法，分别是鸟枪法（即直接分离目的基因）、人工合成法和从文库中获取。 鸟枪法： cDNA法：将供体生物细胞的mRNA分离出来，利用反转录酶在体外合成cDNA，并将之克隆在受体细胞内，通过筛选获得含有目的基因编码序列的重组克隆，这就是cDNA法克隆蛋白质编码基因的基本原理。
抗草甘膦转基因大豆的操作步骤
抗草甘膦转基因大豆的操作步骤 转基因大豆可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）。草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。这种大豆被称为转基因大豆。而这种转基因技术终于走出实验室和试验田，进入像玉米、大豆和棉花作物的日常耕作。 抗草甘膦转基因大豆针对草甘膦的作用机理，导入能够使植物表达更多的4252合成酶的基因，使植株对草甘膦不敏感从而能够忍受正常剂量或更高剂量的草甘膦而不被杀死。从鼠伤寒沙门氏菌及大肠杆菌中可以直接分离出抗草甘膦的4252编码AroA，美国Monsonto公司利用该机制将该抗性基因导入大豆中成功地获得了抗草甘膦转基因大豆。这种转基因大豆对草甘膦的忍耐能力是普通大豆的69倍，从而使大豆田中的绝大部分一年生或多年生杂草得到控制而大豆本身不受伤害。除了抗草甘膦作物之外，还有抗草丁膦除草剂的作物，不过草丁膦与草甘膦杀灭植物的原理并不相同，而培养这两类作物所转的基因也不同。而当前转基因大豆主要用来提炼大豆油。 抗草甘膦转基因大豆的操作步骤;（1）分离克隆基因，搞清楚基因功能。（2）构建表达载体，也就是运输工具，即质粒或载体。（3）遗传转化，也就是所说的转基因，利用各种方法，把备转移的质粒DNA转移到植物细胞的细胞核中，让外源DNA在细胞中复制。本次使用的转基因方法是根癌农杆菌法。根癌农杆
菌是一种土壤农杆菌，在它的细胞中有一个环形的质粒，叫Ti 质粒，质粒上有一段可转移的DNA，叫T-DNA。这段T-DNA 上带有编码肿瘤的基因，根癌农杆菌侵染大豆后，这段T-DNA 可以切下来，转移到大豆的细胞中，是植物中产生肿瘤。把T-DNA 编码肿瘤的基因切除，插入所需转移的目的基因上，使大豆具有新的特性。转入目的基因的同时，还需转入一个选择标记基因，以便后面筛选和鉴定出转化的细胞。即获得目的基因的细胞是少数，大多数仍是非转基因的细胞，要筛选出转化的细胞，需要在转化后把非转基因细胞杀死。本次使用的标记基因是除草剂抗性标记基因，在培养大豆细胞阶段，在培养基中加入抗草甘膦除草剂，没有转入的基因的细胞不具有抗除草剂。在转基因大豆幼苗期，使用飞机或大型机动喷雾器对转基因大豆直接喷洒草甘膦，大豆苗长高封行后，收割前五十天左右不用再喷洒，等待收割即可。草甘膦杀死了除抗除草剂转基因大豆以外的杂草，使产量提高。转基因大豆的草甘膦残留一般很低，或者根本检测不出，五十天时间草甘膦残留几乎为零。 抗草甘膦转基因大豆的优缺点：优点（1）增加粮食生产、减少生产的投入，有助于解决世界范围的粮食问题（2）转基因大豆具有抗病虫害、抗除草剂的特性，可减少杀虫剂、除草剂的使用，有利于环境保护。（3）通过利用某些基因，增加食物品种，改善食物品质，使食物更加可口。缺点（1）转基因技术使不同物种的基因相互融合，而对其后果却无法控制，因而可能造成基因污
水稻转化方法
水稻转化方法 水稻转化(来自文献https://www.360docs.net/doc/541510763.html,/content/nt36q44450563406/fulltext.pdf) For rice transformation, mature rice seeds were de-husked and sterilised with 3% sodium hypochlorite (30 min). The seeds were thoroughly washed three times with sterile distilled water and transferred onto MS basal medium (Murashige and Skoog1962) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolyte, 2 mg/l 2,4-dichlorphenoxy acidic acid (2,4-D) and 30 g sucrose, for 1 week. The freshly induced calli were dipped in Agrobacterium tumefaciens (AGL1 strain) and transferred onto NB medium (N6 macro-elements, B5 micro-elements) containing 500 mg/l proline, 300 mg/l casein hydrolysate, and 30 g sucrose. After co-cultivation with Agrobacterium (no dim light, 28℃, 2 days), the calli were transferred onto NB medium containing 2 mg/l 2,4-D, 120 mg/l G418, and 500 mg/l Cefotaxime. The resistant calli were subcultured on fresh plates at 2-week intervals for 4 weeks, and then transferred onto MS medium containing 0.2 mg/l anaphthalene acetic acid (NAA), 3 mg/l 6-benzylaminopurine (6-BA) and 150 mg/l G418 until shoots regenerated. Shoots were transferred onto 1/2 MS medium containing 0.5 mg/l NAA for rooting and further growth. The transgenic plants were grown inthe field or at 28℃ under a 16/8 h light/dark cycle in the greenhouse. 配置1升诱导培养基： 1.水解酪蛋白300 mg/L 2.谷氨酰胺500 mg/L 3.脯氨酸500 mg/L 4.肌醇100 mg/L 5.蔗糖30g/L
草甘膦与转基因作物
草甘膦与转基因作物 草甘膦与转基因作物有关系么？有，也没有。1970年，孟山都公司的化学家John E. Franz合成了草甘膦。1974年，草甘膦作为除草剂在美国成功登记注册。由于除草效果超级好，草甘膦受到广大农民的热烈欢迎。在草甘膦成功商业化20多年后，1996年第一例转基因抗草甘膦大豆问世了。草甘膦比转基因大20岁。 直接关系：在生产应用上，草甘膦与转基因抗除草剂作物建立了一一对应的关系。 在技术研发上，二者没有关系。 间接关系：由于使用草甘膦，而不用其它除草剂，转基因抗草甘膦作物中草甘膦的残留量相应增加，其他除草剂残留量相应减少。 转基因作物自身安全性与草甘膦农药的安全性没有关系。 抗草甘膦作物为什么能够抗草甘膦呢？ 找一种聪明的EPSPS酶，转到植物中去，它能够分得清草甘膦和PEP，并且更喜欢与PEP在一起。即使喷上草甘膦，它也能有效地找到PEP，发挥正常EPSPS
酶的功能。 比如占美国大豆种植面积90%以上的抗草甘膦大豆，就是被转入了一个来源于土壤中常见细菌的基因，因为分离得到这个基因的菌株叫CP4，这个基因表达出来的“聪明”酶就被命名为CP4 EPSPS。 抗草甘膦作物种植面积增加了，草甘膦使用量不就变多了吗？ 没错。但是草甘膦的用量上升了，其他除草剂的用量减少了，除草剂总的用量最终减少了。1996-2013年期间，仅转基因耐除草剂棉花大规模种植就使得除草剂用量减少了两万多吨。并且，草甘膦是目前已知的对环境最友好的绿色农药,
没有之一。这么说，转基因技术和草甘膦的配套应用还促进了绿色环保。 草甘膦会残留在食物中吗？ 当然会，但残留量很低，远小于联合国粮农组织和世界卫生组织建议的摄入量。在耐草甘膦作物中，大部分草甘膦通过根系排放到土壤中，少部分留在植株中,主要被代谢为AMPA，并进一步转化为简单化合物及天然产物，并且，草甘膦残留量在作物不同部位差异很大，籽粒中的残留明显低于其他部位。 国际食品法典委员会（CODEX）对草甘膦在各类食品中的最大残留量有明确规定。玉米为每公斤5毫克，大豆为每公斤20毫克。 联合国粮农组织和世界卫生组织的下属农药残留专家联席会议（JMPR）在2011年建议，草甘膦每日最大摄入量（ADI）为每公斤体重0至1毫克。结合CODEX 最大残留量规定，成年人一天中要吃4公斤大豆，或16公斤玉米才会达到JMPR 所建议的草甘膦每日最大摄入量。 2015年11月12日，欧盟食品安全局（EFSA）和欧盟成员国完成对草甘膦的重新评估。评估小组结论是草甘膦不大可能对人类有致癌风险。按照欧盟法规（EC）1272/2008号，这些证据不支持将草甘膦归为潜在致癌性一类。2016年欧盟委员会根据欧盟实施条例（EU）2016/1056决定续登记草甘膦至2017年12月31日。
水稻转基因步骤
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。 水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。 基因转化方法参照Hiei等(1994)的方法并加以修改。取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Kam)的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS（终浓度为100mΜ）,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26℃下暗培养2~3d。共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14d，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/d 光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因 一、实验目的 1.学习水稻组织培养的方法 2.学习水稻转基因的方法 二、实验原理 目的基因克隆到双元载体中，双元载体转入农杆菌，然后携带双元载体的农杆菌侵染水稻愈伤组织，通过T-DNA插入，把我们的目的基因整合到水稻染色体上。 历史：农杆菌感染受伤的植物产生冠瘿瘤病，发现是由Ti质粒引起，同时做杂交，发现只有T-DNA（transferred DNA）这一部分被整合到植物染色体上了。 三、试验步骤： 一、水稻愈伤组织的诱导 （一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒： 1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷； 2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作） 3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟； 4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；
2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天； 3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。 （二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒2分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周） 一、农杆菌培养 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。 二、共培养和抗性愈伤组织的选择 1．感菌与共培养： 1）取培养好的菌液500μl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01； 2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟； 3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟； 4）将愈伤组织置于共培养基上。25℃暗培养2.5天。 2．选择： 1）将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法 将水稻成熟种子去壳。仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次； 将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化； 农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。 新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。 农杆菌介导转化水稻所用培养基 -1-1 626 蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8 N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素 2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖， pH7.0 AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖， 100-400μmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2 N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400μmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2
转基因棉花环境安全性研究进展
转基因棉花环境安全性研究进展 随着转基因技术的大力推广与发展．转基因产品在给人类带来巨大经济利益的同时．食品与环境安全的问题备受社会关注。其中转基因棉花大面积种植尤为重要．利益与安全应该同步发展与推广才能得到人们认可。2008年，全球共有10个国家（前5位包括：美国、阿根廷、巴西、印度、加拿大）增加种植了混合型转基因棉花，其中美国种植转基因棉花达78%：印度多数种植转Bt基因棉花，种植面积占印度种植棉花总面积的82%m。种植的转基因棉花既是主要的纤维经济作物．同时也是仅次于大豆的重要油料和蛋白质作物．全球种植转基因棉花的面积为2100万hm2．位居种植转基因农作物物种的第3位，而国内种植转基因棉花的面积达到530万hm2。北美地区和澳大利亚是种植转基因抗除草剂棉花面积最大的地区与国家，在2007年孟山都第二代抗草甘膦棉花在美国与澳大利亚种植面积达80×104 hm2。抗除草剂有效解决棉花杂草的危害，并扩大除草剂施用范围，降低了除草费用．达到低投入和高产出的目的。因此，在广泛种植转基因棉花过程及生产应用中存在风险随之产生，主要包括：抗除草剂棉花有成为杂草的可能：基因漂移威胁棉花近缘物种：转基因棉花的应用会加速害虫抗性进化：转基因棉花对
非靶标有益生物的影响：转基因棉花对土壤生态环境的影响。笔者旨在对转基因棉花的研究情况进行综述、讨论及展望。 1 种植转基因棉花的优势 1.1 种植转Bt基因棉花对环境的影响 首先．经过长时间种植转Bt基因棉花对环境影响较明显：棉田中的益虫增多，周围其他农田受益，整个农田生态系统呈良性发展态势。Bt基因具有天然杀虫特性，能够杀死害虫中的蛋白质。在国内主要防治棉铃虫．对其他害虫也有间接防治效果，在转基因棉花田中瓢虫、蜘蛛和草蛉等益虫的数量都出现上升．它们会捕食蚜虫等害虫，从而间接起到防治虫害的效果。同时不仅是转基因棉花田受益，这些益虫还会进入邻近的大豆、花生、玉米等非转基因作物田．使整个地域的农田生态系统向有益方向发展。转Bt基因抗虫棉对鳞翅目靶标害虫具有良好的控制作用，减少了化学杀虫剂的使用，降低了对环境的污染，保证了人畜的安全，提高了农民的收益。Mat in等研究发现，印度转基因棉花单产相对增加34.3%．而中国只增加6.11%．美国更少．仅为2.36%。朱行等通过对印度种植转基因棉花研究发现，种植转基因棉花单产增加31%．杀虫剂使用量减少39%．利润增长88%，同时还保护环境，增进健康。Huang对农户种植Bt抗虫棉与非转基因棉的成本收益进行比较指出．农药施用量大幅度减
水稻转基因实验操作手册整理
水稻转基因实验操作 一、水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织） 1．消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗； 2）操作完毕用封口膜封好培养皿，在26℃培养箱，（光）暗培养10-15天； 3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26℃光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。(没有脱落的可在 原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱) 二、预培养 将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26℃暗培养4天。预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。乙酰丁香酮（AS）浓度为100 μM (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升) 三、农杆菌（工程菌）培养 把-70℃保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28℃，150 r/min振荡培养16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。 在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 ℃静止培养2-3 d。3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 ℃振荡培养3～4 h。分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600 四、感菌与共培养 1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次； 2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；