6 第六章 基因的转移与重组体的筛选和鉴定

2）受体细胞
3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率
第三节 重组子的筛选与鉴定
一、载体表型选择法 二、根据插入基因的表型选择 三、DNA电泳检测法 四、PCR检测法
五、核酸杂交检测法
六、免疫化学检测法
七、DNA序列分析
一、载体表型选择法
1. 抗药性标记及其插入失活选择法
nick缺口
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口 虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构 3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基
② 加尾－碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何片
段连接起来
④缺点： 操作繁琐；
外源片段难以回收；
同聚物尾巴影响外源 基因表达。 非酶切位点
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （2）衔接物（linker）连接
Linker： 用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数
3. 种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将目的基因插入到载体 的T-DNA区，形成重组 DNA
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将 重 组 DNA 转 入 含 有 Vir致病基因的农杆菌
（二）导入植物细胞
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点
请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保 护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外 ，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序 列。写出P1和P2的引物序列。
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
第六章 基因的转移与重组体的 筛选和鉴定
第一节 DNA的体外重组
DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组 合的DNA称为重组DNA。 一、粘性末端的连接 DNA 连 接 酶 把 相 互 靠 近 的 5’ 端 磷 酸 与
3’-OH连到一起
单酶切、双酶切
二、平末端（blunt end）的连接
1. 2. 3. 4. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导法 显微注射法 DEAE-葡萄糖转染法
（三）导入动物细胞
1. 磷酸钙沉淀法 原理： 通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入 哺乳动物细胞 依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10% 的细胞能吸收DNA沉淀。
操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、
3. PEG1000转化 PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化 4. 电击转化
（1）适于原生质体和完整细胞
（2）转化率高，105个 / g DNA
（3）单链转化率高于双链
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞
1. 载体介导的转化（农杆菌介导）
2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等）
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
三、Gateway 载体构建系统
（2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
√
第二节 重组体导入受体细胞
一、重组DNA导入大肠杆菌
（一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （二）转导（transduction） 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 （三）转染（transfection） 受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
三、转化率及影响因素
例：取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态
细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复
一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌
落，转化率为多少？
转化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg
（一）转化（transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation） （3）PEG介导的原生质体转化 （4）接合转化
（1）热激法
制备感受态细胞
① 目的 增加受体菌细胞膜的通透性 感受态细胞：处于能吸 收外源DNA分子的生理 状态的细胞
（1）热激法 制备感受态细胞 ② CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理
1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细 胞膨胀成球形，处于感受态； 2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase 的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；
3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；
个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸
EcoR I linker：
G多核苷酸激酶处理
（2）T4连接酶连接
（3）限制性内切酶消化
（4）目的片段与载体连接
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （3）DNA接头 （adapter）连接法
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列） P-P 5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’
DNA
吸附
1.2m钨弹头 外植体制备
装入
基因枪 轰击
外植体培养及选择
金属微粒加速，进入受体细胞
具 体 操 作
1. DNA微弹的制备
3. DNA微弹轰击
2. 外植体的制备
3. 电击法（电穿孔法） 纤维素酶 植物细胞
和果胶酶
原生质体
DNA
电击处理 选择培养
愈伤组织
混合入 电击缓冲液
分化
幼苗
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞
（二） 转
导
由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。 每g DNA能形成106个噬菌斑 （三） 转 染
噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接 被感受态细胞捕获的过程。 与转化无本质区别 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染
体 外 包 装 过 程
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
三、PCR产物的连接 2. 与T载体直接连接 PCR产物 载体
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
通过农杆菌侵染 植物外植体
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将含有外源目的基因的TDNA整合到植物细胞基因 组中，获得转基因植株
叶 盘 法 的 具 体 操 作
在饲养平皿的滤 纸上培养2天
2. 基因枪法（gene gun） 又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微 粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理
感受态
热激
插入外源基因的载体
40% PEG 4000
涂布选择性平板，筛选转化子
吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍
转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
三、转化率及影响因素
例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为 107 cfu / mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载 体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104 个重组克
隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？
104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。 5’ P3’ HO-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
5’ P3’ HO-
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚加尾法 ① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
dNTP
A
Taq DNA聚合酶
dTTP T
A
T
TA
TA
三、Gateway 载体构建系统
噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。
入门克隆
改造过的各种表达载体
三、Gateway 载体构建系统
（1）创建入门克隆 BP反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆
效果稳定，但转染效率低。