细 胞 工 程

细胞工程姓名吴俏指导教师高勇纲（吕梁高级实验中学理科1415班山西离石033000）摘要细胞工程是生物工程的一个重要方面。

总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。

当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。

通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。

关键词细胞核移植克隆。

一.细胞工程的介绍1.基本概念细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过某种工程学手段，在细胞水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质，从而获得新型生物或特种细胞产品、或产物的一门综合性科学技术。

2.详细概念细胞工程是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

21世纪合成生物学的发展，采用计算机辅助设计、DNA或基因合成技术，人工设计细胞的信号传导与基因表达调控网络，乃至整个基因组与细胞的人工设计与合成，从而刷新了基因工程与细胞工程技术，并将带来生物计算机、细胞制药厂、生物炼制石油等技术与产业革命。

二.发展历程1.植物细胞工程1902年，德国科学家哈伯兰特（G.Haberlandt）就提出了细胞全能性理论。

1937年，美国科学家怀特（P.R.White）用烟草茎段形成层作材料，在试管中培养出烟草植株。

1958年，美国科学家斯图尔德（F.C.Steward）等利用胡萝卜根的组织培养再次证明了植物细胞的全能性。

1965年，沃索（V.Vasil）等在一定成分的培养基上，由烟草的单细胞得到再生植株。

1970年，斯图尔德用悬浮培养的单个细胞也培养出可育的新植株，进一步证明了细胞的全能性。

20世纪70年代以植物细胞克隆为代表的细胞工程诞生。

随后，以植物的花药培养、原生质体培养，以及植物体细胞杂交技术得以确定和发展，标志着植物细胞工程技术进入高速发展的阶段。

2.动物细胞工程1907年，美国生物科学家哈里森（R.G.Harrison）用一地淋巴液心成功地培养了蝌蚪的神经元，证明了动物组织体外培养的可行性，并首创了动物体外组织培养法。

我国生物学家童第周，在20世纪60年代就开展了鱼类的细胞核移植工作，并取得了一些具有国际影响的成果，同时他还通过把黑斑蛙红细胞的核转移到同种生物的去核卵中，得到了正常发育的蝌蚪。

1975年，英国科学家米尔斯坦（stein）和德国科学家科勒（G.Köhler）等用产生抗体的单个细胞与肿瘤细胞杂交，创立了单克隆抗体技术。

1996年7月世界上第一只克隆羊多利（Dolly）在英国诞生。

其后仅两年时间克隆牛、克隆鼠也相继问世。

2011年11月3日，我国首例体细胞克隆牛康康在山东莱阳农学院动物胚胎工程中心实验室降生。

这一切表明，动物细胞工程技术，已经成为生物科学领域中一颗十分耀眼的明珠。

三.植物细胞工程1.植物细胞培养⑴概念：植物的组织培养（tissue culture）技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在下培养的技术。

通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。

⑵植物组织培养的过程：组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。

对于木本花卉来说，阔叶树可在一、二年生的枝条上采集，针叶树种多采种子内的子叶或胚轴，草本植物多采集茎尖。

在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。

1.先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。

2.在无菌坏境中将材料放入70%洒精中浸泡30-60秒。

3.再将材料移入漂白粉的饱和液或0.1%升汞水中消毒10分钟。

4.取出后用无菌水冲洗三、四次。

将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。

然后切成0.2-0.5厘米厚的小片，这就是外植体。

在操作中严禁用手触动材料。

1.接种在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种4-10个。

2.封口接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。

3.温度培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。

4.增殖外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。

把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。

增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。

5.根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。

1个月后即可获得键壮根系。

6．组培苗的移栽生根或形成根原基的试管苗从无菌，温、光、湿度稳定环境中进入到自然环境中，从异养过渡到自养过程，必须经过一个炼苗过程。

首先打开试管瓶塞放阳光充足处让其锻炼1～2天，然后取出幼苗用温水将琼脂冲洗掉，移栽到泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等组成的基质中，基质使用前需高温消毒，移栽后要适当遮荫，可用塑料薄膜覆盖，保持较高空气湿度，温度维持在25℃左右，勿使阳光直晒，7～10天后要注意通风和补充浇水，约20～40天，新梢开始生长后，小苗可转入正常管理。

7．诱导子在植物细胞培养中的研究进展1 诱导子的概念诱导子最初的概念是指那些能够诱导植物细胞生产和积累植保素的物质。

随着人们对诱导子的深入研究，发现诱导子还能诱导其它的防卫反应。

现代科学认为，诱导子是可以快速、专一和选择性地诱导植物多种特定基因表达的物质，尤其是活化特定的次生代谢产物。

从细胞培养的角度来讲，是指能促进植物细胞产生目的产物的因子[1]。

2 诱导子的分类诱导子可以分为内源性诱导子和外源性诱导子，特异性诱导子和非特异性诱导子，还可分为生物诱导子和非生物诱导子，生物诱导子主要包括病原菌(真菌、细菌、病毒与酵母)与植物细胞成分，其中主要是细胞壁水解产物，还有一些酵母提取物。

目前研究的热点是真菌诱导子和一些非生物诱导子。

2.1 真菌诱导子真菌诱导子(fungal elicitors)是来源于真菌细胞提取物或分泌物的一种特定的化学信号，能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达，进而促进植物产生和积累次级代谢物。

在植物细胞培养中，来源于真菌的细胞壁成分、多糖、单糖、糖蛋白等成分都可作为诱导子使用。

例如黑曲霉( Aspergillus niger )的菌丝提取物可大大提高喜树悬浮细胞的生长和次生代谢物的产量[2]。

目前, 内生真菌诱导子在植物细胞培养中的应用十分广泛, 尤其是在细胞悬浮培养和毛状根培养方面, 主要集中于真菌诱导子对药用植物生物碱、萜类、皂苷等天然产物的诱导。

2.2 非生物诱导子非生物诱导子是指非细胞中天然成分，但又能触发形成植保素的信号因子，主要是指一些非生物的物理和化学因子，如各种损伤、电击、高温、低温、pH值、紫外线、重金属、无机化合物、有机化合物等。

其中主要有水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)与茉莉酸甲酯(MJ)，研究发现适宜浓度的水杨酸、茉莉酸甲酯可以有效提高紫杉醇、喜树碱、异黄酮以及鱼腥草中槲皮素等次生代谢物的产量；其次是稀土元素，例如镧、铈等已用于植物细胞培养，且证实具有实较好的效果。

还包括一些重金属盐类，例如常见的铜、银、铁离子等。

3 诱导子在植物组织培养中的应用诱导子对次生代谢物的促进作用已在众多的植物细胞培养过程中得到了验证，其作用的效果依赖于多种因素，例如诱导子的类型、培养细胞的生理状态及一些非生物因子等。

在应用中要综合考虑这些因素对植物代谢的影响。

3.1 选择合适的诱导子大量研究表明，诱导子一般具有高度的专一性，不同植物品种及不同细胞系对诱导子的反应不同，同一植物对不同诱导子产生的反应因也不同，诱导不同植物的防御反应需要不同的诱导子，例如，花生四烯酸对其它的植物都无效，但却能诱导马铃薯、胡椒产生防卫反应[3]。

真菌诱导子能抑制丹参中酚酸类成分的积累, 却能促进酮类成分的积累，而茉莉酸甲酯则可以同时促进2种成分的积累。

梁晓芳[4]等发现茉莉酸甲酯不利于大豆悬浮培养细胞的生长。

3.2 诱导子浓度影响不同浓度的诱导子作用效果差异明显，次生代谢产物的合成会随着诱导子浓度的增加而增加，达到最大值后稳定，或者在某一最适浓度下诱导子表现出最强的活性，此后若继续增加浓度，效果反而下降。

有研究指出随着诱导子浓度的提高，苍术素细胞生物量出现了大幅度的降低。

3.3 诱导子添加时间的影响大量研究表明，不同时期的细胞对诱导子的反应灵敏度不同，一般在指数生长期晚期到稳定期早期这一阶段适合添加诱导子，因为生长初期的细胞需要适应新的营养液，代谢缓慢，此阶段不易受到诱导；而生长末期培养基中营养大量被消耗，且会积累有害物质导致细胞受损或代谢活动减弱，更不适合添加诱导子。

例如在原球茎培养的早期加入真菌诱导子，对原球茎的生长有一定的抑制作用，在原球茎培养的后期加入真菌诱导子，则有促进作用。

3.4 诱导时间长短的影响由于不同的植物细胞对诱导子产生防卫反应的速度不同，故针对不同的诱导子和不同的目标产物，诱导处理的时间有差异。

一般加入诱导子后次生代谢产物的含量开始提高，但一定时间后，次生代谢产物的含量反而下降，杨慧[5]等研究发现，诱导子的作用时间对原球茎多糖的含量有很大的影响。

3.5 不同诱导子间或前体物与诱导子间的联合应用许多实验结果表明，诱导子之间存在着协同效应。

研究发现杨酸和茉莉酸甲酯组合对西洋参次生代谢物皂苷含量的增加具有明显的协同作用。

水杨酸和真菌诱导子的共同作用有利于黄芪有用的次生代谢物的合成和积累。

也有研究表明前体物和诱导子联合作用能显著提高植有用物次生代谢物的产量。

例如，在肉苁悬浮细胞培养中联合加入前提和诱导子能大大提高苯乙醇总苷和松果菊苷的合成。

3.6 加入抗性剂大量研究表明，诱导子在大幅度提高目标产物的同时对细胞的生长会有抑制作用，例如在用真菌诱导子诱导喜树碱合成的过程中，细胞会发生不同程度的褐变，表明细胞开始衰老。

这种情况下，加入合适的抗褐变剂可以在不同程度上起到缓解的作用，抑制细胞内氧化酶的活性，维持细胞良好的生长和代谢。

3．7 诱导子的诱导效力与培养液的营养状态有关王晓东[6]等初步研究了真菌诱导后培养液状态与次生代谢物积累的关系，结果表明真菌诱导后白桦三萜合成的增加可能与培养液营养物质质量分数的变化相关。