基因定点突变技术
基因定点突变技术
4、大引物诱变法
首先用正向突变引物（M） 和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1）， 与野生型DNA分子混合后退火并 使之复性，第二轮PCR中加入正 向引物（F2），与PCR1中产生 的一条互补链配对，扩增产生带 有突变的双链DNA。由于F2中的 退火温度显著高于第一轮PCR所 使用的引物M和R1，因此，可忽 略引物M和R1在本轮反应中所造 成的干扰。
将待突变的目的基因
插入M13噬菌体载体 上，制备单链DNA
将合成的寡核酸片段
与单链模板退火，在 DNA聚合酶的作用下 合成互补的双链DNA 将双链DNA转化大肠 杆菌，获得突变基因
突变体的筛选：寡核
酸探针杂交筛选法
3、重叠延伸介导的定点诱变
首先将模板DNA分别分别与 引物对1（正向诱变引物FM和 反向引物R2）和2（正向引物 F2和反向诱变引物RM）退火， 通过PCR1和2反应扩增出两种 靶基因片段。FMR2和RMF2片段 在重叠区发生退火，用DNA聚 合酶补平缺口，形成全长双链 DNA，进行PCR3扩增。最后， 用引物F2和R2扩增出带有突变 位点的全长DNA片段（PCR4)。
PCR介导的定点突变的优势
1、突变体回收率高，有时不需要进行突变体筛选；
2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位所有反应； 4、快速简便，无需再噬菌体M13载体上进行分子克隆。
三、基因定点突变应用
近年来，由于突变技术使得人们可以按照自 己的意愿改造基因或蛋白质的产物，从而取得改 变后的产物，使其造福于人类。因此突变技术已 广泛应用在各个领域，具有着广阔的应用前景。 分为： 1、突变技术在蛋白质工程中的应用 2、ＤＮＡ缺失改造
２、ＤＮＡ缺失改造
心钠素（ＡＮＰ）和干扰素（ＩＦＮ）在临床上 有着非常诱人的应用前景。这两产物在大肠杆菌和酵 母系统中都能以融合蛋白的形式表达出来。但由于在 克隆过程中不可避免地引进了一些没有用的核苷酸序 列，这样表达出来的产物就与天然产物存在着一定的 差异。为了使克隆表达的产物与天然的产物一样，人 们便采用寡核苷酸指导的定点突变技术，成功地对这 些多余的核苷酸进行了缺失改造，以期得到正确的产 物。
热点微专题08 基因编辑技术及定点突变-2023年高考生物二轮复习(人教版2019)
得到含有突变位点的双链载体；
④最后将双链载体引入宿主细胞复制，
并进行筛选和鉴定。
知识拓展：基因定点突变技术
2．PCR定点突变技术 （1）重叠延伸PCR
①此技术共需四个引物 引物2和引物3的突起处代表与模板链不 能互补的突变位点，而这两条引物有部 分碱基（包括突变位点）是可以互补的。 ②分别利用引物1和引物2，引物3和引 物4进行PCR，得到两个DNA片段 ③得到的DNA片段可以通过引物2和引物 3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完 整的DNA片段。 ④最后，用引物1和引物4进行扩增得到 含有突变位点的DNA片段。
①首先人工合成一段含有特定突变位
点的单链寡核苷酸片段（除突变位点外，
该片段的其他部分可以与目的基因互补
配对）
②然后将该寡核苷酸片段与带有目的
基因的单链载体（通常由M13噬菌体衍生
而来）进行杂交；
M13噬菌体是一种丝状噬菌体， 内有一个环状单链DNA分子
③继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作
用下分别进行DNA链的合成和连接反应，
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基构因建，改有良的基质因粒组为质空粒白时质破粒坏，了将含上 述组件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培L养ac一Z基段因时(间因后)，，含再该将质菌粒液的涂大布肠在含 氨苄青霉素和__β__-_半__乳__糖__苷___的平板上。一段时间后杆，菌在不培能养分基解上β出-现半白乳色糖和苷蓝产色生两蓝种 菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是__色__物__质__（_。变），菌落为白色（果）
二轮微专题— 基因组编辑技术及定点突变技术
一、基因组编辑技术
• 【情境原理】 • 1.基因组编辑的含义:对基因进行定点修改,以改变目的基因的序列和功能,进行基因治
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变是指在基因组中特定的位置发生的变异事件。
这些定点
突变可以是单个碱基的替代、插入或删除，也可以是染色体片段的重排和
结构变化。
基因定点突变是遗传学和分子生物学研究中的重要技术，具有
广泛的应用前景。
在基因定点突变的研究中，常用的方法包括基于随机突变和基于定点
突变的方法。
一、基于随机突变的方法：
1.化学诱变：通过化学物质如亚硫酸乙基甲酯(EMS)或N-亚硝基-N-
乙基脲(ENU)等诱导基因组范围内的突变。
这些突变通过对群体进行筛选
和筛选，从而找到目标基因的突变。
2.辐射突变：用射线如X射线、γ射线，或放射性物质如乙烯基腈，等辐射处理生物体，以诱导其基因组上的随机突变。
基于随机突变的方法广泛应用于物种、疾病、发育和进化等研究中。
它们可以帮助揭示基因功能的重要性和与特定物种和表型相关的基因。
二、基于定点突变的方法：
1.基因敲除/敲入：通过合成受损的DNA片段或外源DNA片段，将其
导入到目标基因中，从而造成其功能异常或置换为新的基因序列。
这种方
法可用于明确或验证基因的功能，并探索特定突变的表型影响。
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术是一种用于改变特定基因序列的方法。
它可以被用于研究基因功能，以及开发新的基因治疗方法。
基因定点突变技术的原理是利用特定的酶切位点或特异性识别序列，将新的DNA序列插入到目标基因中。
这种技术通常使用质粒或病毒载体来将新的DNA序列导入目标
基因中，然后使用细胞转染或转化的方法将质粒或病毒载体导入细胞中，从而实现对目标基因的改变。
基因定点突变技术不仅可以用于改变单个基因的序列，还可以被用于删除或插入多个基因。
这种技术的应用非常广泛，包括基因治疗、基因工程以及基因组学研究等领域。
但是基因定点突变技术也存在一些挑战，包括技术成本高、效率低、难以操作等问题。
因此，不同的实验室和公司都在开发新的基因定点突变技术，以突破这些技术难关。
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基因定点突变技术原理
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术是现代分子生物学研究中常用的一种技术手段。
该技术可以精准地改变靶标基因的某些特定位点，从而实现研究基因功能、疾病机理等方面的目的。
该技术主要基于人工合成的DNA片段与目标基因的同源重组，以实现基因定点突变。
具体来说，该技术分为两个步骤：首先，利用PCR技术、化学合成等手段，合成出目标基因的突变片段。
其次，将突变片段与目标基因进行同源重组，从而在特定位点引入突变。
基因定点突变技术的主要优点是可以精准地改变目标基因的某些特定位点，不影响其它部分的结构和功能。
同时，该技术可以对不同类型的生物进行操作，包括细菌、酵母、植物、动物等。
因此，该技术在研究基因功能、疾病机理、农业生产等方面具有广泛的应用前景。
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基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略基因定点突变是指基因序列中的一些碱基发生了改变，可以是单个碱基的替换、插入或删除。
这种突变一般发生在DNA的编码区域，会导致蛋白质的氨基酸序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。
基因定点突变在许多遗传病和疾病中起着重要的作用。
以下是关于基因定点突变的全攻略。
1.基因定点突变的类型基因定点突变可以分为三类：错义突变、无义突变和非义突变。
错义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，从而使蛋白质的氨基酸序列发生了改变。
无义突变是指被改变的碱基导致了密码子的提前终止，从而使蛋白质的合成过早终止。
非义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，但不会改变蛋白质的合成。
2.基因定点突变的起因基因定点突变可以由多种因素引起，如自然突变、致突变剂和辐射。
自然突变是指在正常细胞分裂和DNA复制过程中产生的突变。
致突变剂是指能够引起DNA突变的化学物质或物理因素，如化学药物、辐射等。
辐射包括离子辐射和非离子辐射，如X射线、紫外线等。
3.检测和诊断基因定点突变检测和诊断基因定点突变可以通过分子生物学技术进行，如PCR、DNA测序和核酸杂交等。
PCR可以扩增特定的DNA片段，从而使突变的碱基更容易被检测到。
DNA测序可以确定基因序列的每个碱基，从而找到突变的位置和类型。
核酸杂交可以通过与已知突变序列杂交，检测是否存在突变。
4.基因定点突变的遗传5.基因定点突变与疾病总结：基因定点突变是基因序列中的一些碱基发生改变，影响蛋白质的功能。
基因定点突变可以分为错义突变、无义突变和非义突变。
突变的原因包括自然突变、致突变剂和辐射。
基因定点突变的检测和诊断可以通过分子生物学技术进行。
基因定点突变可以遗传给后代，影响他们的生长和发育。
基因定点突变在许多疾病中起着重要作用，了解基因突变对于早期诊断和治疗具有重要意义。
基因定点突变
PCR介导的定点突变
人工合成 具有突变 序列的 DNA片段
野生型基因
盒式诱变
应用：SOD酶化学修饰研究：
天然的SOD 稳定性较差，具有免疫原性，功能相 对单一，而限制了其应用，化学修饰可以增强酶稳 定性，降低免疫原性。 2003 年，赵数进，尹亮等用相对分子量为 2000~20000的PEG 修饰SOD，发现相对分 子量为6000 的PEG 修饰效果好 1986 年，袁勤生等用高碘酸钠氧化右旋糖酐成 二醛修饰SOD, 实验表明，修饰酶不仅完全保留了 天然酶的活性，而且在耐热性、耐酸性，抗胃蛋白 酶水解的能力等方面明显优于天然酶。
结果
定点突变后3个质粒测序结果及突变前后序 列对比3个质粒的测序结果有2种，分别和文 献的Cu，Zn-SOD序列对比： 其中1个质粒测序结果和Cu,Zn-SOD基因 序列完全一致，说明突变未成功； 另外2个质粒分别有2个碱基和Cu,Zn-SOD 因序列不同，也就是Cys的密码子TGC变成 了Ala的密码子GCC，其他序列与Cu，ZnSOD基因一致，符合预期要求。
PCR定点突变
整个反应体系为50μl，其中含无菌去离 子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、 P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约 100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应 条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性 1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个 循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
简述pcr技术在基因定点突变中的应用。
标题：PCR技术在基因定点突变中的应用一、PCR技术的概念和原理聚合酶链式反应（PCR）是一种通过复制DNA分子来合成特定DNA序列的技术。
它是由美国生物化学家卡里·穆利斯在1983年首次发明的。
PCR技术可以扩增DNA分子，使之成百上千倍地增加，从而在实验室中方便地进行各种分子生物学研究。
PCR技术的原理是利用DNA聚合酶酶制造复制DNA的过程。
在反应体系中，向DNA模板添加适当的引物，通过多次循环的热循环，使DNA聚合酶依次在模板DNA的两条链上合成新的DNA链，从而实现了DNA分子的扩增。
二、PCR技术在基因定点突变中的应用1.基因定点突变的概念基因定点突变是指DNA序列中的单个碱基（A、T、C、G）发生改变，从而产生了新的等位基因。
这种突变是基因在漫长的演化过程中逐渐积累的结果，对生物的遗传性状和适应环境具有重要影响。
2.PCR技术在基因定点突变中的原理通过PCR技术，可以利用特定的引物扩增出含有突变位点的DNA片段。
通过生物信息学方法设计出含有突变位点的引物，然后将这些引物与待扩增DNA片段进行PCR反应。
在PCR反应中，引物会与模板DNA特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下，扩增出所需的DNA片段。
通过测序技术验证PCR产物是否成功扩增，并鉴定突变位点的具体情况。
3.PCR技术在基因定点突变研究中的应用（1）基因工程PCR技术在基因工程中被广泛应用，可以通过基因定点突变来改变特定基因的编码序列，从而获得具有特定功能的重组蛋白质。
利用PCR技术可以在基因的编码序列中引入特定的突变位点，使其产生特定的生物学效应。
（2）遗传疾病研究在遗传疾病研究中，PCR技术可以用来检测基因中的特定突变位点，从而帮助科研人员了解遗传疾病的发病机制。
通过PCR扩增获得含有突变位点的DNA片段，然后进行测序分析，可以帮助科研人员研究遗传病的发病机制，并为临床治疗提供理论依据。
（3）生物多样性研究在生物多样性研究中，PCR技术可以用来检测不同基因型之间的差异，从而帮助科研人员了解不同裙体之间的遗传差异。
基因定点突变技术
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
基因已被定向修改
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提 高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
基因定点突变DNA实验技术方法
基因定点突变DNA实验技术方法要研究和检测基因定点突变，需要使用一系列的实验技术方法。
以下是几种常用的DNA实验技术方法：1.基因测序技术基因测序技术是研究基因组突变的关键方法之一、它可以将DNA分子按顺序解码，并确定单个核苷酸的序列。
经过多年的发展，现在有很多种基因测序技术可供选择，如Sanger测序、Illumina测序、PacBio测序和单分子DNA测序。
这些技术可以高效地测定基因组中各个位置的核苷酸序列，并揭示基因定点突变的存在。
2.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种用于扩增特定DNA片段的方法，可以在PCR反应过程中选择性地扩增感兴趣的基因片段。
对于基因定点突变的研究，PCR可以用来扩增包含突变位点的DNA片段，并通过测序分析来确定突变的类型。
3.引物延伸法引物延伸法是一种常用的检测单核苷酸多态性（SNP）和点突变的方法。
该方法使用引物和DNA聚合酶来识别特定位点，并从该位点延伸引物，以确定突变的存在与否。
引物延伸法可以用于快速、高效地检测多个位点的突变。
4. 限制性酶切酶（Restriction Enzyme Digestion）限制性酶切酶可以通过识别特定的DNA序列并在该序列周围切割DNA来检测和分析基因定点突变。
当突变中产生或消失限制性酶切位点时，可以通过酶切后的DNA片段的大小变化来检测突变。
5. DNA芯片技术（DNA Microarray）DNA芯片技术是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测和比较大量的基因表达水平。
通过将DNA分子固定在芯片的表面并用荧光探针进行杂交反应，可以检测不同样品中基因定点突变的存在。
以上是几种常用的DNA实验技术方法，用于研究和检测基因定点突变。
随着技术的不断发展和创新，这些方法将进一步提高灵敏度和分辨率，为基因定点突变的研究提供更多的选择和可能性。
基因定点突变技术简介-sill
基因定点突变技术简介：一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。
而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。
基因定点突变主要有以下三种方法：1.寡核苷酸介导的定点突变该方法以M13噬菌体的DNA为载体，在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA。
再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子。
Stratagene公司研制了QuikChangeLightning Site-Directed Mutagenesis Kit即是在此种方法上进行改良的：以含目的DNA的质粒为模板，在要突变处设计一对反向互补的引物，用高保真酶进行扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物转化进大肠杆菌就可以。
2．盒式定点突变该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。
这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。
由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。
但这种方法需要在靶DNA区段的两侧存在一对限制酶单切点，限制了该方法的使用。
3.PCR介导的定点突变经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。
头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA 片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。
定点突变技术
操作：设计引物，分别PCR，前两次PCR 反应产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后无需 纯化,直接将胶条切下置于EP管中, 80℃冷冻10min,然后将胶条离心后分 别取上清液作为模板进行第三次PCR,以 获得全长的突变目的基因
PCR介导的定点突变法其优点是操作较简 单，突变的成功率可达100%。但它亦 有两个缺点:①后续工作较复杂，PCR扩 增产物通常需要连接到载体分子上，然
寡核有酸引物介导的定点突变 法其优点是保真度比PCR突变法 高，经过改进后使该方法突变少 成功率大大提高，缺点是操作过 程环节复杂制。
盒式突变法具有简单易行、突变效率高 等优点，还可以在一对限制酶切位点内 一次突变多个位点。缺点是合成多条引 物的成本较高。另外，在一般情况下， 在靶DNA片段的两侧往往难以满足存在 一对限制性酶切位点的要求，限 制了该 方法的广泛应用。然而一旦具备了这样 的条件该方法则为首选。
定点突变技术
刘微
基因的定点突变技术
点突变的技术有很多种，常见的有： ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
（M13噬菌体法） ㈡ 盒式诱变 ㈢PCR点突变技术
1.引物PCR定点诱变法 2.重组PCR定点诱变法 3.重叠延伸PCR技术
寡核苷酸引物诱变技术 （M13噬菌体）
噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体 粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后， 通过复制以双链形式存在。将待研究的基因 插入载体M13，制得单链模板，人工合成一 段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基） 作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶 连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双 链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类 型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。
重组PCR定点诱变2
操作：设计引物，分别PCR， 从两个PCR反 应管中各取出3μl PCR反应产物,混匀后用 CaCl2转化法转化至感受态大肠杆菌中。涂 平板后,从转化的细菌菌落中随机挑选若干,筛 选。
《基因的定点突变》课件
基因定点突变的意义
基因定点突变有助于深入了解基因的 结构和功能，揭示生命活动的本质和 规律。
通过基因定点突变技术，可以实现对 特定基因的精确调控，为疾病治疗、 新药研发、生物育种等领域提供有力 支持。
基因定点突变的分类
筛选方法包括抗生素筛选、PCR鉴定 等，根据实验需求选择合适的方法。
04 基因定点突变的实验结果分析
突变基因的鉴定
01
02
03
突变基因的识别
通过DNA测序技术，对突 变基因进行精确的识别和 定位。
突变类型的分类
根据突变碱基的数量，将 突变基因分为点突变、插 入和删除突变等类型。
突变位点的统计
统计突变位点的分布和频 率，分析突变热点和区域 。
根据突变的方式，基因定点突变可分为碱基替换突变和插入/ 缺失突变。
根据突变的目的，基因定点突变可分为正向突变和反向突变 。正向突变是指将野生型基因突变为功能变异型基因，而反 向突变是指将功能变异型基因突变为野生型基因。
02 基因定点突变的方法
逆转录酶法
总结词
逆转录酶法是一种利用逆转录酶将RNA转化为cDNA的方法，适用于基因的定 点突变。
03
引物长度一般在1530bp之间，以保证足够 的特异性。
04
引物设计还需考虑突变 后可能的遗传信息改变 ，如密码子改变等。
合成突变基因
在成功设计引物后， 需通过DNA合成仪 合成突变基因。
合成后的突变基因需 进行质量检测，确保 其准确性。
合成过程中需确保突 变位点的准确性，避 免其他位点的突变。
锌指核酸酶法
总结词
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变的原理和应用
基因定点突变的原理和应用1. 引言基因定点突变是指基因组中特定位置上的突变事件，它在遗传学研究、分子生物学研究以及生物工程等领域中具有重要的应用。
本文将介绍基因定点突变的原理和应用，并探讨其在科学研究和生物技术领域的潜力。
2. 基因定点突变的原理基因组中的定点突变可以通过多种机制产生，包括点突变、缺失、插入和替换等。
下面将介绍几种常见的基因定点突变的原理。
2.1 点突变点突变是指基因组中发生的单个碱基的改变。
它可以包括碱基替换、碱基插入和碱基缺失等不同类型。
点突变的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.2 缺失和插入缺失和插入是指基因组中发生的多个碱基的改变。
缺失是指某个区域的碱基突然丧失，而插入则是指某个区域多出了一个或多个碱基。
缺失和插入的原因可以是DNA复制过程中的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.3 替换替换是指基因组中的某个碱基被另一个碱基替换的现象。
替换可以是同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸一致；也可以是非同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸不同。
替换的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
3. 基因定点突变的应用基因定点突变在科学研究和生物技术领域有着广泛的应用。
下面将介绍几个常见的应用领域。
3.1 基因功能研究基因定点突变可以用来研究基因的功能。
通过人为地引入特定的突变，可以观察到这些突变如何影响基因的表达或功能，从而揭示基因的作用机制。
这对于理解基因与疾病之间的关系以及探索基因功能具有重要意义。
3.2 遗传疾病研究基因定点突变对于遗传疾病的研究也具有重要意义。
通过研究疾病相关基因的突变情况，可以了解突变对基因功能的影响，进而揭示疾病的发生机制。
这对于预防和治疗遗传疾病具有重要的指导意义。
3.3 基因工程基因定点突变在基因工程中有着广泛的应用。
通过引入特定的突变，可以改变目标基因的功能或表达水平，从而实现对生物体的改造。
定点突变技术ppt课件
位点特异性突变的类型
• 寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱
基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作 用下启动DNA分子进行复制。
• 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变
序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相 应序列。
• PCR介导的基因突变
Kunkel 法
原理
在E. coli中
dUTP
dUMP
优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高， 因此运用非常广泛
同时利用重叠延伸PCR机设可以对基因中 心区段进行取代、插入、缺失的突变
各种方法的比较
寡聚核苷酸介导的突变 盒式突变
PCR介导的突变
优 点
保真度高
缺 操作复杂 点 周期长
简单易行 突变效率高
合成多条引物成本 高 受到酶切位点的限 制
操作简单 突变成功率高
后续工作复杂 TapDNA聚合酶 保真性偏低
应用
• 一步反向PCR法 • Stratagen 公 司 的
Quickchange试剂盒
一种简便快速的定点突变的方法
• Stratagen 公 司 研 制 的 Quickchange 试 剂 盒,可以双链DNA质粒为模板,只需一对 引物，进行一次PCR,在1～2d内即可完 成点突变过程。
Oligo诱导突变的改进方法
• 武汉大学的叶林柏等人对Oligo诱导 突变方法进行了改进。2-3个核苷酸 替换的突变频率可达80%-85%，即使 是需要有道连续4个氨基酸缺失，突 变频率也高达40%－５０％。
原Kunkel 法
DNA聚合酶和T4 连接 酶同步加入 直ຫໍສະໝຸດ 用反应混合物转 染 转染效率：3个空斑
改进后的方法
分级退火，冰浴稳固异 源双链再加T4 连接酶 经酚-仿抽提后再进行 转染 转染效率：78个空斑
基因定点突变技术
定点突破旳措施
• 寡核苷酸介导旳基因突变指用具有突变碱基旳寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶旳作用下开启DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成旳含基因突变序列旳寡核
苷酸片段，取代野生型基因中旳相应序列。
• PCR介导旳基因突变
寡核苷酸介导旳定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 旳生物化学家 ( michael smith )发明 旳.
在分子生物学和基因工程中旳应用
探明未知序列旳构造和功能旳关系，如开启子诱变筛选，真 核旳TATA盒保守序列拟定。 载体构建：调控元件，强开启子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中旳应用
降低毒性，如TNF 变化亚型和种旳特异性，如IFN旳23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显变化，对人抗病毒活性不大于牛。 提升活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提升蛋白质作用旳专一性，如IFNβ旳9-56位被IFNa旳7-54位 取代后，活性提升40倍。
• 定点突变技术旳潜在应用领域很广，例如研究蛋白质相互 作用位点旳构造、改造酶旳不同活性或者动力学特征，改 造开启子或者DNA作用元件，引入新旳酶切位点，提升蛋白 旳抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白旳晶体构造，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变旳是基于PCR旳随机突变，经过变化PCR条件提 升PCR过程中旳随机犯错，这种措施合用于未知旳蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 但是这种措施因为没有目旳性，分析操作相当繁琐，而且不会出 现一种位点2个以上碱基突变，因而应用上有不足。定点突变合 用于蛋白构造已经有初步了解旳基因，比PCR随机突变更有目旳 性，也更为精确，简朴，同步改造基因愈加“随心所欲”。因为 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛旳应用前景，相信这 个技术在不远旳将来还会有更大旳改善和发展，也必将为更多人 熟悉应用。