培养基制作

四、培养基的制备

（一）背景知识介绍

细菌和其它生物体一样，在进行培养增殖的过程中，需要一个营养丰富、环境条件适宜的场所。培养基是由适合于细菌生长繁殖的营养物质配制而成的营养基质。制备培养基的目的在于给细菌创造良好的营养条件。由于细菌具有不同的类型，人们对细菌的研究目的也不同，应配制适合不同细菌生长以及按实验要求设计的不同培养基。但从营养角度分析，培养基一般均应含有满足细菌生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐类等。另外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定的缓冲能力。

1.培养基的类型

由于培养基名目繁多，种类各异。一般按培养基的成分、培养基的外观状态、培养基的功能把培养基分为不同的类型。

按培养基成分的了解可分为：

（1）天然培养基：（基本培养基）是指利用动、植物或其提取物制成的培养基，例如，培养细菌的肉膏蛋白胨培养基、培养酵母菌的麦芽汁培养基等。此种培养基取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便。但是其中的成分不甚清楚，不利于做精确的科学实验。我们的实验常使用此类培养基。

（2）组合培养基：（合成培养基）是指用多种高纯化学试剂配制成的、各成分的量都确切知道的培养基。例如培养细菌的葡萄糖铵盐培养基；培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基。此培养基价格较贵，配制较烦琐，有利于做精确的科学实验。我们的实验一般都不用。

（3）半合成培养基：是在天然培养基中加入少量已知的化学物质配制而成的。如培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基。

按培养基外观的物理状态，可分为：

（1）固体培养基：在液体培养基中加入1％～2％琼脂作凝固剂，就可以制成遇热可融化、冷却可凝固的固体培养基。琼脂又名洋菜，其熔点是96℃，凝点是40℃，所以在一般细菌培养温度下呈固体状态。固体培养基在微生物的科研和实验中，具有极其广泛的用途，如菌种的分离鉴定、菌落计数、菌种的保存等。前面的细菌实验研究中，我们主要用此培养基。

（2）液体培养基：是指未加凝固剂、呈液态的培养基。其组成成分均匀，细菌能充分接触和利用养料，适宜作生理研究用。

（3）半固体培养基：在液体培养基中加入0.2％～0.5％的琼脂制成的培养基，可用于观察细菌的运动。

按培养基的特殊用途可分为：

（1）加富培养基：是指在培养基中加入人血、血清、动植物组织提取液，培养要求比较苛刻的细菌。

（2）选择培养基：根据某一种微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性设计的培养基。利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。如根据某菌对碳源、氮源等营养物质的特殊要求设计的培养基，可以分离到能分解某些物质的微生物；在培养基中加入某种化学物质，可以抑制不需要的微生物生长繁殖，如青霉素、四环素、链霉素能抑制细菌和放线菌的生长，结晶紫抑制革兰氏阳性细菌的生长等。选择培养的理化因素有温度、氧气、pH值等。

（3）鉴别培养基：是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。

2.配制培养基的注意事项

首先应注意营养成分的配比要恰当。我们一般按照培养基的配方进行配制即可；其二要注意控制培养条件。各类微生物所要求的pH值不同，细菌生长所需pH

值在中性或微碱性（pH在7.0～7.5）。由于微生物代谢引起培养基酸碱度的变化，往往会造成对生长的抑制。因此，为了保持培养基pH值的相对稳定，要在培养基中加入一些缓冲剂，由K2HPO4和KH2PO4组成的混合物是常用的缓冲剂。其三配制培养基时注意营养物质要有适合的浓度。浓度太低时不能满足生长需要；太高由于渗透压太大，也能抑制生长。

3.配制培养基的过程

称量→溶化→调节pH值→过滤→分装→塞棉塞和包扎→灭菌。

（1）称量：按照培养基配方，准确称取各成分放入烧杯中。有些原料用量少，不易称量，可先配成高浓度溶液，再按比例换算后，取一定量加入烧杯中。

（2）溶化：加入所需要的水量搅匀，然后加热使其溶解。有些原料不易溶解，如蛋白胨、牛肉膏等，可先在小容器中加水少许，加热溶解后倒入烧杯中。配制固体培养基时，在琼脂熔化过程中要不断搅拌，并控制火力，防止培养基溢出或烧焦。当培养基完全熔化后要补足水分。

（3）调酸碱度（pH值）：先用pH试纸进行比色。如果偏酸或偏碱，可用10％HCI和10％NaOH调整pH值至所需范围。

（4）过滤：培养基中有些成分没完全溶解，则需过滤。常用滤纸、纱布（叠成6层）或纱布间加脱脂棉花过滤。加琼脂的培养基要趁热过滤。

（5）分装：根据需要将培养基分装各种不同的容器中。固体培养基都要趁热分装，各容器的量如下：

三角瓶：一般不超过1/2；试管：视需要而定，若制斜面一般装管高的1/5或1/4；倒平板一般是用时再倒。

分装时应避免培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞而引起污染。

（6）塞棉塞和包扎：分装后试管口及瓶口都要塞好棉塞。做棉塞用普通棉花，其形状、大小、松紧与管口和瓶口要吻合，棉塞1/3露于管外，2/3塞进管内。棉塞的制作和塞入的正确方法见图4-7。

棉塞塞好后，外包厚纸（牛皮纸一层或用旧报纸二层），用绳捆扎。包扎的作用是避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞，并防止接种前培养基的水分散失或污染杂菌。

（7）灭菌：经过分装、包扎的培养基应立即进行灭菌。灭菌的方法一般采用高压蒸汽灭菌，如果没有高压灭菌锅，可采用间歇灭菌法。

高压蒸汽灭菌：是常用的灭菌方法，一般培养基、水、玻璃器皿、用具都可用此方法灭菌。其灭菌的原理是：水的沸点可随压力的增加而提高，当水在密闭的高压锅中沸腾时，其蒸汽不能溢出，致使压力增加，水的沸点和温度也随之增高。高压蒸汽灭菌时蒸汽压与温度的关系如下表。

在热蒸汽的条件下，细菌的芽孢在120℃，经20～30分钟可全部被杀死。因此，一般培养基灭菌时，在15磅/英寸2蒸汽压、121℃温度下，30分钟即可达到灭菌目的。如果培养基中有葡萄糖、乳糖、牛奶等不耐高温的物质时，可在8磅/英寸2经15～20分钟也可使用，但这样灭菌的培养基，应经过保温培养，检查无菌生长后，及时使用，不宜存放。

间歇灭菌：在没有高压灭菌锅时，可采用此方法。其方法是在普通蒸锅中放入培养基，在100℃的温度下蒸30～60分钟。然后放入25～30℃环境中24小时后，再蒸第二次；蒸后再放入25～30℃环境中24小时，然后再蒸第三次。

（二）课题提出

细菌是单细胞，其个体又小，所需营养并不多，但非常容易受环境影响。又由于微生物除了细菌外，还有放线菌、真菌等，它们和细菌混杂在一起，构成自然界的微生物群。这几种微小生物对营养物质的要求、培养所需的pH值等都有较大的差异。如营养物质中的碳源和氮源的比例上（碳/氮），细菌约为碳5/氮1，而霉菌则为碳10/氮1。而且碳源和氮源的物质也有区别。细菌所需酸碱度为中性或微碱性（7.0～7.5），霉菌偏酸牲（4.5～6.0）。我们可以根据细菌对营养等方面的要求和与其它微生物的区别，配制不同的培养基，选择我们需要的菌种。就细菌本身来讲，在营养、温度等方面，不同的细菌也有区别。现在对食用细菌的研究、病原细菌的研究及与工业农业有关的细菌研究上，科研人员都是利用细菌的这些特点，培养和筛选出对人们有利的细菌。我们也可以围绕这方面设计一些课题进行研究。如进行水质调查时和土壤细菌的分离时，能否配制不同的培养基，观察哪种对细菌有利；还可以配制不同的酸碱度，了解细菌最适的pH值是多少；还可以改变培养条件如温度、氧气浓度等，都能作为课题进行研究。

（三）活动范例

1.活动范例1

【活动课题】鉴别细菌培养基的配制。

【课题概述】土壤中微生物的种类、数量都很多，其中细菌的量是最多的。那么土壤细菌在哪一种培养基中容易生长呢？

【活动过程】

（1）样品的采集：在肥沃的土壤据地表3～5cm深度采集新鲜土壤，放入干净的容器中。

（2）制备培养基：按下面配方称量。

培养基①：牛肉膏0.3g 蛋白胨1g

NaCI0.5g 琼脂2g