流式细胞仪试验方法2
BDFACSCalibur流式细胞术标准操作规程
BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目的：规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。
适用范围：本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。
责任者：操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。
保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。
科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。
内容：1.每日开机程序1.1在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：1.1.1鞘液充满状态，约3L1.1.2盖紧盖子1.1.3安上金属挡板1.1.4管路畅通，无扭曲1.2.检查废液桶，确认：1.2.1废液桶充满400ml漂白剂1.2.2管路畅通，无扭曲1.3打开流式细胞仪。
1.4打开电脑。
1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。
1.6做Prime。
1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。
2.每日关机程序2.1用3mlFACSCIean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。
2.2将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。
2.3将样品管换成蒸馏水重复1-2步。
2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。
2.5选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。
2.6退出所有应用软件，关闭电脑。
2.7将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。
3.每月维护程序3.1将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。
3.2旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联到SANLINE FILTER 端口），以防伤害。
3.3将盛有3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30 分钟。
3.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以HI RUN 60 分钟。
3.5将鞘液桶装满鞘液，恢复过滤器。
BD流式细胞仪操作说明
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3. 仪器面板：
m 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 o 流速控制：
.c LO： 样品流速：12 μl /min
MED：样品流速：35 μl /min
雷射光源。） 7. 倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。 8. 将减压阀放在「VENT 漏气」位置。将鞘流液筒充填至八分满。 9. 退出软件“File”Æ“Quit”(如有对话选项，选择“Don‘t save”)。确认退出
计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。 10. 关闭计算机。“Spheral Blood Mononuclear Cell Procedure
w • Leukemia and Lymphoma Procedure 1 w • Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay
秀 • 间接免疫荧光染色
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三、上机分析流程
建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。 （1）Negative Control（不加任何抗体）。 （2）CD3-FITC（FL1 单染）。 （3）CD19-PE（FL2 单染）。 （4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。
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1.2 Macintosh 计算机与打印机：
流式细胞仪(Flow Cytometer)基本原理
FL-2(-)
FITC 单标
FL2 - %FL1
Before Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(FITC)
PE 单标
FL-2(PE)
FL1 - %FL2
FL-2(PE)
After Compensation
FL-1(FITC)
FL-1(-)
什么样的补偿最合适？
单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median 值相等时为最合适的补偿。
非特异性染色
抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合； 抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。
同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同 种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非 特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。
实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体; 同型对照：未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC，相同剂量。
侧向散射光SSC
SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射 光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。
散射光的作用
实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
粒细胞
单核细胞
淋巴细胞
红细胞、死细胞和碎片
通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。
1、流式细胞术简介
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检 测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的 理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。
流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、 流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光 化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。
流式细胞仪
流式细胞仪的机型
1. 台式机 检测和分析 B.D. : FACSCalibur; LSRII; LSRI
2. 大型机 分选细胞 B.D. : FACSVantage ；FACSAria Beckman Coulter: MoFlo （DAKO）
荧光抗体的搭配
理论上，不同通道检测的参数可以同时进 行检测。但是如果进行3个荧光参数的检测， 尽可能的选择只需要调节一对参数之间的 补偿的荧光。 如，FL1+FL2+FL4; FL1+FL3+FL4; 注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。
流式细胞仪的数据显示和分析
一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。 1．单参数数据显示和分析— 一维直方图
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
SSC 与入射光成 90 ° 的光，与 细胞内部复杂度 相关，颗粒密度
90LS Sensor
根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核 细胞和粒细胞分开
荧光参数 自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧
光分子经激光照射后发出的荧光信号。 自发荧光的细胞成分： 核黄素，细胞色素等。 死亡细胞的自发荧光较高 需要设置阴性对照。
F/P FITC, PerCP: 2-9; APC, PE: 1; PE-Cy7, APC-Cy7: 1, N;
抗原密度 高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC
染色指数 自发荧光
高：APC； 低：FITC 非特异形结合
FcR; 荧光自身
直接标记
ELISA 方法+流式细胞术
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1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
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（1）液流系统
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液流系统示意图
喷嘴 鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
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（2）光学系统
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光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
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ELISA封闭原理
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液 再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些 空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1% 明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭。
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ELISA数据分析方法
b。标本/阴性对照比值 在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断 法较为合适。在得出标本（ S）和阴性对照（N）的A值后，计算 S/N值。在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准， 现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各 自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检 物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白 质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清 的本底低得多。因此 ，这类试剂盒规，如N<0.05（或其他数值）， 则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。
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显色原理
HRP的底物 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等 TMB TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。 TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2 溶 液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB 又有无致癌性等优点,酶反应用H2SO4终止后，TMB产 物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长 为405nm。
流式细胞仪结果分析
CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例
六、自身免疫病相关HLA抗原分析
HLA-B27可出现在58%～97%的强直 性脊椎炎 As 患者
七、移植免疫中的应用
FCM作为一个强大的技术平台,已应用于多个领 域,其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛， 目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞 术的交叉配型 Flow cytometry cross-matching, FCXM 和群体反应性抗体 Panel reactive antibody, PRA 检测，
样本来源：各种细胞 如外（ZHOU）血,骨 髓,实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞 ,微生 物,人工合成微球等， 检测大小：一般是0.5um～40um
流式细胞仪的组成
液流系统 光学系统 数据处理系统
分选系统
分析型流式细胞仪
分选型流式细胞仪
液1 液流流系统
流动室
流动室 Flow cell 是液流系统的核心部件,流动室是由石英 玻璃制成,单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动 室内一定孔径的孔,检测区在该孔的中心,细胞在此与激光 垂直相交，
荧光染料的特性
•激发波长 EXCITING •发射波长 EMISSION
荧光补偿
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选主 要是在对具有某种特征的细胞需进 一步培养和研究时进行的，
一 分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
微小的乳胶微球分别染成上百 种不同的荧光色 固相芯片是用 探针在芯片上的坐标位置给基 因的特异性编码；而液相芯片 则是用颜色来编码
应用流式细胞仪检测细胞凋亡的4种方法的比较
应用流式细胞仪检测细胞凋亡的4种方法的比较范宁娟;项萍;段敏【摘要】[目的]比较4种测定细胞凋亡方法的优缺点.[方法]应用流式细胞仪,分别采用PI单染法、Annexin V-FITC/PI复染法、罗丹明123染色法及Fluo-3染色法测定细胞凋亡.[结果]每种分析方法均有自己优势和不足,在检测过程中应进行多参数分析.[结论]该研究可为后续研究提供试验方法支持.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(042)032【总页数】3页(P11240-11242)【关键词】流式细胞仪;细胞凋亡;检测方法【作者】范宁娟;项萍;段敏【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S1088;G306.01972年，Kerr等[1]首次提出细胞凋亡(Apoptosis, APO)的概念，宣告对细胞凋亡探索的真正开始。
细胞凋亡是细胞在多重因素参与调控下正常的、自动死亡的生理过程。
它不同于一般意义上的细胞坏死。
异常凋亡状态的出现会导致多种疾病的发生[2-4]。
因此，细胞凋亡的检测在生物学研究中备受关注。
流式细胞仪(Flow cytometry，FCM)是20世纪70年代发展起来的高科技产品[5-7]，在检测细胞凋亡方面具有简单、快速和敏感性高的特点，是研究细胞凋亡的主要手段[8-9]。
笔者使用PARTEC 流式细胞仪，通过比较PI单染法、Annexin V-FITC/ PI复染法、罗丹明123染色法及Fluo-3染色法4种测定细胞凋亡的方法，分析优缺点，以期为后续研究提供理论和试验支持。
1.1 试验材料人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自武汉细胞库，脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)购自sigma 公司，细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、罗丹明123膜电位检测试剂盒、Fluo-3钙离子浓度检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。
流式细胞仪工作原理与应用范围
流式细胞仪工作原理与应用范围2008-11-01 10:30流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。
流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
工作原理将待测细胞染色后制成单细胞悬液。
用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。
经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。
光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。
计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。
单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。
一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。
细胞活性检测方法有哪些？
细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等。
目前常用的方法有很多,如有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、H放射性同位素掺入法、MTT法等。
本文总结了一些常用的细胞活性检测方法的原理、特点，并对比了各自的优缺点。
一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。
可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。
使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。
能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。
其中最常用的是台盼蓝染色法。
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。
通过细胞计数可得出细胞的存活率。
本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。
但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。
而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。
2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。
如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。
吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。
溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。
也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。
这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。
在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。
缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。
而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。
细胞增殖、活化、杀伤检测方法_解释说明以及概述
细胞增殖、活化、杀伤检测方法解释说明以及概述1. 引言1.1 概述细胞增殖、活化和杀伤是细胞生物学研究中的重要课题。
随着科技的不断进步，人们对细胞行为的了解也越来越深入。
在许多领域，如医学、生物工程和药物研发等，准确检测细胞的增殖、活化和杀伤情况至关重要。
细胞增殖是指细胞数量的增加过程，在生理和病理状态下都会发生。
了解细胞增殖速度不仅可以帮助我们了解细胞生长的规律，还可以评估某些疾病如癌症的发展程度。
因此，开发可靠且准确测量细胞增殖的方法是非常关键的。
细胞活化是指刺激后细胞内代谢水平的提高。
对于一些需要评估生物材料耐受性或测试新药剂对细胞外治疗效果时，准确测定细胞是否被有效激活至关重要。
细胞杀伤是通过某种方式使得部分或全部细胞死亡。
在免疫学、毒理学等领域中，准确检测细胞杀伤效果可以帮助我们评估药物或其他物质对细胞的影响程度。
为了解决这些问题，科学家们开发了多种方法来检测细胞的增殖、活化和杀伤情况。
本文的目的是对这些方法进行详细的解释说明，并概述它们各自的优势和局限性。
1.2 文章结构本文按照以下结构展开：首先是引言部分，介绍了文章涉及的主题和目的；接下来将分别详细介绍细胞增殖、活化和杀伤检测方法；最后对各种方法进行比较，总结研究结果并展望未来的研究方向。
1.3 目的本文的目的是提供一个全面而清晰的概述，使读者能够了解不同的细胞增殖、活化和杀伤检测方法。
通过详细讨论每种方法的原理、应用范围以及其优缺点，读者可以选择适合自己研究目标和实验条件的最佳技术。
此外，本文还将对未来的研究方向进行展望，以促进该领域更深入且有针对性的探索和发展。
2. 细胞增殖检测方法细胞增殖是指细胞通过分裂和繁殖产生新的细胞的过程。
在许多研究领域，如药物筛选、癌症治疗和组织工程等，准确评估细胞增殖能力至关重要。
本节将介绍几种常用的细胞增殖检测方法。
2.1 细胞计数法细胞计数法是最传统也是最常用的一种细胞增殖检测方法之一。
该方法通过显微镜下观察并手动计数已经增殖的细胞数量来评估细胞的增长情况。
流式细胞仪使用方案
流式细胞仪使用方案一、单细胞悬液的制备贴壁细胞↓0.25%胰蛋白酶消化2至3min↓移至玻璃离心管↓加入D-hank‘s液，轻轻吹打↓用800-1000r/min离心机离心3至5min↓『去上清，加入PBS均匀吹打，短时低速离心。
』重复三次↓加PBS充分吹打，保证细胞数每毫升1万个作用↓加95%乙醇（1：10），固定30min↓4度冰箱过夜或-20度长时保存二、染色技术1选取荧光素2样品染色步骤PBS洗细胞1-2次↓加荧光单抗，暗处孵育15-30min↓如果必需，加荧光二抗，暗处孵育15-30min↓PBS洗细胞一次↓过300目尼龙网↓上机检测3对照的设置阴性对照同型对照（见附录）三、流式细胞数据处理与分析数据的显示通常可分为一维单参数直方图（histogramplot）、二维点图（dotplot）、二维等高图（contour）和假三维图（pseudo3D）等。
下面简述最常用的单参数直方图和二维点图。
1. 单参数直方图单参数直方图是一维数据用得最多的图形，可用来进行定性分析和定量分析。
横坐标表示荧光信号或散射光信号强度的相对值，其单位用“道数”（channel）表示，横坐标可以是线性的，也可以是对数的。
纵坐标通常代表细胞出现的频率或相对细胞数。
下面以研究细胞周期为例说明如何分析单参数直方图所表达的信息。
单参数直方图经DNA特异性染料（如P1）染色的细胞群体，通过流式细胞仪测量区受激光照射后发出特异性荧光，在一定条件下，荧光强度与细胞内的DNA含量成正比，DNA含量高的细胞发射的荧光强，反之则弱。
DNA含量与细胞数目的关系，即2N（2倍体）代表GO/G1期细胞，4N（4倍体）代表G2/M期细胞，两者中间代表S期细胞。
这是典型的以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图。
通过上述信息可得到所测细胞群中增殖细胞的数量。
2. 二维点图单参数直方图只能表明一个参数与细胞数量间的关系，不能显示两个独立参数与细胞数量的关系。
流式细胞仪常用技术方法)
流式细胞仪常用技术方法细胞周期/DNA分析（PI法）一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体）三、实验步骤1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）；4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次；5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min；7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min；8.用300目滤网过滤，上机检测。
细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下1-6）三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1四、实验步骤1. 将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心；2. 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。
BD-FACSCalibur流式细胞仪操作手册
BD FACSCalibur流式细胞仪一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12 l /minMED：样品流速：35 l /minHI: 样品流速：60 l /min功能控制：•RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。
（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。
）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
•PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。
4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。
请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
•鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。
装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。
筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。
鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。
•废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。
筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。
b细胞抗原递呈的试验方法
b细胞抗原递呈的试验方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：B细胞抗原递呈在免疫学领域中扮演着非常重要的角色。
它是指B 细胞如何通过呈递抗原来激活T细胞，从而引发体内免疫应答的过程。
正确地研究和理解B细胞抗原递呈的机制，对于疾病的治疗和疫苗的研发都具有重要意义。
下面我们将介绍一种常用的B细胞抗原递呈的试验方法。
一、细胞培养进行B 细胞抗原递呈试验前需要进行细胞培养。
通常使用小鼠或人类来源的B细胞系进行试验，这些细胞系可以购买或者由实验室自行培养。
细胞培养基本步骤包括：细胞传代、培养基的准备、细胞密度的调整、培养条件的优化等。
确保细胞处于良好的生长状态是进行试验的基础。
二、制备抗原接下来是制备抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、脂类或者糖类等，用于刺激B细胞的抗原受体。
一般采用合成或从天然来源提取的方式制备抗原。
在试验过程中，需要根据所用抗原的特性确定浓度和处理方式，以确保有效刺激B细胞。
三、处理B细胞处理B细胞是进行B 细胞抗原递呈试验的关键步骤。
首先将培养的B细胞加入到含有抗原的培养基中，使其与抗原发生接触。
观察细胞对抗原的反应，包括细胞增殖、抗体分泌等。
在实验中也可以加入其他辅助因子，如细胞因子、共刺激分子等，以模拟体内免疫应答的过程。
四、检测T细胞激活最终是检测T细胞的激活情况。
通过流式细胞术或ELISA等技术检测抗原处理后的B细胞对T细胞的激活情况。
观察T细胞表面标志物的表达，分泌的细胞因子等指标，以评估B细胞抗原递呈的效果。
以上就是关于B细胞抗原递呈的试验方法的介绍。
正确地研究B细胞抗原递呈的机制，有助于我们更好地理解免疫应答的调控机制，为疾病的治疗和疫苗的研发提供重要依据。
希望这些信息能够对相关研究工作者有所帮助。
【2000字】.第二篇示例：B细胞抗原递呈是机体免疫系统中一个重要的过程，通过该过程，B细胞能够识别和吞噬外来抗原并将其呈递给T细胞，从而触发进一步的免疫反应。
在研究和临床诊断中，对B细胞抗原递呈的研究具有重要意义。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V检测细胞凋亡Annexin V (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的断裂片段分析 (7)DNA实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits检测细胞增殖BrdU Flow (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3检测细胞凋亡Active (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
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第四部分流式细胞术分析血小板流式细胞术分析血小板血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。
血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。
使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。
一、流式细胞仪血小板分析应用范围1.通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。
2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷。
3. 结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。
4. 发现血小板抗体，做定性和定量分析。
二、血小板分析的临床意义1. 血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。
2. 血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。
前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。
后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍3. 贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。
检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。
全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。
与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。
常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。
4. 血小板减少性疾病：破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。
血小板相关抗体（PAIg）是反映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。
PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。
流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定104甚至103个血小板，在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。
流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。
血小板的生成与巨核细胞有关，全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样，检测分泌到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。
“5. 血小板储存与输注：用P-选择素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物，发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象。
储存5天以上，40%～60%血小板表达活化标志CD62。
虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化，但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。
活化的血小板在循环中的存活时间很短。
若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。
6. 抗血栓药物的监测：活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生。
7. 此外，全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，测定严重血小板减少患者的血小板数目。
三、流式细胞仪分析全血中血小板的优点1.全血中血小板更接近生理状态。
2. 操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变(如血小板活化试验)。
3. 同时检测血小板的多个标志物，结合FSC和SSC，评估多个参数，进行定量分析。
4. 多采用血小板特异抗体CD41或CD61画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰。
5. 检测血小板亚群灵敏度高。
6. 用血量少。
7. 无放射性污染。
四、全血样本的制备1．抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。
做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。
2．Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。
3．1%多聚甲醛固定样本。
4．上机检测五、质控标本1.阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。
在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。
2. 血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。
使用正常人未活化标本作为阴性质控。
3. 血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。
使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。
4. 血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。
使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照。
六、数据分析－设门：1.FSC-SSC点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或杂质完全分开2. 从CD41或CD61-SSC点图中画出血小板门，由于特异性高，可以有效地去除碎片和杂质的干扰。
流式细胞仪分析血小板的活化血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。
使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。
在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。
一、使用流式分析方法检测血小板活化的优点是：1.检测血小板的反应性。
2.了解血小板活化进程。
血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗释放到血小板外。
3. 同时检测多种血小板表面标志。
4. 高度灵敏。
5. 直接检测血小板的多种标志。
6. 使用全血，标本量少。
7. 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。
二、全血中活化血小板的检测1. 血小板特异性膜糖蛋白：血小板膜糖蛋白已被深入研究，下表显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。
在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的几种，根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板。
表1血小板膜上主要的糖蛋白及其功能注：vWF血管性假血友病因子；Fb纤维蛋白原；Fn纤维粘连蛋白；Vn体外粘连蛋；LRG富含亮氨酸家族2. 活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物,这些标志物可分为三类：第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。
血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。
第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。
如GP Ⅱb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。
因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。
另外，GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高；GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。
第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。
这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。
3. 除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。
如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能等。
4. 单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61（特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。
CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物），CD62，CD63 ，CD107a-b等，。
活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。
表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。
表2活化血小板CD单抗简介三、操作步骤1. 标本采集：(1) 枸橼酸钠抗凝的真空采血管顺序编号。
(2) 抽取静脉血，采血管中注入2ml。
(3) 于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。
2. 血小板激活：(1) 试管内加入50mlADP（也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP），450μl全血，轻轻摇匀。
(2) 室温孵育5分钟。
(3) 立即染色。
3. 荧光抗体染色：(1) Falcon管编号。
(2) 在对照管中加入同型对照、CD61、PAC－1和RGDS（PAC－1的阻断剂）。
(3) 在试验管中加入CD62P、CD61和PAC－1。
(4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5μl。
(5) 轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。
(6) 各管中加入1ml冷的固定液(2-8︒C)，充分混匀，2-8︒C阴暗处放置30分钟。
(7) 24小时内上机分析。
4. 结果分析：在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。
CD61 vs SSC 点图显示有三群，CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成，CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成，CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的碎片组成。
由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用FSC-SSC图设门。
在CD61 vs SSC点图中找出CD61 阳性的血小板群(单个血小板和黏附在WBC上的血小板)，设门。
四、注意事项1. 采血时请用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用。
2. 尽量避免标本受到物理振动。
3. 取血后10分钟内完成染色操作。
4. 在Falcon管中加血标本5 l，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。
5. 为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。