超高分辨率共聚焦显微镜

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简述激光共聚焦显微镜的工作原理

简述激光共聚焦显微镜的工作原理激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜，它具有优异的成像能力和深度探测能力。

它的工作原理基于激光光源和共聚焦技术，可以对样品进行非破坏性的三维成像和表面拓扑分析。

本文将简要介绍激光共聚焦显微镜的工作原理。

1. 激光光源激光共聚焦显微镜使用一束强度稳定、单色、相干性好的激光光源。

常用的激光光源包括氩离子激光器、氦氖激光器和二极管激光器等。

激光光源通过准直器和聚焦镜系统聚焦成一束准直的、直径极小的激光光斑。

2. 共聚焦技术激光共聚焦显微镜采用共聚焦技术，即通过聚焦光斑和探测光斑的重叠来实现高分辨率成像。

聚焦光斑从样品的一个点与探测光斑重叠之后，仅有从这个点散射回来的光能够通过探测光斑，其他来自样品其他区域的光则被阻隔掉。

这样可以消除样品其他区域的散射光对图像质量的影响。

3. 共焦平面激光共聚焦显微镜通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度的共焦平面。

共焦平面是指光路中聚焦光斑和探测光斑达到最小的位置。

在共焦平面之上和之下，成像出的图像将会出现模糊和散焦现象。

调节聚焦镜的位置，可以实现在样品不同深度层面进行三维成像。

4. 探测和成像聚焦光斑扫描样品上的一个区域，样品上的荧光探针或反射光信号通过物镜收集到探测器上。

激光共聚焦显微镜常用荧光探针来标记样品的特定结构或分子，使其发出荧光信号，进而获得一幅高对比度的荧光图像。

探测器接收到的信号经过放大、滤波和转换等处理后，最终形成图像。

5. 高分辨率成像激光共聚焦显微镜具有高分辨率的成像能力。

其分辨率可以达到光学显微镜的两倍，约为200纳米级别。

激光光源的单色性和相干性，以及共聚焦技术的应用，使得激光共聚焦显微镜能够获得更清晰、更准确的显微图像。

总结起来，激光共聚焦显微镜利用激光光源以及共聚焦技术，能够实现高分辨率的三维显微成像。

通过调节聚焦镜的位置，可以获得不同深度层面的图像，更好地观察样品的内部结构。

蔡司共聚焦显微镜安全操作及保养规程

蔡司共聚焦显微镜安全操作及保养规程前言蔡司共聚焦显微镜是一种高分辨率成像设备，广泛应用于生命科学、物质科学等领域。

为保障设备安全、延长设备使用寿命，特制定本文档，介绍该设备的安全操作及保养规程。

安全操作规程1.在操作前，应查询设备的使用说明书，并全面了解设备的性能及操作方法。

2.在使用前，应先检查设备是否正常，确保仪器各部件安装牢固、电线不松动，各部件动作正常。

3.严禁将化学试剂或其他腐蚀性物质放入显微镜中，以免损坏设备。

4.操作中应遵循“先关灯后关机，先开机后开灯”的原则，确保设备正常开启或关闭。

5.切勿使用过大或过小的力量操作显微镜，以免影响设备寿命。

6.当设备因异常情况需要紧急停机时，应使用急停开关，切勿使用电源开关，避免损坏设备。

7.在设备开启状态下，切勿随意更换设备配件或涉及设备内部维修，如有异常情况应立即向厂商或专业技术人员求助。

保养规程1.在设备正常使用期间，应加强对设备的保养和维护，保持设备的清洁和干燥。

2.设备需要接通电源时，在保证电压稳定的情况下，应使用稳定的电源并加装过电压保护装置，避免对设备产生损害。

3.在操作前，应对设备进行彻底清洁，清洁过程中不得直接将水或清洁剂倒在设备上或对设备产生损害的部位。

4.在清洗设备时，应用干燥软布或软毛刷进行擦拭，切勿使用含有酸碱成分的清洁剂或物品，以免对设备产生腐蚀或损害设备表面。

5.在清洗设备表面时，不得将清洁剂或水进入仪器内部，以免对设备产生损害。

6.镜头是设备中最为重要的部分，应特别注意保养，如镜头脱落、变形、磨损或压伤等情况，应及时向专业技术人员进行维修和更换。

7.设备长时间不用时，应及时切断电源并将设备置于安全干燥的地方，保护好设备的各部件，避免设备长时间不用而导致的性能损害。

结语蔡司共聚焦显微镜是一种高精度设备，安装、操作及保养过程中需要严格遵守规程，避免对设备产生不必要的损害。

在设备的日常使用和保养过程中，我们应该掌握正确的操作和保养方法，保证设备在长期使用中保持良好的性能状态。

激光扫描共聚焦显微镜

都是DNA特异性的荧光染料，细胞毒性小，特异性强，专一性地与DNA 相结合，与DNA结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后，通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象，否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测核酸常用：细胞核定位及形态学观察染色体观察等前提：需将核酸用荧光探针标记常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对比度降低，这被称为侧向（XY）干扰

激光共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜原理激光共聚焦扫描显微技术（Confocal laser scanning microscopy）是一种高分辨率的显微成像技术。

普通的荧光光学显微镜在对较厚的标本（例如细胞）进行观察时，来自观察点邻近区域的荧光会对结构的分辨率形成较大的干扰。

共聚焦显微技术的关键点在于，每次只对空间上的一个点（焦点）进行成像，再通过计算机控制的一点一点的扫描形成标本的二维或者三维图象。

在此过程中，来自焦点以外的光信号不会对图像形成干扰，从而大大提高了显微图象的清晰度和细节分辨能力。

图1. 共聚焦显微镜简化原理图图1是一般共聚焦显微镜的工作原理示意图。

用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(light source pinhole)被二向色镜(Dichroic mirror)反射，通过显微物镜(Objective lens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focal point)处。

激光照射所产生的荧光(fluorescence light)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。

其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detection pinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。

而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。

图2. 探测针孔的作用示意图图2解释了出射小孔所起到的作用：只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。

因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。

在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focal point)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。

显微共聚焦拉曼光谱仪工作原理

显微共聚焦拉曼光谱仪工作原理
显微共聚焦拉曼光谱仪是一种高分辨率的显微镜，结合了共聚焦显微镜和拉曼光谱学的优势，可以实现高分辨率、高灵敏度的化学成分分析和三维成像。

其工作原理如下：
显微共聚焦拉曼光谱仪采用激光作为光源，经过一个可调焦透镜聚焦到样品表面。

样品吸收部分光子能量，其余光子被散射。

散射光通过物镜进入光谱仪，经过分光镜分为不同波长的光线。

其中一部分光线进入拉曼光谱仪，通过波谱仪分析样品的拉曼光谱，得到样品的化学成分信息。

另一部分光线则进入共聚焦显微镜，经过准直器和反射镜聚焦到样品表面，形成高分辨率的光学图像。

显微镜采用扫描镜片技术，通过扫描样品表面，获取样品的三维成像和化学成分分布信息。

显微共聚焦拉曼光谱仪具有高分辨率、高灵敏度、非接触式测量等优点，广泛应用于材料科学、生物医学等领域的研究。

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激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理

激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。

它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。

本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。

一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。

在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。

与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。

换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。

对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。

二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。

1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。

在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。

荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。

2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。

双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。

在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数

LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数LSM780双光子激光共聚焦显微镜是一种基于双光子荧光共聚焦显微镜技术的高性能显微镜，具有高分辨率、深入组织的成像能力，能够提供关于三维结构和功能的细胞和组织的详细信息。

下面将详细介绍LSM780双光子激光共聚焦显微镜的技术参数。

1. 激光系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常配备两个紫外激光器，能够提供两个不同波长的激光，通常为800nm和1040nm。

这些激光器可以分别或同时使用，以适应不同的样品和实验需求。

2.激光功率：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的激光功率通常在几十至上百毫瓦之间。

激光功率的选择取决于样品的特性和实验需求，功率越高，进一步成像的深度越大，但也会增加样品的破坏风险。

3.探测系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的探测系统包括一个探测单元、一个光学滤光片轮和一个光电倍增管（PMT）。

探测单元通常包含两个探测器，可用于收集荧光信号和二次非线性光学信号，以获得不同的成像信息。

4.透射探测：LSM780双光子激光共聚焦显微镜还可配备透射探测系统，用于监测透过样品的激光强度，以实现更精确的深度控制和真实的三维成像。

5.XY扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的扫描系统通过使用高速扫描镜和电子扫描控制器来实现XY扫描，以获取二维图像。

扫描速度和分辨率可以通过调整激光功率和扫描模式进行优化。

6.Z轴扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的Z轴扫描系统通常由一个压电陶瓷驱动器和一个扫描镜组成，可以实现在样品的Z轴方向上进行成像，从而获得三维图像。

7. 图像处理软件：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常使用配套的图像处理软件，如Zeiss ZEN软件，用于图像采集、分析和处理。

该软件提供了多种功能，包括多通道成像、3D成像和图像重建等。

总之，LSM780双光子激光共聚焦显微镜具有先进的激光系统、灵活的样品探测系统、高速和高精度的扫描系统以及强大的图像处理软件等技术参数，为研究者提供了一种高分辨率、高亮度和无损伤成像的显微技术工具。

共聚焦显微镜操作步骤

共聚焦显微镜操作步骤共聚焦显微镜操作步骤:共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，用于观察细胞、组织和其他微观结构。

以下是共聚焦显微镜的操作步骤：1. 打开显微镜：首先，确保显微镜连接到电源，并打开电源开关。

然后，打开电镜控制软件并启动仪器。

2. 准备样品：将待观察的样品放置在显微镜的载物台上。

确保样品已经固定并适当准备好观察。

3. 调整激光：选择适当的激光波长，并通过调整激光源的控制器来获得所需的激光功率。

4. 调整物镜：选择适当的物镜，并使用显微镜的转盘来安装它。

然后使用显微镜调焦手轮将样品移动到所需的焦平面。

5. 调整探测器：根据需要，选择适当的探测器和滤光片，并将其安装在探测器路径上。

确保探测器的位置和角度正确。

6. 设置扫描参数：根据需要，调整扫描参数，例如扫描速度、像素大小和图像采集模式。

这些参数将影响图像质量和获取速度。

7. 开始扫描：通过点击软件界面上的“开始扫描”按钮，启动共聚焦显微镜的扫描过程。

仪器将开始进行扫描并采集图像。

8. 观察图像：在扫描过程中，您可以实时观察到正在生成的图像。

通过调整放大倍率、对比度和亮度等参数，优化图像质量。

9. 数据保存和分析：在完成扫描后，您可以选择将图像保存到计算机上的特定文件夹中。

然后，您可以使用图像处理软件进行进一步的分析和处理。

10. 关闭显微镜：在完成观察和保存图像后，关闭共聚焦显微镜。

首先，停止扫描过程，然后关闭电镜控制软件和电源开关。

以上是共聚焦显微镜的一般操作步骤。

请注意，在使用共聚焦显微镜之前，您应该熟悉特定仪器的操作手册，并按照制造商的指示进行操作。

共聚焦成像显微镜安全操作及保养规程

共聚焦成像显微镜安全操作及保养规程共聚焦显微镜是一种先进的成像设备，广泛应用于生命科学、物理科学等多个领域，它能够提供高分辨率、深度和对样本的空间结构进行三维描述等特点，但同时也存在一定的风险。

本文旨在向相关工作人员提供共聚焦显微镜的安全操作及保养规程，以保证人员安全和设备正常运行。

安全操作规程1. 佩戴个人防护装备在使用共聚焦显微镜时，必须佩戴好个人防护装备，包括安全眼镜、手套、长袖上衣等，以预防暴露在激光光束下时对眼睛和皮肤的伤害。

2. 正确开启设备在正式使用设备前，必须确认整个设备是否处于正常的状态。

应该先开启共聚焦显微镜，验证各个系统是否工作正常，包括激光器、探测器和其他系统等，检查完毕后再进行后续的操作。

3. 熟练掌握操作方法在进行具体的实验操作前，需要对设备的部件及相关装置进行仔细学习，全面掌握该设备的使用方法及相应的安全措施。

各种操作的位置和流程都需熟记于心。

4. 控制激光手柄在使用共聚焦显微镜时，必须节制使用激光手柄，尤其是在进行样品扫描和调焦过程中，必须控制激光手柄的强度，调整到安全低于I m ax的最小值；当不再需要激光时，应立即关闭激光器。

5. 防止交叉感染共聚焦显微镜通常应用于生物实验，因此必须防止交叉感染。

慎选样品、消毒液及其他相关材料，严禁在同一个场所同时进行不同的生物实验。

设备保养规程1. 清洁电视显微镜在使用电视显微镜时，需要擦拭透镜，去除灰尘或样本残留物，否则将影响整个系统的成像效果。

当透镜变脏时，可以使用棉球或者干的无菌纱布进行轻轻擦拭，切勿使用水和洗涤剂清洗。

2. 定期维护激光器共聚焦显微镜的激光器需要定期进行维护，以确保激光器的正常工作。

具体的维护包括：•检查整个设备是否有异响或异常的情况。

•清除激光器的滤镜，以确保光线从整个激光器系统中传输有效的光输出。

•应定期更换一定损耗的透射镜片等磨损部件。

3. 清洁镜头在使用共聚焦显微镜时，必须保证样品及相应的镜头是干净的，否则将影响成像效果。

激光共聚焦显微镜设备安全操作规定

激光共聚焦显微镜设备安全操作规定1. 前言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，广泛应用于细胞学、分子生物学、神经学等多个领域。

然而，LSCM的使用需要注意潜在的危险性，如激光辐射、样品污染、化学品污染等。

故本文为LSCM设备使用者和管理员提供操作规定，以确保安全操作和科学研究的顺利进行。

2. 设备安全2.1 设备安装及操作环境•设备应该放置在稳固、干燥、通风良好的环境下。

•应该远离有潮湿气氛或者有化学气味的区域。

•设备旁应设有紫外线消毒机、紫外线灯等，以保持操作环境的干净和卫生。

•设备应该保持水平安放，禁止晃动或者触碰任何部件以免损坏设备。

2.2 操作者安全•操作者必须在获得专业培训，并按照培训规定进行操作。

•只有经过正常的操作许可才能使用设备。

•操作者必须穿戴防护眼镜防护手套等个人防护用品。

•操作结束后必须彻底清洗试样台、针头等设备，保持设备清洁卫生。

•操作者首先需要关闭LSCM的激光打开电源，并在打开电源后等待一段时间后进行试验操作。

3. 设备使用3.1 LSCM设备的开机•操作人员需要启动激光开关,并确认放置的样品适配平台已经连接。

3.2 打开样品盖•在打开样品盖前应当确认激光是否关闭•在打开样品盖后，确保样品表面形状平整且没有杂物，再打开激光并启动相关的测试等设备3.3 操作针头•操作针头属于平衡针，请注意不要在操作时碰到LSCM的其他配件上。

•操作针头时需遵循操作规范，确保对试样及设备的损害减少至最少。

3.4 关闭设备•在使用完毕，应关闭激光及设备电源，并将样本保存好。

4. 设备维护及紧急处理4.1 设备维护•设备每日应该进行消毒处理，避免因样品等物质的污染对其他样品的影响。

•正确清洗试样台，尤其当使用化学试剂时尤应留意，以避免产生不必要的污染。

•设备需要经常进行调整以保证仪器量測的准确性。

4.2 常规维护及故障处理•操作人员需要定期清洗和检查设备，确保设备正常使用。

共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈

第39卷第1期2020年2月电㊀子㊀显㊀微㊀学㊀报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.39,No.12020-02文章编号:1000-6281(2020)01-0090-10㊀㊀共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈关苑君1,2,容㊀婵1,梁翠莎1,李㊀娟1,蓝秀健1,2∗,吴珏珩1,2(1.中山大学中山医学院科研仪器管理中心,广东广州510080;2.中山大学热带病防治研究教育部重点实验室,广东广州510080)摘㊀要㊀㊀共定位分析是研究蛋白或分子相互作用的有效工具㊂荧光显微图像的共定位分析包括定性分析和定量分析两部分㊂严格而言,共定位分析是使用共定位系数去描述两个或以上的分子间变量关系㊂目前,许多研究工作者对荧光显微图像的共定位分析需求大㊂然而,对需要做共定位分析的样品要求㊁采图要求和分析方法等普遍存在疑问㊂在本文中,笔者结合多年成像类设备共享服务的经验,基于激光共聚焦和超分辨率荧光显微图像,详细阐述共定位定性和定量分析的方法,以供其他科研工作者参考和借鉴㊂关键词㊀㊀显微图像;共定位;光学显微镜;共聚焦显微镜(confocal );超分辨率显微镜(SIM /STORM )中图分类号:TH74;Q336㊀㊀文献标识码:A㊀㊀doi :10.3969/j.issn.1000-6281.2020.01.016收稿日期:2019-06-24;修订日期:2019-07-28基金项目:2017年度广东省本科高校高等教育教学改革项目(升级仪器共享平台,提升医科高端贵重仪器设备共享效益).作者简介:关苑君(1985-),女(汉族),广东开平人,硕士,助理实验师,技术员.E-mail:gyuanj@ ∗通讯作者:蓝秀健(1972-),女(汉族),广东罗定人,硕士,高级实验师.E-mail:lanxj@㊀㊀在细胞生物学和分子生物学等研究领域中,常用免疫荧光染色检测同一样品中的两个或多个分子的表达情况,以荧光显微图像的共定位情况对相关的生物学现象进行描述[1],如阐明蛋白功能㊁分子的胞间运输等[2]㊂共定位的现象使用宽场荧光显微镜㊁共聚焦显微镜和超分辨率荧光显微镜都可获得共定位的荧光图像,尽管很多文献都已说明如何定量分析共定位[1,3-4],但许多科研工作者仍未透彻了解共定位的概念,仍然抱持着红绿通道叠加变成黄色就是共定位的想法㊂显微图像的采集是量化共定位程度的首要工作,如何正确地使用相关设备采集图像,以及配合一些开源或付费的分析软件进行共定位定性分析和定量分析是共定位分析的核心要点㊂在本文中,将通过列举实际工作中遇到的例子,从图像采集㊁共定位定性分析㊁共定位定量分析以及超分辨率显微图像的共定位分析方法和相关的注意事项进行阐述,以帮助科研工作者更好地使用共定位这个分析工具㊂1㊀共定位的定义共定位在广义上而言,是指不同荧光标记的不同蛋白在同一空间位置分布㊂对于荧光显微图像而言有两层含义:①共现(co-occurrence 或overlap),指两种(或两种以上)不同荧光分子团在像素空间上重叠㊂②相关(correlation),指在共现基础上,荧光基团间有着显著的统计学关系,重叠部分的荧光强度变化趋势一致㊂共定位的生物学含义则是用于描述细胞中,两个或者多个不同分子位于同一生物结构上㊂图像共定位分析,可将分子间的相互作用㊁相对位置关系㊁空间距离等数据可视化㊁直观化㊂由于蛋白质参与对大多数的生物学过程,通过图像共定位分析研究蛋白互作,有助于阐明机理机制㊁发现作用靶点㊁细胞调控㊁信号通路和分子构象等㊂共定位研究,许多科研工作者会混淆或者不清楚自己的研究是需要定性研究还是定量研究㊂而无论是定性还是定量,始终有两个基础,第一是怎样采集到一张可靠的图像,包括空间信息㊁光谱信息和时间信息;第二是如何将共定位的程度量化[4]㊂依据实验的目的,决定了共定位分析是做定性分析㊁定量分析还是两者相结合㊂共定位分析在显微图像中,一般是指狭义的定义,即用皮尔森相关系数或曼德斯系数等共定位系数去描述的变量关系,例如A 蛋白增加,B 蛋白也增加,一种正相关变量关系的定量分析,更着重于变化趋势㊂如实验只需做空间分布的变化,与所标记蛋白的荧光强度不相关,则可使用定性分析,如:标记蛋白空间分布,㊀第1期关苑君等:共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈㊀㊀如:某蛋白锚定在某个亚细胞器位置上;处理后入核/其他亚细胞结构,空间分布的改变,与细胞核/亚细胞结构本身固有的量没有关系㊂无论是共定位的定性分析还是定量分析,这种基于显微图像的分析方法只是分析分子相互作用的其中一种实验手段,除此以外,其他相关的实验包括免疫共沉淀(Co-IP )㊁蛋白质体外结合实验(Pull-down)㊁荧光能量共振转移(FRET)㊁邻位连接技术检测蛋白互作用(PLA /Duolink)㊁双分子荧光互补技术(BiFC㊁NanoBiT)㊁蛋白间相互作用检测(生物分子相互作用仪(Biacore)㊁微量热等温滴定量热仪等)㊁运用蛋白标记系统检测表面蛋白结合(SNAP-tag 和CLIP-Tag)等[5-9],科研工作者需要根据实验的目的选择完成㊂2㊀共定位分析的图像获取和处理准确的共定位分析依赖于可靠的图像㊂可靠的图像取决于样品的制备㊁图像采集和处理,色差㊁强度和分辨率对共定位分析有着重要的影响㊂所以进行共定位分析的图像采集和分析前,需要注意以下事项[3-4]㊂样品处理:①两种或以上的染料间的激发和发射波长要足够分开,不能串色;②所选染料的特异性要高,背景信号要低;③所有组别样品处理步骤要一致;④使用相同的封片剂,以免造成背景信号不一致;⑤需检测样品的自发荧光;⑥准备单个荧光染料染色的样品;⑦正对照与负对照㊂图像采集:①所有组别样品采集参数一致,包含物镜;②图像亮度不能过曝,一般以强度高的组别不过曝为准;③如果使用共聚焦扫描,尽量使用顺次扫描,以防串色;④两个通道之间的强度要相当;⑤图像分辨率在采集时,建议按照尼奎斯特采样定理(Nyquist)以获得足够的图像分辨率;⑥建议拍摄Z-Stack 三维图像㊂图像处理:①保存图像的原始格式,如czi㊁lsm㊁nd2等,如果保存tiff 图像不能更改图像的灰度值;②建议反卷积处理;③所有图像处理参数一致㊂3㊀共定位的定性分析和展示3.1㊀剖面图(Profile View )以蔡司激光扫描共聚焦软件ZEN (black)为例[10],采集的二维图/多维图中具有剖面图ProfileView 的功能,用于展现图像中任意一条直线或曲线上的强度分布(图1)㊂剖面图可用于显微图像的定性分析,也可根据两个或多个通道峰型变化的同步性初步判断是否具有共定位(图1b)㊂剖面图只能展示某一光切厚度的图像中,XY 平面上的亮度变化,该层的光切厚度是由共聚焦针孔大小所决定㊂图1㊀蔡司ZEN(black)软件中的Profile View㊂Bar =10μma.蛋白A:Alexa 488;蛋白B:Alexa 594;细胞核:DAPI㊂使用直线工具在白色箭头所示位置画出直线,直线粗细可调,默认粗度是1像素,直线所经过的像素,各通道荧光强度数值以二维折线图展现在图中;b.各通道荧光强度折线图,白线箭头所示位㊀㊀置就是像素中红绿通道共同变化的峰值位置,由此可看出强度变化趋势㊂X 轴是所画线条的长度,Y 轴是荧光强度灰度值㊂Fig.1㊀Profile view in Zeiss ZEN (black edition)software.a.Protein A:tagged with Alexa Fluor 488;Protein B:tagged with Alexa Fluor 594;nucleus:tagged with e the line tool to draw a straight line at the position in the image,which is shown by the white arrow.The thickness of the line is adjustable and the default thickness is one pixel.Each channel s intensity of the passed by line is shown in the figure as a two-dimensional polyline graph.b.The polyline graph of the intensity.The peak position of the red and green channels is indicated by the white arrow,which㊀㊀㊀indicates the trend of intensity change.X axis is the length of the straight line,Y axis is the grey value of the fluorescent intensity.19㊀㊀电子显微学报㊀J.Chin.Electr.Microsc.Soc.第39卷㊀㊀剖面图的功能除了可获得线条上的荧光强度值外,还可以看图像是否过度曝光㊂过度曝光的图像,会在最大灰度值处出现平直一段的直线,提示图像过度曝光(图2)㊂荧光强度超出成像单元所能接收的范围后,就无法体现出荧光强度的真正数值㊂荧光强度定量分析或共定位分析首要条件就是不能过曝㊂图2㊀剖面图与图像过度曝光㊂成像设备:蔡司激光扫描共聚焦显微镜(LSM780),图中箭头所示,在位深8位的图像中,最大强度灰度值255上出现一条㊀㊀平直的直线,提示该处出现过曝,未能真实体现荧光强度数值㊂Fig.2㊀Profile view and image overexposure.Imaging equipment:Zeiss LSM 780.As shown by the arrow in the figure,a straight line is drawn in an 8bits image.A straight line appears around the intensity gray value 255from the polyline graph,indicating that there is overexposure.And the㊀㊀㊀㊀㊀fluorescence intensity value cannot be truly read out.3.2㊀正交视图(Orthogonal View )正交视图Orthogonal View [10],可用于三维图像的共定位定性分析㊂二维图像的共定位有可能是假的共定位,有以下几种原因造成:①面照明和面成像的二维显微图像,在共定位研究图像采集中,建议使用共聚焦显微镜,这是由于共聚焦具有针孔,可阻挡非焦平面杂散光进入采集光路中㊂宽场荧光显微镜光路是面照明㊁面成像,所有被光源激发的光线都会被收集,可能出现假的共定位(图3a)㊂②焦平面的主观性,二维图像的焦平面手动调节,如果带有主观性选择,会导致不完整㊁不科学的共定位分析(图3b)㊂在共聚焦显微镜或超分辨率显微镜采图软件中,拍摄三维图像后,可切换至正交视图观察(图4,图5)㊂正交视图可直观显示两条垂直直线相交位置在XY ㊁XZ ㊁YZ 三个方向上的情况,如果三个方向上都体现两个荧光通道在相同像素中共现,可对共定位有个初步的判断㊂正交视图除了用于共定位的初步判断,更适合用于蛋白的定位,例如所标记蛋白与胞浆㊁胞核㊁胞膜的空间位置关系㊂Zhang 等[11]运用结构光照明超分辨率显微镜(SIM)拍摄三维图像后,使用正交视图说明经载体或奥沙利铂处理后的大鼠背根神经节组织切片中δ-连环蛋白和DHHC3蛋白的关系㊂3.3㊀表面间共定位(Surface-surfacecolocalization )运用其他图像处理软件,如Bitplane Imaris 软件中的拓展模块XTension,其中一个插件表面件共定位(Surface-surface colocalization)[12]可计算出两个通道的共定位像素或体素重叠(overlap)的区域(图6),获得相关的数据㊂此运算并不涉及相关性的计算,29㊀第1期关苑君等:共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈㊀㊀㊀㊀㊀㊀图3㊀二维共定位图像的伪共定位情况㊂a.面照明和面成像所致;b.焦平面的主观选择所致㊂Fig.3㊀Fake colocalization caused by the two-dimensional imaging.a.Fake colocalization caused by plane lighting and plane imaging mode;b.Fake colocalization caused by thesubjective choice of focal plane.即不能单一作为共定位定量描述的指标,但可以得出共定位像素或体素的占比或作为一个展示㊂4㊀共定位的定量描述与分析4.1㊀散点图共定位定量分析的基础是两个通道中,所有像素的强度分布散点图,共定位程度越高,散点图越趋向于对角线分布,Zinchuk 等[13]使用散点图来展示不同百分比的共定位情况㊂散点图中(图7),每个点的坐标代表的是该像素中通道1和通道2的荧光强度值㊂从散点图可得知:①共定位分析要求两个荧光通道在成像时强度要相当,如果一个通道强㊁一个通道弱,散点图分布偏离对角线,则相关性下降,以极限情况而言,横着一条,两者就不相关㊂②要求抗体特异性要高,背景要低,不然会导致相关性下降㊂4.2㊀共定位系数共定位系数用于描述两个通道重叠的程度㊂通常,显微图像的共定位系数是用于描述线性变化的图像㊂皮尔森相关系数(Pearson s)和曼德斯系数(Mander s)最为常用[13],在多种分析软件中共定位系数可能名字会不一样,需以公式[3-4,10,13]为准(表1)㊂从公式得知,大部分的共定位系数都与荧光强度有关,除了c1和c2,只与像素数目有关㊂多种系数综合选择或者比较,可更好地阐述共定位的情况㊂除上述常用的共定位系数以外,还有Spearman s㊁Intersection㊁Li s ICQ㊁Van Steensel s CCF 等系数可用于描述非线性共定位的程度㊂4.3㊀共定位分析的影响因素无论是共定位的定性分析和定量分析,影响因素可以分为硬件方面和制样方面(表2)㊂在这些因素中,对图像进行反卷积处理很重要㊂通过反卷积对整个光学系统因衍射等所产生的系统误差进行纠正,找到图像当中真正的物象[14],这对于共定位分析极为重要(图8)㊂5㊀共定位与超分辨率显微图像5.1㊀结构光照明(SIM )显微图像结构光照明(SIM)显微镜是通过对其照明方式的改进,以特定结构光成像,从而突破衍射极限,获得高频样品信息,进而由傅里叶逆变换获得样品显微图像的一种光学显微镜㊂宽场荧光显微镜的成像过程可以用公式(1)表示:D r ң()=E (r ң)⊗PSF,(1)E r ң()ɖC r ң()I r ң(),(2)㊀㊀D r ң()是像面上的光场强度分布,表征显微镜系统获得的样品图像,E (r ң)表示样品面发射光的光场强度,PSF 是显微镜系统的点扩散函数,⊗表示卷积运算,这是一个线性平移不变系统㊂而对于荧光显微镜,发射光光场强度E r ң()和照明光场强度分布I r ң()成线性关系,对于采用匀场照明的宽场荧光显微镜I r ң()是常量,而C r ң()为荧光分子浓度,表征的是样品的结构信息,所以从公式得知E (r ң)可以用来表征样品结构信息,与D r ң()呈线性关系㊂公式(1)经过傅里叶变换获得公式(3),D k ң()表示显微镜系统获得的样品图像的频域信息,OTF 是显微镜系统的光学传递系数,E k ң()表示样品面出射光场的频域信息,OTF 的大小直接限定了通过显微镜系统的样品信息量㊂二维结构光照明荧光显微镜突破衍射极限限制不在于改变OTF,而在于改变照明光的样式,所以I r ң()并不为常量,39㊀㊀电子显微学报㊀J.Chin.Electr.Microsc.Soc.第39卷㊀㊀㊀图4㊀ZEN 软件中Z-Stack 三维图像正交视图㊂成像设备:蔡司激光扫描共聚焦显微镜(LSM 880with Airyscan)㊂Fig.4㊀Orthogonal view of 3D Z-Stack image in Zeiss ZEN (black edition)software.Imaging equipment:Zeiss LSM 880with Airyscan.图6㊀Imaris XTension 中的表面间共定位重叠的体素区域㊂Bar =10μma.488nm 和561nm 通道图像,白色区域为两个通道的功能定位重叠区域;b.重叠区域的表面渲染图㊂Fig.6㊀The overlap voxel area after surface-surface colocalization calculation in Imaris XTension.a.The merged image of the channel 488nm,561nm and the overlap surface of the two channels;b.The surface image of the overlapvoxels.图5㊀结构光照明超分辨率显微镜(SIM)三维图像㊂正交视图㊂成像设备:尼康超分辨率显微镜A1N-SIM㊂Bar =10μm Fig.5㊀Orthogonal view of structured light illumination super resolution microscope 3D Z-Stack image.Imaging equipment:㊀㊀Nikon super resolution microscope(A1N-SIM).而是由条纹照明平均强度I 0和初相位φ两个变量决定的一个余弦形式照明光(公式(4))㊂k 0是余弦条纹照明的空间频率,即条纹周期的倒数[15]㊂D k ң()=E k ң()OTF ,(3)I r ң()=I 01+cos 2πk 0+φ()[]㊂(4)㊀㊀由此可知,采用傅里叶逆变换所获得的SIM 图像,其样品信息E k ң()与像面信息D k ң()不呈线性关系,不能用于表征样品的强度信息㊂所以,经过傅里叶逆变换的图像并不能用于强度计量㊂线性结构光照明显微镜分辨率的提高取决于结构照明光空间频率k 0的大小,结构照明光也是通过光学系统照射到样品表面,它同样受到衍射极限的限制,分辨率无法突破2倍衍射极限[16]㊂SIM 图像由于在重构运算时是将高频信息分离㊁移位㊁重49㊀第1期关苑君等:共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈㊀㊀㊀㊀㊀表1㊀部分共定位系数简介与公式Table 1㊀Partial colocalization coefficients and formula系数名称数值范围ZEN 软件中的名称备注与建议公式Pearson scorrelation coefficient-1~+1㊂0表示没有相关性㊂越接近-1,负相关性越高㊂越接近+1,正相关性越高㊂平方值的百分比,如:0.82=0.64,可表示64%有共定位㊂Correlation coefficient线性图像;对背景值敏感;与强度相关,建议反卷积处理㊂R p =i(Ch 1i-Ch 1aver )∗(Ch 2i -Ch 2aver )i(Ch 1i-Ch 1aver )2∗ i(Ch 2i -Ch 2aver )2Overlap coefficient according to Manders0~1㊂0.5表示两个所选通道间50%的共定位㊂Overlap coefficient,Overlap coefficient after Manders任何共定位实验都可应用,特别适用于一个通道强度大于另一个通道㊂r =iCh 1i ∗Ch 2ii(Ch 1i )2∗ i(Ch 2i )2Colocalization Coefficients m1and m20~1㊂如m1=1.0,m2=0.2这样的红-绿对,表示所有红色通道都与绿色通道重叠,但只有20%的绿色通道与红色通道重叠㊂与通道的强度相关㊂Weighted colocalization coefficients任何共定位实验都可应用,每个通道中与另一个通道中的某一强度重合的部分㊂亮的像素比弱的像素贡献要大㊂由于对强度阈值敏感,建议反卷积处理㊂M 1=iCh 1i ,coloc i Ch 1i ,total㊀M 2=iCh 2i ,coloc i Ch 2i ,totalColocalization coefficients M1and M20~1㊂等同于m1和m2,但用于分析散点图ROI㊂同上同上同上Overlap coefficient k1and k2范围是变化的㊂无任何共定位实验都可应用㊂对强度阈值敏感,建议反卷积㊂k 1=iS 1i ㊃S 2i i (S 1i )2㊀k 2=iS 1i ㊃S 2i i (S 2i )2Colocalization coefficient0~1㊂表示两通道之间共定位的像素比值,与通道的强度值无关,与图像背景相关㊂Colocalization coefficient任何共定位实验都可以应用㊂c 1=pixels Ch 1,coloc pixels Ch 1,total㊀c 2=pixels Ch 2,coloc pixels Ch 2,total表2㊀部分共定位分析的影响因素Table 2㊀Impact factors of the colocalization analysis影响因素制样或硬件因素㊀㊀解决方案点扩散函数(PSF)㊀㊀硬件反卷积处理㊂色差㊀㊀硬件平场复消色差物镜㊂串色㊀㊀制样㊁硬件更换染料,通道间激发/发射波长间隔更远;荧光滤片选择更短或区分度更合适的以区分信号㊂背景㊀㊀制样选择特异性更好的抗体㊁反卷积处理㊂通道间的荧光差异太大㊀㊀制样提高抗体浓度,如果是表达量存在差异,考虑选用与强度不相关的共定位系数进行分析㊂构,所以不能用于强度计算,无法进行共定位的定量分析,但仍然可以使用像素占比㊁剖面图㊁正交视图(图5)㊁距离等[11,17]定性工具对共定位进行描述㊂结构光照明超分辨率显微镜在突破衍射极限的基础上,具备较快的成像速度,对标记样品的荧光染料没有特殊要求,所以在生物样品的结构特性静态观察或部分样品的动态特性上有着广泛地应用前景㊂5.2㊀随机光学重建(STORM )显微图像随机光学重建显微镜(STORM)成像是报告荧59㊀㊀电子显微学报㊀J.Chin.Electr.Microsc.Soc.第39卷图7㊀散点图㊂横轴:通道1的荧光强度灰度值;纵轴:通道2的荧光强度灰度值㊂Fig.7㊀Scatter diagram.X axis:intensity grey value of channel1;Y axis:intensity grey value of channel2.光染料分子随机㊁多次闪烁,信号收集的是荧光基团的定位点信息,每个蛋白或结构中的抗体染料数量是不确定的㊂STORM是通过定位点来计算最终的图像,以高斯拟合的方式去展现,所以STORM的图像不能直接用于荧光强度测定,定量的共定位系数并不能在此应用㊂Malkusc等[18]通过两个染料周围定位的空间分布,修正了单个荧光分子的多次开关周期,结合Spearman系数,以距离排序的方式给出定义范围内距离共定位基团Ai的B分子数目㊂通过距离计算单个荧光分子的共定位情况(图9),Ma等[19]将STORM获得的两通道信号图像,在Bitplane Imaris软件中依据点状信号的大小转化为球(Spot),其中TRIM28蛋白因有聚团的部分,所以分成2种不同大小直径的小球(绿色)㊂建立小球后,使用Imaris XTension中的Colocalize Spots以球心自定义的球心距离得出共定位小球的数目,例如:红色小球和绿色小球以球心距离ɤ10nm则定义为共定位,红色小球以绿色大球以球心距离ɤ100 nm定义为共定位,从而得出相关的数据㊂Veeraraghavan等[20]运用Matlab软件中的算法识别STORM的定位点信息后,依据DBSCAN算法对定位点信息进行分簇(Cluster),并以quickhull算法将成簇的信号点以凸多边形形式进行包裹,并以凸多边形表面的重叠(Overlap)和距离边界间最短距离来描述分子Cx-43和Na V1.5之间的关系㊂此外,STORM结合Z-STACK三维成像,也许能更好地阐述分子间的相互作用㊂Xu等[21]通过采集双通道的3D-STORM图像,以剖面图Profile View的方式观察细胞核内组蛋白H3K4me3和H3K9ac的共定位情况㊂综上所述,超分辨率显微图像,无论是SIM还是STORM,目前并不能用与强度相关的共定位系数来描述共定位关系,但可以点间距离㊁所占据的像素比例等其他参数描述共定位情况㊂在图像反卷积处理上,SIM图像可以考虑反卷积处理以获得更好的分辨率㊂6　总结㊀㊀基于免疫荧光显微图像的共定位分析,在研究蛋白或分子相互作用的过程中是重要的工具㊂本文从激光共聚焦显微镜和超分辨率显微镜(SIM/ STORM)采集的显微图像出发,总结分享了共定位定性㊁定量的分析在样品制备㊁采图要求㊁图像处理等方面的核心要点和注意事项,以期引导有相关需求的科研工作者更高效地使用各类共定位分析工具㊂69㊀第1期关苑君等:共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈㊀㊀图8㊀反卷积处理前后对比图㊂Bar =10μmFig.8㊀The comparison image before and afterdeconvolution.图9㊀STORM 图像渲染小球后计算共定位小球数目㊂Bar =0.5μmA.STORM 选点分析后的图像;B.依据信号点不同大小渲染的小球图,分为绿色大球(直径0.2μm)㊁绿色小球(直径0.046μm)和红色小球(直径0.05μm);C.距离定义为0.05μm 共定位的绿色小球和红色小球示意图;D.距离定义为0.1μm 共定㊀㊀位的绿色大球和红色小球示意图㊂79㊀㊀电子显微学报㊀J.Chin.Electr.Microsc.Soc.第39卷Fig.9㊀Colocalized spots number of the analyzed STORM image.A.The image after the STORM analysis;B.According to different diameter,the image signal has been transferred into spots,including the big green spots(diameter:0.2μm),the small green spots(diameter:0.04μm)and the red spots(diameter:0.05μm);C.The colocalized spots between the small green spots and red spots,defining the distance as0.05μm;D.The colocalized spots between the ㊀㊀big green spots and red spots,defining the distance as0.1μm.参考文献:[1]㊀ZINCHUK V,ZINCHUK O,OKADA T.Quantitativecolocalization analysis of multicolor confocalimmunofluorescence㊀microscopy images:pushingpixels to explore biological phenomena[J].ActaHistochem Cytochem,2007,40(4):101-111. [2]㊀DUNN K,KAMOCKA M,MCDONALD J.A practicalguide to evaluating colocalization in biologicalmicroscopy[J].Am J Physiol Cell Physiol,2011,300(4):C723-C742.[3]㊀BOLTE S,CORDELIÈRES F.A guided tour intosubcellular colocalization analysis in light microscopy[J].J Microsc,2006224(3):213-232. [4]㊀OHEIM M,LI D.Quantitative colocalisation imaging:concepts,measurements,and pitfalls[M].In:Imagingcellular and molecular biological functions.SHORTE SL,FRISCHKNECHT F,eds.Berlin:Springer,2007.[5]㊀SONG J,LIU Y,GAO P,et al.Mapping thenonstructural protein interaction network of porcinereproductive and respiratory syndrome virus[J].JVirol,2018,92(24):e01112-01118.[6]㊀ZHOU R,SHAO Z,LIU J,et al.COPS5and LASP1synergistically interact to downregulate14-3-3σexpression and promote colorectal cancer progression viaactivating PI3K/AKT pathway[J].Int J Cancer,2018,142(9):1853-1864.[7]㊀ARTEAGA-TLECUITL R,SANCHEZ-SANDOVAL A,RAMIREZ-CORDERO B,et al.Increase of CaV3channel activity induced by HVAβ1b-subunit is notmediated by a physical interaction[J].BMC Res Notes,2018,11(1):810.[8]㊀HERBERT L,NITTA C,YELLOWHAIR T,et al.PICK1/calcineurin suppress ASIC1-mediated Ca2+entryin rat pulmonary arterial smooth muscle cells[J].Am JPhysiol Cell Physiol,2016,310(5):C390-400. [9]㊀SINGH A,YADAV A,KAUR K,et al.A proteinphosphatase2C,AP2C1,interacts with and negativelyregulates the function of CIPK9under potassium-deficient conditions in Arabidopsis[J].J Exp Bot,2018,69(16):4003-4015.[10]㊀LSM710,LSM780,LSM710NLO,LSM780NLOand ConfoCor3ZEN2011(black edition)OperatingManual[EB/OL].P397.(2011年9月)[2019年6月].[11]㊀ZHANG X,DING H,XU T,et al.Palmitoylation ofdelta-catenin promotes kinesin-mediated membranetrafficking of Na(v)1.6in sensory neurons to promoteneuropathic pain[J].Front Pharmacol,2019,9:1510.[12]㊀/tabid/235/Default.aspx?id=111(surface-surface colocalization) [13]㊀ZINCHUK V,WU Y,GROSSENBACHER-ZINCHUKO.Bridging the gap between qualitative and quantitativecolocalization results in fluorescence microscopy studies[J].Sci Rep,2013,3:1365.[14]㊀SEDARAT F,LIN E,MOORE E,et al.Deconvolutionof confocal images of dihydropyridine and ryanodinereceptors in developing cardiomyocytes[J].J ApplPhysiol,2004,97(3):1098-1103.[15]㊀吴美瑞.结构光照明荧光显微成像系统研究[D].长春:中国科学院研究生院(长春光学精密机械与物理研究所),2014.[16]㊀吴美瑞,杨西斌,熊大曦,等.结构光照明荧光显微镜突破衍射极限的原理和在生命科学中的应用[J].激光与光电子学进展,2015,52(1):23-33. [17]㊀PASTOREK L,SOBOL M,HOZÁK P.Colocalizationcoefficients evaluating the distribution of moleculartargets in microscopy methods based on pointed patterns[J].Histochem Cell Biol,2016,146(4):391-406.[18]㊀MALKUSCH S,ENDESFELDER U,MONDRY J,et al.Coordinate-based colocalization analysis of single-molecule localization microscopy data[J].HistochemCell Biol,2012,137(1):1-10.[19]㊀MA X,YANG T,LUO Y,et al.TRIM28promotesHIV-1latency by SUMO ylating CDK9and inhibiting P-TEFb[J].Elife,2019,8:e42426.[20]㊀VEERARAGHAVAN R,GOURDIE R.Stochasticoptical reconstruction microscopy-based relativelocalization analysis(STORM-RLA)for quantitativenanoscale assessment of spatial protein organization[J].Mol Biol Cell,2016,27(22):3583-3590. [21]㊀XU J,MA H,JIN J,et al.Super-resolution imaging ofhigher-order chromatin structures at different epigenomicstates in single mammalian cells[J].Cell Rep,2018,24(4):873-882.89㊀第1期关苑君等:共聚焦和超分辨率显微荧光图像的共定位分析浅谈㊀㊀㊀㊀∗㊀Corresponding authorColocalization analysis of confocal and super resolutionmicroscopy fluorescence imagesGUAN Yuan-jun 1,2,RONG Chan 1,LIANG Cui-sha 1,LI Juan 1,LAN Xiu-jian 1,2∗,WU Jue-heng 1,2(1.Core Lab Plat for Medical Science,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-Sen University,Guangzhou Guangdong 510080;2.Key Laboratory of Tropical Disease Control (Sun Yat-Sen University),Ministry of Education,Guangzhou Guangdong 510080,China)Abstract ㊀㊀Colocalization analysis is an effective tool for analyzing interaction between proteins or molecules.Based on the fluorescent microscopy images,colocalization analysis include the qualitative and the quantitative parts.Utilizing the colocalization coefficients to describe the relation between two or more molecules is the strictest analysis.However,many researchers have not fully mastered the sample preparations and have questions about capturing requirements and image processing methods for colocalization analysis.Here,we summarized the colocalization methods,both qualitative and quantitative for confocal and super-resolution microscopy images,which might help researchers make better use of the tool.Keywords ㊀㊀microscopy imaging;colocalization;optical microscope;confocal microscope;super-resolution microscope (SIM /STORM)99。

激光共聚焦显微镜原理和应用

激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜，又称双代理镜，是一种精密的衍射成像仪器，在
显微镜中用于研究各种微小样品的形态、结构和化学特性。

激光共聚焦显
微镜是一种高灵敏的、具有很高的分辨率的光学显微成像系统，在生物、
材料和分析科学等领域有着广泛的应用。

激光共聚焦显微镜的基本原理是利用一种双代理镜，其中一个代理镜
将外入的量子光束分成两部分，一部分照射到样品上，另一部分反射到另
一个代理镜上，两支平行光线通过要研究的样品，做出聚焦的衍射图像，
然后将衍射图像反射到接收端，接收端再将衍射图像转换成电子信号，然
后显示在屏幕上，这样就能将样品的形态、结构和化学组成辨认出来。

由于激光共聚焦显微镜的衍射成像效果比传统的光学显微镜要好，所
以在研究微小样品的形态、结构和化学组成时非常有用。

它可以用来观察
微小样品的形状和细节，如细胞、细菌和细胞器结构等，还可以观察抗原、抗体和药物在细胞和组织内的分布情况，在药物研发、生物医学、食品卫
生质量检测等多个领域得到了广泛的应用。

双光子共聚焦显微镜的原理

双光子共聚焦显微镜的原理概述双光子共聚焦显微镜（Two-Photon Confocal Microscopy）是一种高分辨率三维显微镜技术，能够实时观察生物标本的活体动态过程。

相较于传统的单光子共聚焦显微镜，双光子共聚焦显微镜具有更高的分辨率、较大的穿透深度和较小的光损伤。

双光子共聚焦显微镜基于非线性光学效应，利用非线性显微镜技术实现高分辨率成像。

其原理是通过同时或交替地聚焦两束高能量激光光束，在聚焦点附近产生非线性吸收效应，从而实现高分辨率的三维成像。

光学原理1. 激光光源双光子共聚焦显微镜通常使用飞秒激光器作为光源。

飞秒激光器具有短脉冲宽度和高峰值功率的特点，激发样品时光线非常集中，能够有效减小光损伤和光散射。

2. 非线性光学效应双光子共聚焦显微镜利用非线性吸收现象来实现高分辨率成像。

在样品中，通常需要使用荧光标记的染料或者色素进行成像。

这些染料或者色素具有非线性吸收的特性。

在双光子共聚焦显微镜中，两束飞秒激光光束在样品的焦点处交叉，产生高能量密度的光子。

这些光子被样品中的非线性物质吸收，导致非线性激发发生。

非线性激发产生的荧光信号被收集并记录下来，从而实现高分辨率的成像。

3. 深度成像双光子共聚焦显微镜由于使用了长波长的激光束，具有较大的光学穿透深度。

这是因为长波长的光在样品中的散射和吸收较小，能够更好地穿透表面的组织。

此外，由于双光子共聚焦显微镜是基于非线性吸收效应的，只有在激光焦点附近才会发生非线性吸收。

这也意味着只有在焦点位置处的样品才会被激光激发，从而减小了其它位置的光损伤，增加了穿透深度。

操作原理1. 激光扫描双光子共聚焦显微镜通过激光扫描的方式获取样品的三维信息。

通常，激光束经过反射镜和扫描镜，通过改变扫描镜的角度和位置，使激光在样品表面扫描移动。

2. 荧光信号收集双光子共聚焦显微镜在样品表面或焦点处收集荧光信号。

收集的荧光信号经过乳胶片或者光电倍增管进行记录和放大。

由于双光子共聚焦显微镜具有优异的光收集能力和高信噪比，能够对低强度荧光信号进行高灵敏度的接收。

激光共聚焦显微镜原理

激光共聚焦显微镜原理
激光共聚焦显微镜是一种利用激光光源和光学系统进行成像的显微镜。

它可以实现高分辨率、高对比度的三维图像获取。

激光共聚焦显微镜的原理是基于共聚焦的概念。

其核心部件是激光扫描系统和探测器。

激光扫描系统由激光器、扫描镜和一系列聚焦镜组成。

激光器发出一束光，经过扫描镜反射和聚焦镜的调节，使得光束能够在样品上形成一个聚焦点。

在样品上的聚焦点处，光与样品发生相互作用，一部分光被样品吸收、散射或荧光激发，另一部分光经过样品的透射或反射。

探测器是用来收集经过样品的光信号。

常用的探测器包括光电二极管和光电倍增管。

收集到的光信号经过增强处理和放大后，转化为电信号。

这些信号经过处理后，可以生成二维或三维的图像。

激光共聚焦显微镜具有许多优点。

首先，它具有非常高的分辨率，在亚细胞水平上可以观察到细胞和组织结构。

其次，它可以实现非侵入性的成像，即无需染色和切片处理，就可以观察到活细胞的结构和功能。

此外，激光共聚焦显微镜还可以捕捉到高质量的图像和进行实时观察，对于研究生物学、医学和材料科学等领域具有重要的应用价值。

总之，激光共聚焦显微镜运用激光光源和光学系统，通过共聚焦原理实现高分辨率的三维图像获取，具有广泛的应用前景。

激光共聚焦原理

激光共聚焦原理激光共聚焦（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，通过利用激光束的特殊聚焦方式，可以获取高质量的三维显微图像。

激光共聚焦显微镜的原理是基于激光束的共聚焦特性，实现对样品的逐点扫描和成像。

激光共聚焦显微镜的核心部件是激光光源、聚焦物镜、光路分束器、探测器和图像处理系统。

激光光源可以是氩离子激光器、固体激光器或半导体激光器，其发出的激光束具有高度的单色性和方向性。

聚焦物镜是将激光束聚焦到样品上的关键部件，它能够实现高倍率的放大和高分辨率的成像。

光路分束器用于将激光束分为两个光路，一个用于样品的照明，另一个用于信号的探测。

探测器可以是光电二极管、光电倍增管或光电子多线阵列等，用于接收样品散射或荧光发射的光信号。

图像处理系统则将探测到的信号转化为数字图像，并进行图像增强、三维重建等处理。

激光共聚焦显微镜的原理可以用以下步骤来描述：1. 激光照明：激光光源发出的激光束通过光路分束器，其中一部分激光束照射到样品上。

2. 聚焦成像：经过聚焦物镜的调节，激光束被聚焦到样品的一个小点上。

由于激光束的高度单色性和方向性，聚焦后的光点非常亮且细小，使得可以获得高分辨率的显微图像。

3. 光信号收集：样品中的物质对激光束的照射会发生散射或荧光发射，这些光信号被探测器收集并转化为电信号。

4. 光路控制：光路分束器将探测到的光信号分为透射光和反射光，透射光通过探测器后被丢弃，而反射光则被送入图像处理系统。

5. 图像处理：图像处理系统将反射光信号转化为数字图像，并进行图像增强和三维重建等处理，最终得到高质量的三维显微图像。

激光共聚焦显微镜在生物学、医学、材料科学等领域具有广泛的应用。

其高分辨率和三维成像能力使得研究者可以观察到细胞内部的微观结构和细胞器的分布情况，进一步研究细胞的功能和变化。

同时，激光共聚焦显微镜还可以应用于材料表面的显微观察和纳米尺度的结构分析，为材料科学的研究提供了重要的工具。

共聚焦显微镜原理

共聚焦显微镜原理
共聚焦显微镜（confocal microscopy）是一种高分辨率、三维成像的显微镜技术，其原理基于光学共聚焦。

与传统的广场焦显微镜相比，共聚焦显微镜通过在样本和目标平面之间插入一个光阑来限制光线的进入和返回，使得只有非常窄的焦平面上的光信号被检测到，从而可以消除来自非焦平面的模糊和散射光的影响。

共聚焦显微镜的主要组成部分包括激光源、物镜、光阑、探测器和图像处理系统。

激光源产生一束单色、相干光，经过激光扫描器和聚焦透镜后，光线聚焦到样本的表面上。

由于光阑的存在，只有处于目标平面上的光信号能够返回到探测器进行检测。

具体来说，激光扫描器通过改变镜片的位置和倾斜角度，使得激光束在样本上进行扫描，从而形成一个二维的光点阵列。

这些光点经过样本的散射、荧光和反射等过程后，通过物镜重新聚焦到探测器上。

探测器可以是光电二极管或光电倍增管，用于检测返回的光信号。

在图像处理系统中，从探测器上获取到的光信号通过放大、滤波和数字转换等处理，然后以二维像素数组的形式显示在计算机屏幕上。

通过改变激光束的扫描范围和焦距，可以获取样本在不同深度上的断面图像，从而实现三维成像。

共聚焦显微镜在生物学、医学和材料科学等领域具有广泛的应用。

它可以观察和研究细胞和组织的结构、功能和动态变化，
对于研究生物过程、疾病诊断和药物发现等方面有着重要的意义。

同时，由于其高分辨率和三维成像的能力，共聚焦显微镜也被广泛应用于材料表征和纳米技术等领域。

共聚焦显微镜用途

共聚焦显微镜用途共聚焦显微镜用途共聚焦显微镜（Confocal Microscope）是一种高级的显微镜，它具有非常高的分辨率和灵敏度，能够提供高质量的三维图像。

共聚焦显微镜广泛应用于生物医学研究、材料科学、纳米技术、地质学等领域。

本文将详细介绍共聚焦显微镜在这些领域中的用途。

生物医学研究共聚焦显微镜在生物医学研究中被广泛应用。

它可以观察活体细胞和组织的三维结构，分析细胞功能和代谢过程，探索生命现象的机制和规律。

1. 细胞形态与结构分析共聚焦显微镜可以对活体细胞进行高分辨率成像，观察其形态和结构变化。

通过荧光染色技术，可以标记出不同类型的蛋白质、核酸或其他生物大分子，并利用激光扫描成像技术进行三维重建，从而获得更为精确的信息。

2. 细胞活动过程的研究共聚焦显微镜可以实时观察细胞内部的活动过程，如细胞分裂、蛋白质合成、物质转运等。

通过荧光标记技术，可以将特定的分子标记出来，并实时观察其在细胞内的运动轨迹和相互作用。

3. 细胞信号传递通路研究共聚焦显微镜可以用于研究细胞内信号传递通路。

利用荧光标记技术，可以标记出不同类型的信号分子，并观察其在细胞内的分布和相互作用关系，从而揭示信号传递机制。

4. 组织学研究共聚焦显微镜可以对组织进行高清晰度成像。

通过荧光染色技术，可以将不同类型的组织结构染色并标记出来，然后利用激光扫描成像技术进行三维重建，从而获得更为精确的信息。

材料科学共聚焦显微镜在材料科学中被广泛应用。

它可以观察材料表面和内部的微观结构，分析材料性质和性能，探索材料的制备和改性方法。

1. 材料表面形貌研究共聚焦显微镜可以对材料表面进行高分辨率成像，观察其形貌和结构。

通过荧光标记技术，可以将特定的分子标记出来，并实时观察其在材料表面的分布和相互作用关系。

2. 材料内部结构研究共聚焦显微镜可以对材料内部进行高清晰度成像。

通过荧光染色技术，可以将不同类型的组织结构染色并标记出来，然后利用激光扫描成像技术进行三维重建，从而获得更为精确的信息。

共聚焦显微镜用途

共聚焦显微镜用途
共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它可以在非常小的区域内进行高分辨率成像。

这种显微镜的用途非常广泛，以下是一些常见的应用：
1. 生物学研究：共聚焦显微镜可以用于生物学研究，例如观察细胞和组织的结构和功能。

它可以提供高分辨率的图像，使研究人员能够更好地了解生物学系统的工作原理。

2. 材料科学研究：共聚焦显微镜可以用于材料科学研究，例如观察材料的表面形貌和结构。

它可以提供高分辨率的图像，使研究人员能够更好地了解材料的性质和行为。

3. 医学诊断：共聚焦显微镜可以用于医学诊断，例如观察细胞和组织的结构和功能。

它可以提供高分辨率的图像，使医生能够更好地了解病人的病情和治疗方案。

4. 环境科学研究：共聚焦显微镜可以用于环境科学研究，例如观察微生物和污染物的结构和行为。

它可以提供高分辨率的图像，使研究人员能够更好地了解环境中的微观世界。

共聚焦显微镜是一种非常有用的工具，可以用于各种领域的研究和应用。

它的高分辨率成像能力使其成为了许多科学家和医生的首选工具之一。

激光共聚焦显微镜图像分析的基本步骤

激光共聚焦显微镜图像分析的基本步骤激光共聚焦显微镜是一种高分辨率、高对比度的显微镜技术，广泛应用于细胞生物学、药物研发、材料科学等领域。

本文将介绍激光共聚焦显微镜图像分析的基本步骤。

第一步：数据采集激光共聚焦显微镜通过集焦光束扫描样本，得到连续的光学切片图像。

图像采集是整个分析过程的基础步骤，关系到后续图像处理和分析的准确性。

在进行图像采集前，需要根据样本的特点和研究目的选择合适的显微镜镜头、激发波长和检测滤光片等。

第二步：图像预处理由于样本的荧光信号受到自然光和背景噪声的影响，采集到的图像往往不够清晰。

因此，在进行图像分析之前，通常需要对图像进行预处理来增强信号。

预处理的具体方法包括去噪、反淡化和图像增强等。

去噪可以使用平滑滤波算法，反淡化可以通过图像锐化算法来实现，图像增强则可以通过直方图均衡化等方法来提高对比度。

第三步：图像分割图像分割是将图像中的目标物体与背景相分离的过程。

在激光共聚焦显微镜图像中，可以根据样本的荧光强度、颜色以及形态学特征等信息进行分割。

常用的图像分割算法包括阈值分割、边缘检测和区域生长等。

分割后的图像可以更清晰地显示样本的形态和结构。

第四步：目标识别与定量分析经过图像分割后，可以对图像中的目标进行识别和测量。

目标识别可以通过计算图像中连通区域的特征参数来实现，如面积、周长、形状等。

目标的定量分析可以根据研究需求进行不同的统计和计算，如细胞数量统计、染色体长度测量等。

这些定量分析可以提供更精确的结果，帮助研究者深入理解样本的特性和变化。

第五步：数据可视化与结果呈现图像分析得到的结果通常以图表或图像的形式展示。

数据可视化可以让研究者更直观地理解和分析分析结果。

常用的可视化方法包括直方图、散点图、线图等。

此外，图像的后处理和调整也是结果呈现的重要环节，可以通过调整亮度、对比度和色彩平衡等参数，使图像更加美观和易于理解。

综上所述，激光共聚焦显微镜图像分析是一个复杂的过程，包括数据采集、图像预处理、图像分割、目标识别与定量分析以及数据可视化等多个步骤。

激光共聚焦扫描显微镜用途

激光共聚焦扫描显微镜用途
激光共聚焦扫描显微镜 (laser scanning confocal microscope, LSCM) 是一种高分辨率三维成像技术，常用于生物医学研究中的细胞和组织的成像，以及材料科学中的表面形貌和结构研究。

主要用途包括：
1.细胞和组织成像：能够提供高分辨率、高对比度和高灵敏度的三维成像，可用于观察细胞、细胞器、染色体、细胞分裂、细胞移动和细胞难以观察的细节等。

2.神经科学：可以观察和研究神经元的形态、分布和连接，研究神经退行性疾病、精神疾病等。

3.组织工程：可以观察和分析仿生材料和组织工程构建的三维结构和微观形态，研究材料组织与功能的关系。

4.材料科学：可以研究材料的形貌、表面结构和三维形态，对材料的微观结构和性能有很好的描述和展示，对于纳米材料、高分子材料等研究具有重要作用。

5.环境科学：用途在环境监测和研究中，可以研究颗粒、微生物、污染物等微观结构，有利于了解污染形成、传播和去除等。

总之，激光共聚焦扫描显微镜在许多领域中发挥着重要作用，可用于研究和观察微观结构和形态，解决许多科学难题。