氨基移换反应及其产物鉴定

实验报告

课程名称： 生物化学实验 指导老师： 成绩：

实验名称：氨基移换反应及其产物的鉴定 实验类型： 同组学生姓名：

一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理

六、实验结果与分析（必填）

七、讨论、心得

一、实验目的

1、 学习一种鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理。

2、 掌握纸层析的原理和操作技术。

3、 了解氨基移换反应在代谢中的作用。

二、实验原理

在氨基移换酶的催化下，氨基酸的α—氨基和α—酮酸的α—酮基可以互换，这种反应称为氨基移换反应。它对于生物体内的各大类物质的代谢在相互联系、相互转化上起着很重要的作用。转氨酶的种类很多，具有专一性，最适合的PH 接近7.4。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（GPT ）、谷草转氨酶（GOT ）活性较高。 本实验利用纸层析法，检查由α—酮戊二酸和丙氨酸在牛蛙肝细胞内谷丙转氨酶的作用下所生成的谷氨酸，从而定性证明组织内的氨基移换作用。反应式如下：

L －谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化L －谷氨酸氧化脱－NH2，加碘乙酸（或溴乙酸）能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反应的产物L －谷氨酸。

三、仪器和试剂

1. 材料：动物肝脏（蟾蜍或猪）

2g

2. 试剂：

①0.01mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（转氨反应所需缓冲溶液）

②0.1mol/L pH7.4 α－丙氨酸（转氨反应底物，同时作为纸层析点样时的标准品）

③0.1mol/L pH7.4 α－酮戊二酸（转氨反应底物）

④0.1mol/L pH7.4 α－L－谷氨酸（纸层析点样时的标准品）

⑤展层溶剂－酚溶液（纸层析用）

⑥10% 三氯乙酸（中止酶促反应，同时使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀下来）

⑦0.25% 碘乙酸溶液（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性）

3. 仪器：

①试管及试管架②恒温水浴箱（37℃、100℃）③铅笔和尺④玻璃毛细管

⑤新华定性滤纸（Ø 12cm）⑥剪刀和镊子⑦烘箱（80℃）⑧滴管

⑨康氏皿（做层析缸）⑩电吹风机及喷雾器（喷洒茚三酮丙酮溶液）

四、实验步骤

1、酶液的制备

取新鲜牛蛙的肝脏约3g，在研钵中用剪刀充分剪碎。加少许石英砂，先研磨数分钟（约10分钟），再加入3mL磷酸缓冲液迅速研磨，成为均匀的浆质后，再加入9ml磷酸缓冲液，用2－4层纱布加上玻璃漏斗过滤，留取滤液，即得转氨酶提取液（为粗酶液）。

2、氨基移换反应

取4支洁净、干燥的试管，按下表操作（单位：ml）

管号

项目 1 2 3 4 酶液（mL） 1 1 1 1

0.25%碘乙酸溶液（mL）0.5 0.5 0.5 0.5

置37℃恒温水浴保温5min（预热反应体系）100℃沸水浴5

min（灭活酶）

0.1mol/L丙氨酸溶液（mL） 1 1 / 1

1 / 1 1

0.1mol/Lα—酮戊二酸

（mL）

磷酸缓冲液（mL） 1 2 2 1 酶促反应混匀, 置37℃恒温水浴保温40min(经常摇动)

中止酶促反应滴加10%三氯乙酸溶液2滴,置100℃恒温水浴保温5min

3、层析及显色

取新华定性滤纸（直径12cm ）一张（保持干净），按图1做出点样位置。找出圆心，用圆规画一直径1.5～2cm 的小圆圈，用铅笔尖在圆心处截一小圆孔（孔径约0.2～0.3cm ）。在点样点的圆圈内侧用铅笔轻轻标记样品号，用玻璃毛细管依次在各原点上点样，标准品（丙氨酸、谷氨酸）各点两次，其余样品各点3次。点样时，要待前次点样干燥后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm 。另取1.5cm ×（3～4）cm 滤纸，先将下端剪成须状，卷捻成“灯芯”，上端插入小圆孔，然后将该滤纸平放在盛有展层溶剂的康氏皿中，使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中，再在滤纸上方盖上另一康氏皿（图2）。展层剂沿“灯芯”上升到滤纸，再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)时，取出滤纸，用镊子拔出“灯芯”，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.3%茚三酮丙酮溶液，用电吹风热风吹干显色（或者放入80℃烘箱中显色3min ）。

图1 层析滤纸示意图 图2 层析装置示意图

五、结果分析

1号反应管：部分丙氨酸将氨基转移给α—酮戊二酸，生成了谷氨酸，所以有丙氨酸和谷氨酸两条显色带。 2号反应管：只有单一底物丙氨酸，没有发生氨基移换反应。所以只有一条丙氨酸的显色带。

3号反应管：只有单一底物α—酮戊二酸，没有发生氨基移换反应。所以没有出现显色带。但仔细观察可以发现有极少量谷氨酸的显色带，可能是由于滤纸“灯芯”遭到1号反应管中样品的污染或者酶液中本身存在的少量谷氨酸。

4号反应管：虽然有两种底物，但是转氨酶提前100℃变性失活了，也没有发生氨基移换反应。只有一条丙氨酸的显色带。

5号谷氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色（半径较小）显色带。 6号丙氨酸标准品：出现一条圆弧状的紫红色（半径较大）显色带。

注意事项：

1、整个操作过程中勿用手直接接触层析用的定性滤纸和纸质灯芯，需要带手套操作。

2、点样时，要待前次点样干燥后方可再次点样，点样点尽量小而圆，直径不超过0.3cm 。

3、样品点样点不要吹得太干，吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。

4、使用层析剂、显色剂时勿用手直接操作（需要戴上塑料手套，苯酚有较强腐蚀性，手上汗液有杂质可以干扰显色反应）。

5、防止各种样品之间交叉污染，每点完一种样品后，立即更换新的毛细管。