CD90磁珠分选protocol
CD90＋和CD90－成纤维细胞亚群脂成纤维细胞转化的研究-论文
本课题为全国高校博士点基金资助（课题编号20050610064）通讯作者：罗清礼，Email:******************CD90＋和CD90－成纤维细胞亚群脂成纤维细胞转化的研究唐 莉 罗清礼 廖咏川 何为民四川大学华西医院眼科，四川成都（610041） Email:******************摘要 目的 依据培养的甲状腺相关性眼病患者眼眶成纤维细胞是否表达CD90分为两个亚群，分离这两个细胞亚群，将眼外肌来源的和眶脂肪/结缔组织来源的CD90+和CD90-的成纤维细胞分别诱导转化为脂肪细胞，观察比较它们各自的转化率，明确对脂肪形成起主要作用的成纤维细胞亚群。
方法 免疫磁分离法分离CD90+和CD90-的眼眶成纤维细胞，诱导CD90+和CD90-成纤维细胞亚群转化为脂肪细胞，分别于诱导后第5、10、15、20天油红O染色，计数染色阳性细胞，计算脂成纤维细胞的转化率。
结果 TAO病人眼外肌来源CD90＋成纤维细胞基本不能转化为脂成纤维细胞。
眼外肌来源的CD90-成纤维细胞、眼眶脂肪/结缔组织来源的CD90+成纤维细胞、眼眶脂肪/结缔组织来源的CD90-脂成纤维细胞转化率分别为： 10%、40%、72%。
结论 眼眶成纤维细胞具有解剖部位异质性，CD90+和CD90-成纤维细胞功能不同，具有分化为脂肪细胞功能的脂成纤维细胞主要是CD90-的眶脂肪/结缔组织成纤维细胞。
关键词 甲状腺相关性眼病；眼眶成纤维细胞亚群；脂成纤维细胞；中图分类号： R 777.501 文献标识码 AThe study of lipofibroblast differentiation of CD90 + andCD90 - orbital fibroblasts subsetsTang Li, Luo Qingli,Liao Yongchuan,He weimingDepartment of Ophthalmology,West China Hospital,Sichuan University, Chengdu,610041AbstractObjective To isolate CD90+ and CD90- subsets from orbital fibroblasts of patients withthyroid-associated ophthalmopathy ,and determine whether CD90 + and /or CD90 - fibroblasts can differentiate into lipocyte. Methods CD90+ and CD90- subsets were isolated from orbitalfibroblast by immunomagnetic separation ,and induced to transform into lipocyte. after induction, the cells were stained with oil red at the fifth 、tenth 、fifteenth 、twentieth day, and the stained positive cells were counted to measure the transformation efficiency of lipofibroblast. Results CD90+ fibroblast isolated from extraocular muscles with thyroid-associated ophthalmopathy did not have the ability of lipofibroblast differentiation .While CD90-fibroblast isolated fromextraocular muscles and CD90+ and CD90-fibroblast isolated from orbital connective tissue/fat can transform into lipofibroblas,their transformation efficiency were 10%、40% and 72%,respectively.Conclusion Orbital fibroblast have heterogeneity with respect to anatomic site. The function of CD90+ and CD90-fibroblast is different, the lipofibroblast that has an ability to differentiate towards lipocyte is main CD90-fibroblast of Orbital adipose/connective tissue. Keywords Thyroid associated ophthalmopathy; orbital fibroblasts subsets; Lipofibroblast;1. 引言甲状腺相关眼病（Thyroid associated ophthalmopathy, TAO）是眼科常见病，主要表现为眶周水肿、眼球突出、暴露性角膜炎、复视和压迫性视神经病变等临床改变，眼眶组织的病理研究证实病变主要累及眼外肌与眼眶脂肪/结缔组织，正是眼眶脂肪增多、眼外肌纤维化、亲水性细胞外基质的大量堆积导致了上述一系列的临床表现。
磁珠分选说明书
磁珠分选说明书磁珠分选是一种利用磁性原理进行分选的方法，通常用于分离微小颗粒或细胞等。
下面是一份磁珠分选的简单说明书：一、原理磁珠分选基于磁性原理，通过磁场作用将磁珠与目标颗粒或细胞结合，再利用磁力的差异将磁珠与目标物分离，从而实现分选。
二、操作步骤1. 准备所需试剂和磁珠：根据实验需求准备相应的缓冲液、抗体或特异性配体，以及磁珠。
确保磁珠经过充分混匀。
2. 磁珠与目标物的结合：将磁珠与目标物（如抗体、核酸或其他配体）混合，使其充分结合。
通常需要在适当的缓冲液中进行孵育。
3. 磁力分选：将结合了目标物的磁珠转移到磁场中进行分离。
通常需要将磁珠与目标物混合物加入到特制的分离柱或管中，然后施加磁场。
4. 洗涤：为了去除未结合的目标物和其他杂质，进行洗涤操作。
将磁珠从磁场中取出，用缓冲液冲洗。
5. 洗脱和收集：最后，通过改变磁场或加入特定的洗脱液，将目标物从磁珠上洗脱下来并收集。
三、注意事项1. 确保所有操作在适当的缓冲液中进行，以维持磁珠和目标物的稳定性。
2. 根据实验需求选择合适的磁珠和特异性配体，以确保最佳的结合效果。
3. 注意磁力分选时的操作，避免磁珠吸附到容器壁或其他杂质上。
4. 在进行洗涤和洗脱时，要确保操作步骤准确，避免损失目标物。
5. 保持操作环境的清洁，避免污染。
四、应用领域磁珠分选广泛应用于生物医学研究、药物筛选、基因测序等领域，尤其在单细胞分析、蛋白质组学和核酸研究中发挥着重要作用。
以上是一份简单的磁珠分选说明书，具体操作步骤和细节可能因实验需求和试剂而有所不同。
在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和试剂说明书，并遵循实验室安全规范。
磁珠分选步骤
磁性标记和分选步骤：1.制备无菌Buffers,冰上放置。
细胞染色缓冲液（cell-staining buffer）：含3%热灭活胎牛血清和0.1%叠氮化钠的PBS。
1×BD IMag™ buffer：按1:10稀释(10X)BD IMag™ Buffer ，用无菌蒸馏水或加有0.5% BSA，2 mM EDTA和0.1% 叠氮化钠的PBS稀释。
2.无菌操作，从外周淋巴组织内制备单细胞悬浮液。
然后用70μm的尼龙细胞过滤器滤除细胞簇和组织碎片。
用cell-staining buffer制备细胞悬浮液。
3.细胞计数：如果细胞浓度在10 x 106和20 x 106/ml之间进行第3步，如果浓度低于10 x106如，离心细胞，并用cell-staining buffer重悬细胞至终浓度20 x 106/ml。
4.可选：在细胞悬液内添加BD Mouse Fc Block纯化的抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体2.4G2（BD Mouse Fc Block⇔ purified anti-mouse CD16/CD32 mAb 2.4G2），每1 x 106个细胞添加0.25μg，然后冰浴15min.5.添加生物素标记的小鼠树突状细胞富集混合物（Bioinylated Mouse Dendritic Cell EnrichmentCocktail），每1 x 106个细胞添加5μl ,冰浴15min.6.用10x过量体积的1X BD IMag™ buffer洗涤标记细胞，300 ⋅ g离心7分钟并小心吸去所有上清液。
7.彻底涡旋BD IMag™ Streptavidin Particles Plus – DM后，每1 x 106个细胞添加5μl。
8.混匀，然后6˚C - 12˚C冷藏30min.9.用1X BD IMag™buffer将标签量提高到20到80 x 106/ml。
10.把标记细胞转移到12 x 75 mm的圆底试管，添加的最大体积不超过1.0ml。
磁珠分选细胞的流程
磁珠分选细胞的流程磁珠分选细胞的流程导言磁珠分选细胞是一种常用的生物实验技术，用于分离和纯化特定类型的细胞。
本文将详细介绍磁珠分选细胞的流程。
流程概述磁珠分选细胞的流程包括以下几个关键步骤：1.细胞样本准备2.标记抗体的磁珠制备3.细胞标记4.分离和纯化5.细胞收集细胞样本准备•收集要进行分选的细胞样本，并保持细胞在理想状态。
•细胞样本可能是细胞悬液、细胞培养物或组织样本。
标记抗体的磁珠制备•选择合适的抗体，根据需要标记于磁珠表面。
•磁珠通常是微米级尺寸的球形颗粒，具有磁性。
细胞标记•将标记抗体的磁珠与细胞样本接触，使抗体与目标细胞特异性结合。
•此步骤旨在实现细胞的选择性识别和贴附。
分离和纯化•使用磁力装置，将目标细胞与非目标细胞区分开来。
•特定类型的细胞将与磁珠一起集中于磁力区域，而其他细胞则会被分离开来。
•通过反复洗涤步骤，去除非目标细胞和未结合的磁珠。
细胞收集•将目标细胞从磁珠上洗离。
•收集纯化后的目标细胞，以供后续实验或应用使用。
结论磁珠分选细胞是一种可靠且高效的技术，可以根据细胞表面的特定标志物对细胞进行分离和纯化。
通过以上流程，我们可以获得高纯度和活力的目标细胞，为后续研究提供可靠的样本。
注意：本文仅涵盖了磁珠分选细胞的基本流程。
在实际应用中，根据具体实验目的和样本特点，流程的细节可能会有所调整。
流程细节细胞样本准备•收集细胞样本时，需要注意使用无菌技术，以避免任何潜在的污染。
•根据实验需要，细胞样本可以通过离心、过滤或组织切割等方法获取，并转移到适当的容器中。
标记抗体的磁珠制备•选择合适的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据目标细胞的特异性。
•将抗体标记于磁珠上，常见的标记方式有生物素-亲和素（Biotin-Streptavidin）和抗原-抗体的反应。
细胞标记•将标记抗体的磁珠与细胞样本混合。
混合时间和温度可根据抗体与细胞之间的结合速度进行调节。
•为了增强结合反应，可以添加辅助试剂如牛血清白蛋白（BSA）或羊血浆。
isct_间充质干细胞_鉴定标准_理论说明
isct 间充质干细胞鉴定标准理论说明1. 引言1.1 概述在细胞治疗和再生医学领域，间充质干细胞（ISCT）作为一种重要的细胞资源，引起了广泛的关注。
ISCT具有多向分化潜能、免疫调节作用及促进组织修复的能力，被认为是一种理想的干细胞来源。
然而，由于缺乏统一和规范的鉴定标准，在实践应用中存在着不确定性和挑战。
1.2 文章结构本文将对ISCT进行深入探讨，并重点介绍其鉴定标准的理论说明。
文章包括以下几个部分：引言、ISCT间充质干细胞、鉴定标准理论说明、实践应用与挑战以及结论与展望。
1.3 目的本文旨在系统梳理当前关于ISCT鉴定标准的理论知识，并探讨该领域面临的实践应用和挑战。
通过对ISCT表面标记物使用、功能性特征评估方法以及分子生物学检测手段应用等方面原理的介绍，希望能够提供给读者一个全面的理论基础，并展望ISCT鉴定标准未来的发展方向。
同时，对于临床转化前景展望、存在的问题与挑战以及解决方案和研究进展等方面也将进行讨论。
以上是本文“1. 引言”部分的详细内容。
该部分概述了文章的主题和目的，并介绍了本文的结构。
接下来将继续展开描述ISCT间充质干细胞及其鉴定标准相关内容。
2. ISCT间充质干细胞2.1 定义与特征ISCT（国际干细胞治疗学会）定义了间充质干细胞（MSCs）作为一类多潜能的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。
这些细胞可以从不同来源获得，包括骨髓、脐带血、脂肪组织等。
ISCT认为，MSCs应满足以下三个基本标准：1) 在培养条件下，MSCs应具备黏附能力；2) MSCs应表达特定的表面标记物，如CD73、CD90和CD105，并且在同时应该缺乏（或仅有极低水平）CD34、CD45、HLA-DR等造血和免疫相关标记物；3) MSCs应能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等不同种类的细胞。
此外，ISCT提出了额外的功能性特点来进一步确认MSCs。
这些功能性特点包括：1) 免疫调节作用：MSCs可以抑制免疫反应，并通过调节T淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的功能来达到免疫调节作用；2) 细胞迁移能力：MSCs具有从注射部位向受损组织迁移的能力；3) 分泌多种生物活性分子：MSCs可以产生多种生长因子、细胞因子和表观遗传调控因子，对损伤修复和组织再生具有重要作用。
免疫磁珠
德国美天旎Miltenyi细胞分选磁珠CD90(Thy1.2)MicroBeads小鼠CD90(Thy1.2)微珠用于从淋巴和非淋巴组织单细胞悬液或外周血中分选或去除小鼠T细胞。
CD90表达于胸腺细胞、外周T细胞、一些上皮内T 细胞上，在骨髓早期造血干细胞上有低水平表达。
在小鼠中CD90识别的T细胞群与表达CD3的细胞群基本相同。
应用：CD90微珠分选的T细胞可用于分析小鼠肺纤维化模型中细胞因子的表达，或者将野生型和基因敲除小鼠的T细胞过继性转移至免疫缺陷小鼠体内，研究其细胞因子的表达。
另外，CD90微珠还可用于分选肿瘤浸润性T细胞，研究其免疫治疗潜能或者功能特性。
分选柱：阳性分选：MS、LS、XS或autoMACSTM分选柱。
去除分选：LD、CS、D或autoMACS分选柱。
有关磁珠的知识：MACS磁珠是一种与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，用于目的细胞或者去除细胞的磁性标记。
磁珠直径约有50nm，比细胞小200多倍，体积为细胞的百万分之一，光学显微镜下不可见。
磁珠由多聚糖和氧化铁组成，无毒性，对细胞无损伤，可以生物降解。
MACS微珠与流式细胞仪兼容，不会影响细胞的光散射特性；磁性标记只占用20－30％的结合位点，不影响细胞的荧光抗体标记。
此外，MACS磁珠可以最大限度地避免细胞活化；无需解离磁珠，可以直接进行后续实验：如流式细胞仪分析或分选、细胞培养、分子生物学研究、回输给人或者动物。
MACS磁珠主要有三种：直标磁珠、间标磁珠、多选磁珠。
其中间标磁珠有抗免疫球蛋白磁珠、抗生物素磁珠或链霉亲和素磁珠、抗荧光素磁珠。
多选磁珠是专门为分选细胞亚群而研制的一种磁珠。
这种磁珠通过特殊的方式与抗体偶联，在第一次阳性分选完成后，与细胞结合的多选磁珠可以被解离试剂剪切下来，阳性分选的细胞可以进行再次阳性分选或者去除分选。
磁珠分选流程
磁珠分选流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!磁珠分选流程磁珠分选是一种高效分选颗粒物的方法，广泛应用于生物、化学、医学等领域。
facsaria流式细胞分选调试参数和最佳条件的设定_医学论文
FACS Aria流式细胞分选调试参数和最佳条件的设定_医学论文FACS Aria流式细胞分选调试参数和最佳条件的设定_医学论文作者：曹云新, 胡金涛, 杨安钢【摘要】目的：探讨FACS Aria流式细胞仪分选细胞亚群的调试参数和最佳设定条件. 方法: 采用进口分选质控试剂Accudrop Beads和自配鞘液为材料. 在FACS Aria流式细胞仪上，对分选液滴的振荡频率(Freq)、振动幅度（Ampl）和液滴间隔值（Gap）进行调试，摸索分选的最佳设定值. 结果：使用100 mm喷嘴，主液流窗Ampl设定为30±2，Gap灰带宽度为(2.0±0.5) mm，侧液流断点窗 4个分叉斑点直径调为(2±0.2) mm，4叉液流束光斑调至集中明亮，边界清晰，液滴偏转延时值为25±1附近，调试效率最高. 其分选纯度可达99%, 分选回收率可达98%. 结论: 流式分选条件的设定和建立，对于提高分选细胞活性，获得高纯度和高回收率的细胞，提供了快速调试的途径.【关键词】流式细胞术；分选细胞；条件【Abstract】 AIM: To find the optimal adjustment conditions and parameters for sorting cell subsets with FACS Aria flowcytometer. METHODS: Using imported sorting quality control Accudrop Beads and self made sheath fluid as materials, we kept adjusting the oscillation frequency and amplitude (Ampl) and the gaps between drops (Gap) of the sorted sample until an optimal configuration for the sorting was found and set. RESULTS: Using the 100 um nozzle, the mainstream window Ampl was set at 30±2, the Gap width at (2.0±0.5) mm, and each spot of the four forks in the side stream breakoff point window was (2±0.2) mm, the light spot of the 4 fork streams was adjusted until it was focused and bright and had clear boundaries. When the drop declination delay value was 25±1, the adjustment efficiency reached its optimum, with its purity at 99% and sorting recovery rate at 98%. CONCLUSION: Rapid adjustment and fixing of the conditions for sorting with flow cytometry is ofsubstantial significance to the purity, activity and precision of the sorted cells as well as the stability, efficiency and success of sorting.【Keywords】 flow cytometry sorting cell conditions0 引言在流式细胞分选前的参数设定和调试是细胞分选的关键性工作，它的好坏与快慢，直接影响细胞分选的效率、纯度和精度. 目前国内外对于分选技术方法学研究和探讨的文献报道并不多见［1-2］. FACS Aria流式细胞仪是集临床和科研为一体的高精密分析和高速细胞分选的仪器，其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定的细胞、细胞器或质点，以便做进一步细胞鉴定、功能研究或细胞克隆培养，其分选速度之快是其它方法无法比拟的［3-4］. 由于分选之前仪器的条件设置和调试比较繁琐、费时,如果不能很好地掌握这些参数和条件的设置技巧，将会对分选细胞的效率、纯度、精度以及活性的保持产生较大影响. 为最大限度地发挥仪器的功能和效率，我们对细胞分选调试的参数和最佳条件的设定做了一些探索和研究.1 材料和方法1.1 材料FACS Aria分选型流式细胞仪, 稀释鞘流液FACSFlow，溶血液和分选质控试剂Accudrop Beads等均为美国 Becton Dickinson 公司产品； Q Prep型免疫学样品制备仪，美国 Beckman Coulter 公司产品；分选所用标本为第四军医大学西京医院查体健康人肝素抗凝全血.1.2 方法1.2.1 样品制备将Accudrop Beads用FACSFlow液稀释后备用，分选样品用含肝素的真空采血管收集抗凝血2～3 mL,充分混匀，每份取100 mL全血样品加入CD4 FITC和CD8 PE避光染色30 min, 上Q Prep型免疫学样品制备仪,溶解红细胞，稳定和固定白细胞，3 h内上机分析和分选.1.2.2 主液流调校观察主液流窗的主液滴和卫星点及液流断点位置状况：将主液流断点窗的Stream打开，并设为中速（应用70 mm喷嘴）,相对固定液滴振荡频率（Freq）,调液滴振动振幅（Ampl），使第1液滴的值落在240附近，液滴间隔值（Gap）尽量恒定,使液流断点位于窗口的中上部.1.2.3 侧液流调校打开侧液流窗的高压，激活分选测试（Test sort）窗. 此时运用主液流窗中的Ampl调试，使四束偏转液流和废液流 5个光斑间距尽可能地拉开，各光斑调至明亮、集中. 此后安装两路或四路分选收集管装置. 打开分选窗，点开分选门，观察偏转的分选液流是否落入分选相应的收集管正中. 如果没有，可轻轻左右拉动侧液流窗的电压滚动条，使分选液流准确落入收集管中. 之后关闭分选电压. 将主液流窗中实际调出的Drop1值添到Drop1默认窗口中. 液流调整好后的Gap值应在默认值±3的范围内.1.2.4 确定液滴偏转延迟加电时间建立一个新的实验文件夹，再建立两个子文件夹(Specimen和Tube). 在右侧电脑的通用工作页面上建立获取模板，用横轴FSC A和纵轴SSC A建立一个散点图，并设单个微球的矩形门P1. 点击Tube使其变为绿色的采集箭头,打开分选窗口，在Device窗口中将选项设为2 Tube，在Precision中选为Initial，在Target events选项中选为Continuous. 赋予Left 为P1. 上样已稀释的Accudrop beads，调整细胞流速为每秒2000～4000个，打开分选电压，点击滤光片图标（Optical Filter）. 此时，侧液流窗口出现两个框，调整Drop delay值，使左框中粗调和细调的光斑值均大于等于95%.2 结果2．1 主液滴、卫星点及液流断点最佳位置主液流窗中主液滴、卫星点及液流断点最佳位置，Gap灰带的适中位置在主液流窗的中上部，主液滴各滴形状规则，卫星点融入液滴良好（图1A）. 而Gap灰带位置落的较高时，液滴无规则形状，无卫星点出现(图1B). 若调试不合理，卫星点太多（图1C）. 图1D～F也均属调试不佳，无法进行正常分选的图形.2.2 侧液流断点窗5叉斑点状况4个分叉斑点直径应在2 mm左右,中间废液斑点应在4 mm左右. 此外，如果看不到左边两束的斑点，可用下方摄像头的螺钉调整，直到光斑较亮较粗为止. 下方摄像头螺钉主要是用来调激光照明灯亮度强弱的，当调到最佳位置时，激光灯珠最亮，此时4叉液流会显示的很清除.2.3 CD4+ T和CD8+ T淋巴细胞亚群分选结果人全血经CD4 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）和CD8 藻红蛋白(phycoerythrin，PE)直接标记染色后，分别获得的CD4＋ T 和CD8＋ T淋巴细胞亚群分选结果（图2），分选纯度为99%, 回收率达到98%. 说明仪器的分选参数设置正确,仪器分选处于最佳状态.3 讨论流式细胞分选是现代细胞分析领域重要的技术之一［5］. 流式细胞分选功能主要是由细胞分选器来完成, 其原理是由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动,断裂形成均匀的小液滴. 系统根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中, 使用不同孔径的喷嘴及改变液流速度,都可能会改变分选效果［6］. 从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间. 精确的调校仪器参数和设定液滴的延迟偏转时间是决定分选质量的关键,可根据具体要求进行适当调整.我们在调试中发现，刚开机时主液流窗常常出现图1E和图1F所示的不规则图形. 此时不要急于调整Ampl等参数，而应先开关几次Stream，待液流断点出现图形有所改善后，再调试Amp1,Freq, Drop1,Gap和Drop delay. 调整主液流液滴断点位置和卫星点时，Amp1的值应≤70,如果>70仍然无法调好，应立即关闭液流，然后反复开关2～3次. 若仍无效果，应检查喷嘴，看是否堵塞. 卸下喷嘴超声清洗后再重新调试，确保卫星点融入主液滴的位置正确. 主液流中的卫星点用100 mm喷嘴时应不大于3个，而70 mm喷嘴不大于5个, Gap框外的值结合Ampl做微小调试，使其达到恒定并不再有太多波动，即可获得如图1A理想的调试结果. 而调侧液流断点窗5叉斑点时，如出现液流分束不清楚、有毛刺，可进一步调整主液流窗的Ampl，也可以同步调整侧液流窗中的2nd 和3nd Drop，给这些液滴的加电量添加一个适当的补偿因子，使之达到液流分束明亮、集中、清楚. 液滴延迟时间能否快速调整好，与Accudrop Beadsd的稀释浓度和P1门是否赋予分选窗，以及分选窗中的Sort是否打开有很大关系. 液滴延迟用于设置细胞检测点与断点处之间的时间间隔，通常为10～140液滴间隔，调整液滴延迟数值决定了即将偏转的液滴的加电时间，调试时应遵循的规律是Drop值愈小，Drop delay应愈小.综上所述，该方法可以快速、准确地设置流式细胞仪的分选参数. 对于做6，24，96孔板和载波片分选细胞也非常实用，可为使用流式细胞仪进行细胞亚群分选的科研人员提供一定的参考价值.【参考文献】［1］Francisco JA, Campbell R, Iverson BL, et al. Production and fluorescence activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(22): 10444-10448.［2］Lekkerkerker A, Logtenberg T. Phage antibodies against human dendritic cell subpopulations obtained by flow cytometry based selection on freshly isolated cells［J］. J Immunol Methods, 1999, 231(1 2):5363.［3］Georgiou G, Stathopoulos C, Daugherty PS, et al. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: From the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines［J］. Nat Biotechnol, 1997, 15(1): 29-34.［4］何小军, 胡静, 夏云, 等. 流式细胞术检测临床实体瘤细胞周期蛋白表达的方法研究［J］. 中国实验诊断学, 2007, (01): 20-23.［5］辛忠涛. 流式细胞分选技术在微生物表面展示文库筛选中的应用进展［J］. 微生物学免疫学进展, 2003, (03)：62-66.［6］徐勇. 免疫磁珠分离及流式细胞仪分选纯化外周血CD34+/CD90+干细胞［J］. 临床检验杂志，2004, (04)：871-873.。
技术五：MACS(磁珠分选)小鼠细胞分选与分析试剂
细胞因子分泌细胞
Mouse IFN-r Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit(PE)
Mouse IL-2 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit(PE)
CD25 MicroBead Kit
CD43(Ly-48) MicroBeads
CD45R(B220) MicroBeads
B Cell Isolation Kit
CD19-FITC/PE/APC
CD25-PE
CD45R(B220)-FITC/PE/APC
CD62L-FITC/PE/APC
DC和DC亚群
CD11c MicroBeads
CD4+ Dendritic Cell Isolation Kit
CD8+ Dendritic Cell Isolation Kit
Plasmacytoid Dendritic Cell IsolationKit
CD11c-FITC/PE/APC
Anti-mPDCA-1-pure/Biotin/FITC/PE/APC
CD8a+ T Cell Isolation Kit
CD25 MicroBead Kit
CD62L(L-selectin) MicroBeads
Anti-MHC class II MicroBeads
CD4-FITC/PE/APC
CD8a-FITC/PE/APC
CD25-PE
CD62L-FITC/PE/APC
技术五：MACS(磁珠分选)小鼠细胞分选与分析试剂
CD138磁珠分选SOP
骨髓CD138MACS操作步骤1.抽取2-5mL骨髓，骨髓转移至锥形管（50mL）中，管内含等体积的细胞培养基（HEPES缓冲液调配）2.滤膜过滤细胞悬液（孔径大小100μm），去除骨碎片或细胞团块。
滤膜使用前须用分选缓冲液（autoMACS running buffer）打湿。
3.20℃，445g离心10min。
4.弃上清，勿激起细胞沉淀，加入分选缓冲液稀释沉淀至初始体积。
5.进行磁珠标记实验，加磁珠。
每1mL抗凝全血或骨髓加50μL 全血CD138微磁珠。
6.混匀，置于冰箱（2-8 ℃）孵育，15min。
7.洗涤细胞。
每1mL抗凝全血或骨髓加入2-5mL分选缓冲液，室温445g离心10min。
8.弃上清，勿激起细胞沉淀，保留一定的上清，避免细胞丢失。
分选缓冲液稀释悬液至1mL。
9.全血分选柱（Whole Blood Column）预处理：从柱顶端加入3mL分选缓冲液，使缓冲液完全流过分选住，去除流出物。
10.将细胞悬液转移到预处理后的分选柱上，收集流出的未标记细胞。
11.再用3×3mL分选缓冲液清洗，收集未标记的细胞片段，与上步收集的流出物混合。
12.卸下全血分选柱，置于收集管上。
13.加入5mL洗脱缓冲液（全血分选柱），向下推挤柱塞，同时收集洗脱流出物。
此流出物即为磁珠标记细胞。
注意：1.本实验选用直接磁珠标记法，实验操作尽量快速、保证细胞的低温环境、使用预冷溶液。
高温、时间太久导致非特异性细胞被标记，影响实验效果。
2.本实验选用全血分选柱（Whole Blood Column）进行磁珠分选。
3.为了增加磁珠标记成分的纯度，可将洗脱成分通过MS/LS分选柱，重新富集。
免疫磁珠分选的基质细胞抗原1(STRO-1)阳性人牙周膜细胞具有多向分化的干细胞特性
细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell Mol Immmi〇l)2020, 36(11)971.论著.文章编号：1007 -8738(2020)11 -0971 -06免疫磁珠分选的基质细胞抗原l(STRO-l)阳性人牙周膜细胞具有多向分化的干细胞特性赵萤，屠腾，丰帆，张旻*(军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔疾病国际联合 研究中心，空军军医大学口腔医学院急诊与综合临床科，陕西西安710032)[摘要]目的采用免疫磁珠法（M ACS)分选人牙周膜细胞基质细胞抗原1阳性（STR0-1 +)细胞及S T R0-1_细胞，并对两种 细胞的干细胞特性进行对比分析。
方法组织消化法分离培养人牙周膜细胞，并采用S T R0-1抗体结合的免疫磁珠对细胞进行 分选。
随后使用流式细胞仪检测STR0-1 +细胞和STRO-1 _细胞中表面标志物C D90、CD105、C D29、S T R0-1、C D34和C D45的 表达；采用集落形成实验检测分离细胞的集落形成率；在成骨和成脂诱导分化后，分别采用茜素红染色和油红〇染色鉴定其多 向分化能力。
结果STR0-1 +细胞可高表达干细胞表面标志物C D90和C D105，而低表达造血细胞标志物C D34和C D45;并且 S T R0-1+细胞的集落形成率显著高于STR0-1 _细胞；S T R0-1+细胞具有向成骨和成脂细胞分化的潜能。
结论采用免疫磁珠法分选的S T R0-1+细胞为具有干细胞特性的人牙周膜干细胞。
[关键词]牙周膜干细胞；牙周膜；细胞分选；免疫磁珠法[中图分类号]R392.l l,R392-33, R781.4 + 2 [文献标志码]A牙周炎、牙外伤等多种因素可导致牙周组织缺 损，且目前治疗效果并不理想[1<。
以牙周膜干细 胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC)为种子细 胞的牙周组织工程为牙周组织的再生与修复提供了 新的契机[3_5]。
macrophage(CD11b beads)巨噬细胞磁珠分选说明
Index1. Description1.1 Principle of MACS® separation1.2 Background and product applications1.3 Reagent and instrument requirements2. Protocol2.1 Sample preparation2.2 Magnetic labeling of human PBMCs2.3 Magnetic labeling of mouse cells2.4 Magnetic separation3. Example of a separation using CD11b MicroBeads4. References1. DescriptionComponents 2 mL CD11b MicroBeads, mouse/human:MicroBeads conjugated to monoclonal rat anti-mouse/human CD11b (Mac-1α) antibodies(isotype: rat IgG2b; clone: M1/70.15.11.5). Size For 1×109 human total cells, up to 100separations;for 2×109 mouse total cells, up to 200separations.Product format CD11b MicroBeads are supplied as a suspensioncontaining stabilizer and 0.05% sodium azide. Storage Store protected from light at 4−8 °C. Do not freeze.The expiration date is indicated on the vial label.1.1 Principle of MACS® separationFirst the CD11b+ cells are magnetically labeled with CD11b MicroBeads. Then the cell suspension is loaded onto a MACS® Column which is placed in the magnetic field of a MACS Separator. The magnetically labeled CD11b+ cells are retained on the column. The unlabeled cells run through and this cell fraction is depleted of CD11b+ cells. After removal of the column from the magnetic field, the magnetically retained CD11b+ cells can be eluted as the positively selected cell fraction.1.2 Background and product applicationsCD11b MicroBeads are developed for separation of human and mouse cells based on expression of the CD11b antigen. In humans, CD11b is strongly expressed on myeloid cells, and weakly expressed on NK cells and some activated lymphocytes. In mouse, the CD11b antigen is expressed on monocytes/macrophages, and to a lower extent on granulocytes, NK cells, CD5+ B1 cells and a subset of dendritic cells.The CD11b (Mac-1 α; integrin αM chain) antibody reacts with the 170 kDa αM subunit of CD11b/CD18 heterodimer (Mac-1, αMß2 intergrin). It functions as a receptor for complement (C3bi), fibrinogen or clotting factor X. Examples of applications●Positive selection or depletion of human monocytes/macrophagesand granulocytes from peripheral blood or lymphoid tissue.●Positive selection or depletion of myeloid cells from human andmouse bone marrow.●Positive selection or depletion of mouse macrophages fromlymphoid tissue.1.3 Reagent and instrument requirements●Buffer (degassed): Prepare a solution containing PBS (phosphatebuffered saline) pH 7.2, 0.5% BSA (bovine serum albumin) and2 mM EDTA by diluting MACS BSA Stock Solution (# 130-091-376) in autoMACS™ Rinsing Solution (# 130-091-222). Keep buffer cold (4−8 °C).▲ Note: EDTA can be replaced by other supplements such as anticoagulant citrate dextrose formula-A (ACD-A) or citrate phosphate dextrose (CPD). BSA can be replaced by other proteins such as gelatine, mouse/human serum or fetal calf serum.Buffers or media containing Ca2+ or Mg2+ are not recommended for use.● MACS Columns and MACS Separators: Monocytes andmacrophages can be enriched (positive selection) or depleted by using MS, LS or XS Columns. For efficient depletion of myeloid cells from bone marrow, and depletion of granulocytes and NK cells we recommend using LD, CS or D Columns. Positive selection or depletion can also be performed by using the autoMACS Separator.▲Note: Column adapters are required to insert certain columns into VarioMACS™Separator or SuperMACS™ Separator. For details, see MACS Separator data sheets.●(Optional) Fluorochrome-conjugated CD11b antibody forflow-cytometric analysis, e.g. CD11b-FITC (# 130-081-201), CD11b-PE (# 130-091-240) or CD11b-APC (# 130-091-241). CD11b MicroBeads mouse/humanOrder No. 130-049-601Magnetic cell sorting140-000-059.05● (Optional) PI (propidium iodide) or 7-AAD for flow-cytometricexclusion of dead cells.● (Optional) Pre-Separation Filters (# 130-041-407) to remove cellclumps.2. Protocol2.1 Sample preparationSample preparation of human PBMCsWhen working with anticoagulated peripheral blood or buffy coat, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) should be isolated by density gradient centrifugation (see "General Protocols" in the User Manuals or visit /protocols).▲Note: Remove platelets after density gradient separation: resuspend cell pellet in buffer and centrifuge at 200×g for 10−15 minutes at 20 °C. Carefully remove supernatant. Repeat washing step and carefully remove supernatant. Sample preparation of mouse tissueWhen working with tissues, prepare a single-cell suspension by a standard preparation method (see "General Protocols" in the User Manuals or visit /protocols).▲Note: Dead cells may bind non-specifically to MACS MicroBeads. In case of high numbers of dead cells, removal of dead cells by density gradient centrifugation or the Dead Cell Removal Kit (# 130-090-101) is recommended.2.2 Magnetic labeling of human PBMCs▲ Work fast, keep cells cold, and use pre-cooled solutions. This will prevent capping of antibodies on the cell surface and non-specific cell labeling.▲ Volumes for magnetic labeling given below are for up to 107 total cells. When working with fewer than 107 cells, use the same volumes as indicated. When working with higher cell numbers, scale up all reagent volumes and total volumes accordingly (e.g. for 2×107 total cells, use twice the volume of all indicated reagent volumes and total volumes).▲ For optimal performance it is important to obtain a single- cell suspension before magnetic separation. Pass cells through 30 µm nylon mesh (Pre-Separation Filters # 130-041-407) to remove cell clumps which may clog the column.1. Determine cell number.2. Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Pipette offsupernatant completely.3. Resuspend cell pellet in 80 µL of buffer per 107 total cells.4. Add 20 µL of CD11b MicroBeads per 107 total cells.5. Mix well and incubate for 15 minutes at 4−8 °C.▲ Note: Working on ice may require increased incubation times. Higher temperatures and/or longer incubation times lead to non-specific cell labeling.6. (Optional) Add a fluorochrome conjugated antibody, e.g.add 10 µL of CD11b-FITC (# 130-081-201), and incubate for5 minutes at 4−8 °C.7. Wash cells by adding 1−2 mL of buffer per 107 cells and centrifugeat 300×g for 10 minutes. Pipette off supernatant completely.8. Resuspend up to 108 cells in 500 µL of buffer.▲ Note:For higher cell numbers, scale up buffer volume accordingly.▲ Note: For depletion with LD Columns, resuspend up to 1.25×108 cells in 500 µL of buffer.9. Proceed to magnetic separation (2.3).2.3 Magnetic labeling of mouse cells▲ Work fast, keep cells cold, and use pre-cooled solutions. This will prevent capping of antibodies on the cell surface and non-specific cell labeling.▲ Volumes for magnetic labeling given below are for up to 107 total cells. When working with fewer than 107 cells, use the same volumes as indicated. When working with higher cell numbers, scale up all reagent volumes and total volumes accordingly (e.g. for 2×107 total cells, use twice the volume of all indicated reagent volumes and total volumes).▲ For optimal performance it is important to obtain a single- cell suspension before magnetic separation. Pass cells through 30 µm nylon mesh (Pre-Separation Filters # 130-041-407) to remove cell clumps which may clog the column.1. Determine cell number.2. Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Pipette offsupernatant completely.3. Resuspend cell pellet in 90 µL of buffer per 107 total cells.4. Add 10 µL of CD11b MicroBeads per 107 total cells.5. Mix well and incubate for 15 minutes at 4−8 °C.▲ Note: Working on ice may require increased incubation times. Higher temperatures and/or longer incubation times lead to non-specific cell labeling.6. (Optional) Add a fluorochrome conjugated antibody, e.g. add10 µL of CD11b-FITC (# 130-081-201), and incubate for 5minutes at 4−8 °C.7. Wash cells by adding 1−2 mL of buffer per 107 cells and centrifugeat 300×g for 10 minutes. Pipette off supernatant completely.8. Resuspend up to 108 cells in 500 µL of buffer.▲ Note:For higher cell numbers, scale up buffer volume accordingly.▲ Note: For depletion with LD Columns, resuspend up to 1.25×108 cells in 500 µL of buffer.9.Proceed to magnetic separation (2.3).2.4 Magnetic separation▲Choose an appropriate MACS Column and MACS Separator according to the number of total cells and the number of CD11b+ cells (see table in section 1.3).Magnetic separation with MS or LS Columns1. Place column in the magnetic field of a suitable MACS Separator(see "Column data sheets").2. Prepare column by rinsing with appropriate amount of buffer:MS: 500 µL LS: 3 mL.140-000-059.053. Apply cell suspension onto the column.4. Collect unlabeled cells which pass through andwash column with appropriate amount of buffer.Perform washing steps by adding buffer three times,each time once the column reservoir is empty.MS: 3×500 µL LS: 3×3 mL.Collect total effluent. This is the unlabeled cell fraction.5. Remove column from the separator and place it on a suitablecollection tube.6. Pipette appropriate amount of buffer onto the column. Immediately flush out fraction with the magnetically labeled cells by firmly applying the plunger supplied with the column.MS: 1 mL LS: 5 mL.▲ Note: To increase the purity of the magnetically labeled fraction, it can be passedover a new, freshly prepared column.Magnetic separation with XS ColumnsFor instructions on the column assembly and the separation, refer to the "XS Column data sheet". Depletion with LD Columns 1.Place LD Column in the magnetic field of a suitable MACS Separator (see "LD Column data sheet").2. Prepare column by rinsing with 2 mL of buffer.3. Apply cell suspension onto the column .4. Collect unlabeled cells which pass through and wash columnwith 2×1 mL of buffer. Collect total effluent. This is the unlabeled cell fraction.Depletion with CS Columns 1.Assemble CS Column and place it in the magnetic field of a suitable MACS Separator (see "CS Column data sheet").2. Prepare column by filling and rinsing with 60 mL of buffer. Attach a 22G flow resistor to the 3-way-stopcock of theassembled column (see "CS Column data sheet").3. Apply cell suspension onto the column.4. Collect unlabeled cells which pass through and wash columnwith 30 mL buffer from the top. Collect total effluent. This is the unlabeled cell fraction.Depletion with D ColumnsFor instructions on column assembly and separation, refer to the "D Column data sheet".Magnetic separation with the autoMACS™ Separator▲ Refer to the "autoMACS™ User Manual" for instructions on how to use the autoMACS Separator.1.Prepare and prime autoMACS Separator.2. Place tube containing the magnetically labeled cells in theautoMACS Separator. For a standard separation, choose following separation programs: Positive selection: "Possel"Depletion: "Depletes"▲ Note: Program choice depends on the isolation strategy, the strength of magnetic labeling and the frequency of magnetically labeled cells. For details see autoMACS User Manual: "autoMACS Cell Separation Programs".3. When using the program "Possel", collect positive fraction(outlet port "pos1"). This is the purified CD11b + cell fraction.When using the program "Depletes", collect unlabeled fraction (outlet port "neg1"). This is the CD11b - cell fraction.3. Example of a separation using CD11b MicroBeadsA: Separation of human PBMCsSeparation of human PBMCs using CD11b MicroBeads. Cells arestained with CD11b-FITC (# 130-081-201). Monocytes can be identified as CD11b bright cells and NK cells as CD11b dim cells.B: Separation of CD11b + cells from a mouse spleen cellsuspensionPositive selection of CD11b + cells from a mouse spleen cell suspensionusing CD11b MicroBeads, an MS Column and a MidiMACS™ Separator.R e l a t i v e c e l l n u m b e rNegative fractionPBMCs before separation Positive fractionCD11b-FITCSpleen cells before separation140-000-059.05Forward scatterC D 11b -P EForward scatterC D 11b -P EForward scatterC D 11b -P ESpleen cells after depletion ofCD11b + cellsIsolated CD11b + cells4. References1. Ehlich, A; Martin, VM; Müller, W; Rajewsky, K (1994) Analysis of the B CellProgenitor Compartment at the Level of Single Cells. Current Biology 4: 573-583.[33]WarningsReagents contain sodium azide. Under acidic conditions sodium azide yields hydrazoicacid, which is extremely toxic. Azide compounds should be diluted with running waterbefore discarding. These precautions are recommended to avoid deposits in plumbingwhere explosive conditions may develop.WarrantyThe products sold hereunder are warranted only to be free from defects in workmanshipand material at the time of delivery to the customer. MILTENYI BIOTEC GmbH makesno warranty or representation, either expressed or implied, with respect to the fitnessof a product for a particular purpose. There are no warranties, expressed or implied,which extend beyond the technical specifications of the products. MILTENYI BIOTECGmbH’s liability is limited to either replacement of the products or refund of thepurchase price. MILTENYI BIOTEC GmbH is not liable for any property damage,personal injury or economic loss caused by the product.MACS® is a registered trademark of Miltenyi Biotec GmbH.140-000-059.05。
4种免疫磁珠分离模拟混合斑效果比较
4种免疫磁珠分离模拟混合斑效果比较张尔力;姜伯玮;赵兴春【摘要】目的建立免疫磁珠捕获精子的方法,比较4种不同抗体制备的免疫磁珠捕获模拟检材中精子的效果,探索其分离混合斑的可行性以及优缺点.方法分别用4种抗体制备免疫磁珠,对不同比例混合细胞悬液(上皮细胞与精子)中的精子和放置不同时间的纯精斑进行提取,将磁珠吸附到的细胞进行DNA-STR分型,对比4种磁珠的差异.结果4种磁珠都能特异性地将精子分离出来,分型结果与男性供者已知分型一致.经X2检验,当上皮细胞与精子的比例大于100:1或小于10:1时,P>0.05,捕获结果没有明显差异;当其比例在10:1时,P<0.05,抗PH20抗体磁珠的灵敏度高于其余三种抗体.捕获放置1天和15天精斑的成功率结果差别P>0.05,没有明显差异.捕获放置30天的精斑结果差别P<0.05,抗JLP抗体磁珠有明显优势,而抗ADAM2抗体磁珠效果最差.结论4种不同抗体制备的免疫磁珠在捕获精子的灵敏度上有差异,可以根据需要选择抗体制备免疫磁珠,有望实现对不同混合斑的分离.【期刊名称】《湖南警察学院学报》【年(卷),期】2018(030)002【总页数】5页(P124-128)【关键词】法医物证学;STR;免疫磁珠;混合斑;精子表面抗原【作者】张尔力;姜伯玮;赵兴春【作者单位】湖南警察学院,湖南长沙410138;公安部第一研究所,北京 100038;公安部物证鉴定中心,北京 100038【正文语种】中文【中图分类】D631.2法医在处理性犯罪案件精阴混合斑检材的过程中，为得到精子的分型，通常有两类方法：一类是在提取到DNA并得到混合STR图谱后，用统计学方法比对分析出可能的分型[1]；另一类是在裂解细胞提取出DNA之前将不同细胞分离开，再提取目标细胞的DNA进行分型比对。
后者目前常用的有差异裂解、激光捕获显微切割等方法[2]。
而这些方法存在一些问题，一是计算过程繁琐，二是若差异裂解处理不彻底，则会残留。
免疫磁珠分选步骤
免疫磁珠分选步骤
免疫磁珠分选步骤
准备工作
1：用pH=7.2的P-8读BS配置0.5%的BSA和2mMEDTA,用以稀释分选缓冲液（1:20）
2：准备碎冰，让所有操作均在4-8℃完成
样本制备
1：制备单细胞悬液（用30um的尼龙网过滤，避免堵塞柱子）（过滤前先用缓冲液湿化过滤器）
2：加入缓冲液清洗细胞，并离心(300g,10min)( 4-8℃)
3:加入缓冲液重选细胞单细胞悬液，
4：再次用30um的尼龙网过滤，避免堵塞柱子）（过滤前先用缓冲液湿化过滤器）
5：细胞计数
6：离心(300g,10min)( 4-8℃)后去掉上清
9：加入80ul/107个细胞的缓冲液
10：加入20ul/107个细胞的CD117
11：4-8℃混匀放置15分钟
12：加入1ml/107个细胞的缓冲液清洗细胞并离心(300g,10min，4-8℃)
13：重选细胞加入500ul/108个细胞的缓冲液
14：准备好分离柱，并用缓冲液清洗MS用500ul.
15:把细胞悬液倒入柱子中
16：用500ul的缓冲液冲洗柱子，（每次液体无残留时再加入新的液体）共三次
17：将柱子移开磁场到一合适的容器中，用1mL缓冲液稍用力冲洗，。
卵巢癌CD＋90肿瘤细胞的分离及其肿瘤干细胞生物学特性观察
卵巢癌CD＋90肿瘤细胞的分离及其肿瘤干细胞生物学特性观察梁江红;罗蕊丽;刘永珍【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2014(000)048【摘要】目的：分离人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞中的CD＋90细胞，并观察其肿瘤干细胞的生物学特性。
方法从卵巢癌患者腹水中分离原代卵巢癌细胞，采用流式细胞术检测人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞的CD133、CD90阳性率。
流式分选得到CD＋90、CD－90细胞后，采用RT-PCR法检测其干细胞及上皮间质化（EMT）相关基因mRNA相对表达，Transwell小室侵袭试验观察细胞侵袭力，克隆形成试验观察细胞增殖分化能力，悬浮成球试验观察干细胞潜能，免疫缺陷小鼠体内有限稀释成瘤试验观察成瘤时间和成瘤率。
结果人卵巢癌细胞系SKOV3的CD133和CD90阳性率均低于原代卵巢癌细胞，P均＜0．05。
在人卵巢癌细胞系SKOV3和原代卵巢癌细胞中，CD＋90细胞干细胞相关基因（CD133、OCT4）和EMT间质标志相关基因（N-cadherin、Vimentine、MMP9）相对表达、穿到膜背面的细胞数、细胞克隆数、悬浮成球数均高于CD－90细胞，EMT上皮标志相关基因E-cadherin相对表达均低于CD－90细胞，P均＜0．05。
随着接种细胞数目的增加，CD＋90、CD－90细胞的成瘤率和成瘤时间均升高，CD＋90细胞升高更明显。
结论卵巢癌细胞中，CD＋90细胞高表达间质属性基因和干细胞相关基因，具备更高的侵袭力、增殖分化能力、体内成瘤能力和干细胞潜能，CD＋90细胞分离可能成为卵巢癌干细胞分离的新方法。
%Objective To isolate and identity the CD+90 cells from SKOV3 cellline and primary ovarian cancer cells and to investigate the characteristics of cancer stem cells .Methods After successful isolation of ovarian cancer cells from ascites of patients with ovarian cancer .The flow cytometry was performed to detect the percentage of stem cell marker CD1+33 , CD+90 in SKOV3 and the primary cells .After the CD+90 and CD-90 cells were separated by means of fluorescence-based sorting, qRT-PCR was adopted to compare the difference of stem cell markers , transell assay was employed to analyze the ability of invasion , clone-formation test and sphere formation test were conducted to demonstrate the cell differentiation and proliferation capacity , limiting dilution transplantation assay was performed to check the tumorigenic ability in vivo . Results The percentage of CD+133 and CD+90 cells in SKOV3 cells were lower than those in primary cells (both P<0.05). In both SKOV3 and primary cells, the expression of CD133, CD44, ALDH1, OCT4, N-cadherin, Vimentine, MMP2, MMP9 in CD+90 cells were higher than those in CD-90 cells (allP<0.05).Compared with CD-90 cells, the invaded cell a-mount, colony formation number and suspended spheres formation increased in the CD +90 group, while the epithelial marker E-cadherin reduced , all P<0.05.The tumorigenic capacity and tumor mass escalated with the increase of implanted cell amounts and incubation time , which were more obvious in the CD+90 cells.Conclusions The CD+90 ovarian cancer cells re-presents a subpopulation characterized of enhanced mesenchymal and stem cell markers , obvious self-differentiation , marked self-renewal ability andevident in-vivo tumorigenic capacity .Therefore, CD+90 phenotype could be used as a marker to isolate ovarian cancer stem-like cells.【总页数】4页(P5-8)【作者】梁江红;罗蕊丽;刘永珍【作者单位】湖北医药学院附属太和医院，湖北十堰442000;湖北医药学院附属太和医院，湖北十堰442000;湖北医药学院附属太和医院，湖北十堰442000【正文语种】中文【中图分类】R737.31【相关文献】1.卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定 [J], 俞晓毓;吴迪;王净;李菲;白绪乐;赵枫姝;窦骏2.卵巢癌CD90+肿瘤干细胞的生物学特性 [J], 刘智慧;向志辉3.卵巢癌CD90＋肿瘤干细胞的生物学特性 [J], 刘智慧;向志辉;4.卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定 [J], 俞晓毓;吴迪;王净;李菲;白绪乐;赵枫姝;窦骏;;;;;;;;;5.人上皮性卵巢癌细胞系侧群细胞的肿瘤干细胞样细胞生物学特性及膜蛋白差异表达的鉴定 [J], 尹婕;潘凌亚;温仪萍;黄虹;曾靖;李晓莹;韩甜甜;金滢;李艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CD90磁珠分选protocol
1.吸去培养基，PBS吹洗一遍
2.加入1-2ml胰酶，消化5-10分钟后加入2ml培养液中和后吸至15ml离心管
3.300g，5min，弃上清
4.加入500μl MACS buffer,重悬后离心，300g，10min，弃上清
5.加入500μl MACS buffer,重悬，吸取20μl计数，其余的悬液300g，10min
离心后弃上清，每107细胞加入20μl beads，80μl MACS buffer，混匀
6.计数选择对角线的四个方格，总数除以4乘以2，单位为104个
7.放入冰箱（2-8℃）15min，每隔5min震荡混匀一次
8.加入500μl MACS buffer，过磁柱，加入500μl buffer 于15ml离心管内洗2
遍
9.15ml离心管里的为CD90-OF（总体积1.5ml），留在磁柱上的为CD90+细胞，
加入1ml buffer冲洗至15ml离心管。
10.每管悬液离心后弃上清，加入4ml 培养液后，铺至2个10cm培养皿；。