氨基酸发酵的氮源选择

三、工程菌的培养
质粒稳定性
在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个 极为重要而独特的问题。带有质粒的细胞生长较慢， 生长速率与所带质粒的大小成反比。此外，高水平克 隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表 达越高，生长越慢）。由于质粒的不稳定性，在繁殖 传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒， 导致所需产物的产量下降
一、工程菌的来源
质粒
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单 位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染 色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。质粒上常 有抗生素的抗性基因
一、工程菌的来源
构建步骤
目的基因的获得 载体的选择与制备 目的基因与载体连接成重组体 转化或转染受体细胞 重组菌的筛选及目的基因的表达
三、工程菌的培养
表达效率及质粒拷贝数控制
在基因工程细胞培养工程中，表达效率与质粒拷贝数有 关。在质粒稳定基础上，尽可能提高细胞内质粒拷贝数
在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采 用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长 速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加， 目的基因产量提高
一、工程菌的来源
基因工程
基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用 供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或 离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组 DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞 或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类 事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状
在基因工程细胞培养工程中，需根据其固有特点和具体 情况，采取相应措施、提高质粒稳定性，增加质粒拷贝 数，实现培养条件优化，提高表达效率
三、工程菌的培养
高密度发酵
大肠杆菌对糖类的转运能力很强， 由于大肠杆菌的氧化磷酸化和TCA 循环的能力有限，造成碳代谢流 在糖酵解途径中过量，大肠杆菌 主要通过分泌部分氧化的副产物 使碳代谢流得到平衡，而乙酸就 是其中的主要副产物
工程菌发酵生产氨基酸的氮源选择 与过程调控
陈宁 天津科技大学 代谢控制发酵技术国家工程实验室
基因工程菌的发酵
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工程菌的来源
2
工程菌的应用
3
工程菌的培养
4Fra Baidu bibliotek
氨基酸发酵的氮源选择
一、工程菌的来源
基因工程
基因工程（genetic engineering）是指在基因 水平上，采用与工程设计十分类似的方法， 根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切 割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产 生出人们所期望的产物，或创造出具有新的 遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传 给后代
如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的克隆菌生长快， 则重组质粒的丢失就不会导致非常严重的后果。因此调整这两种菌 的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但这点往往难以达到， 因为大多数环境条件同时提高或降低这两种菌的比生长速率
在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，来 提高重组质粒的稳定性。如在重组质粒中克隆入抗高浓度抑制的某 个基因，这样在进行高浓度底物培养时，受体菌被抑制，比生长速 率下降，而重组菌仍能正常生长
分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失 分配到子细胞中而导致整个质粒丢失
结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入 或重排引起的质粒结构变化
三、工程菌的培养
质粒稳定性
使质粒稳定的措施
组建合适载体 选择适当宿主 施加选择压力 抗生素添加法 抗生素依赖变异法 营养缺陷型法 控制基因过量表达 控制培养条件（温度、pH、DO）
三、工程菌的培养
控制培养条件
培养基组成：不同的培养基能影响微生物的代 谢活动，也能影响质粒的稳定性。质粒在丰富 培养基中比在最低限量培养基中更加不稳定
培养温度：含有重组质粒的克隆菌的比生长速 率往往比受体菌要小，同样质粒导入受体菌后 会使受体菌的生长温度改变。通常而言，低温 有利于重组质粒稳定地遗传
基因工程细胞工业化培养中，产物的产率往往比实验 室培养规模为低。其原因主要与基因工程细胞特点有 关，首先基因工程细胞的生长速率及表达率与其所载 外源DNA的稳定性及产物分泌过程有关，其中重组DNA 的稳定性尤为重要
基因工程细胞培养过程，重组DNA的丢失方式亦有两 种，其一是细胞培养过程，由于回复突变或分配作用 致使DNA丢失，称为脱落性不稳定，其二是重组DNA中 编码的结构基因在宿主内发生再重组过程产生突变， 不再表达目的产物，称为结构性不稳定
阻断乙酸的主要产生途径； 限 制 糖 酵 解 途 径 上 的 碳 代 谢 流 ； 将 过 量 的 碳 代 谢 流 转 化 为 其 它 低毒的副产物；
一、工程菌的来源
构建步骤
二、工程菌的应用
苏氨酸基因工程菌构建策略
三、工程菌的培养
就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标 产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。 但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表 现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工 程菌的培养有着自身所特有的特点
三、工程菌的培养
培养特点
除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技 术、基因的突变技术、基因的导入技术等
一、工程菌的来源
表达载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中 的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置 换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿 主细胞，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒
外源基因插入载体中，使其处于一系列的表 达信号的控制之下。这样基因可以转录和表 达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以 用来生产重组蛋白，被称为表达载体
三、工程菌的培养
控制培养条件
溶氧：携带质粒的基因工程菌相对于野生菌增 加了额外的代谢负担，对氧需求量较大，发酵 液中必须有足够浓度的溶解氧，才能满足菌体 生长及产物合成的需要
过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，菌体 生长受到抑制，质粒稳定性差
三、工程菌的培养
控制培养条件
菌体比生长速率：比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一 致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。有时，比生长速率大有 利于重组质粒稳定地遗传