细胞培养基本技术
细胞培养无菌操作基本技术
细胞培养无菌操作基本技术细胞培养是现代生物学研究中常用的一种实验技术，能够使细胞在体外条件下生长和繁殖。
无菌操作是细胞培养过程中非常重要的一项技术手段，可以保证细胞培养环境的无菌纯净，避免细胞被外部微生物污染。
本文将介绍细胞培养中常用的无菌操作基本技术，并结合实例进行详细说明。
无菌操作基本技术主要包括以下几个方面：1.实验前准备在进行无菌操作前，首先需要准备好实验所需的培养基、培养器具和其他实验工具。
这些器具和工具需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌。
此外，实验人员还需佩戴无菌手套、穿戴无菌实验服，并对实验台面进行彻底的清洁消毒，保持实验环境的无菌。
2.灭菌操作在进行无菌操作前，需要对培养器具进行灭菌处理。
常用的灭菌方法有干热灭菌和湿热灭菌两种。
干热灭菌是将培养器具置于高温烘箱中，持续加热若干小时，以达到灭菌目的。
湿热灭菌则是将培养器具置于高压高温的蒸汽中，进行高压灭菌。
此外，对于一些无法耐受高温高压的培养器具，还可使用化学灭菌方法，如使用过氧化氢和酒精进行消毒。
3.无菌操作技术在进行无菌操作时，需要遵循一定的操作规范。
首先，实验人员应将实验器具放入无菌工作台中，在UV灯的照射下进行灭菌处理。
然后，实验人员需要将自己的双手放入无菌手套中，并使用无菌皮培养工具进行操作。
接下来，需要准备好含有培养基的培养皿，并用无菌注射器将细胞转移到培养皿中。
在操作过程中，需要注意避免造成培养基的污染，尽量减少对培养基的接触时间，以防止细菌或其他微生物的污染。
4.维持无菌操作环境在进行细胞培养过程中，需要维持无菌操作环境。
实验人员应避免在实验台面上散落细胞培养基、细胞碎片或其他可能造成污染的物质。
细胞培养箱和无菌安全柜的门不可长时间打开，以防止空气中的微生物进入工作区域。
并且需要定期对无菌安全柜和细胞培养箱进行清洁和消毒。
同时，实验室人员需要经常进行手部清洁，并定期更换无菌手套和实验服，保持实验环境的无菌。
细胞培养中的无菌操作是进行细胞培养实验的基础，能够产生可靠的实验数据，并在细胞学研究中发挥重要作用。
细胞培养技术的应用与发展
细胞培养技术的应用与发展细胞培养技术已经成为了现代生命科学研究的重要工具之一，随着技术的不断发展与创新，其在医学、工业、农业等领域中的应用越来越广泛。
本文将从细胞培养技术的基本原理、应用及未来发展趋势等方面进行论述。
一、细胞培养技术的基本原理细胞培养技术是指通过体外培养的方式，使细胞在相对理想的营养、温度、氧气、二氧化碳、水分等条件下生长、繁殖和分化，并保持其生物学的特性。
具体而言，细胞培养技术包括以下几个方面。
1. 细胞的来源细胞培养的第一步是选择合适的细胞来源，包括原代细胞、细胞系和细胞株。
其中原代细胞是从组织或器官中分离出的未经连续培养的细胞；细胞系是一组经连续次传代和分离的细胞，具有特定的生物学特性；细胞株则是从细胞系中特定的细胞分离而来，保留了一定程度的细胞特性。
2. 细胞的培养条件对于不同的细胞类型，其生长繁殖的最适温度、培养基成分、营养物质、生长因子等条件也不尽相同。
因此，在细胞培养过程中，需要根据具体的需求设计出最适合细胞生长的培养条件，保证其能够正常生长繁殖，并保持特定的生物学特性。
3. 细胞的分离和传代在细胞培养中，细胞的分离和传代也是非常重要的环节。
细胞分离的目的是把细胞从组织或器官中分离出来，单独培养；而细胞的传代则是指将已经培养的细胞分割成两个或多个部分，继续培养，保持其生长繁殖的能力。
二、细胞培养技术的应用1. 医学领域细胞培养技术在医学领域中的应用广泛，例如用于研究人类生理、病理以及药物毒性等方面。
此外，细胞培养技术还可以用于制备干细胞和肿瘤细胞等细胞种，以供疾病治疗或药物研发之用。
在肿瘤治疗方面，细胞培养技术可以用于研究肿瘤细胞的特性以及药物对肿瘤细胞的作用机制，为临床治疗提供参考。
2. 工业领域在工业领域中，细胞培养技术也被广泛应用于生物制品的生产过程中。
例如，在生物药品的制备过程中，细胞培养技术可以用来制造细胞培养物，这是制备生物制品的重要步骤。
3. 农业领域在农业领域中，细胞培养技术可以被用作繁殖和改良农业作物。
细胞培养技术
三、培养细胞技术
（二）细胞来源 （2） 消化培养法 与组织块培养法区别： A. 用酶制剂处理组织块，除去细胞间
质，使细胞分离，形成细胞悬液； B. 细胞生长方式多为单层。
优点：更易摄取营养、排除代谢产物生长 较快。
缺点：操作繁杂，易污染；消化可能对细 胞有损伤。
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三、培养细胞技术
（二）细胞来源 2. 细胞系（cell line） 原代培养物开始第一次传代培养后的细
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白
和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些
带正电荷的糖蛋白的Байду номын сангаас贴壁因子先吸附于底物
上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功 能基团）
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潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。
单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
克隆抗体。
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细胞培养目的和作用
基础研究 (1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生 机理。
2、生物制药 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗
等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的
过滤）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品
（1）培养瓶（25 、75 cm3）
6孔）
培养板（96、48、24、12、
培养皿（各种直径规格）
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二、培养细胞相关条件
（二）培养用品 （2）离心管（15、50 ml） （3）移液管、吸管 （4）冻存管、EP管 （5）试剂瓶等。
细胞培养技术
细胞培养技术
细胞培养技术，是生物学研究中非常重要的一个实验技术。
通过细
胞培养技术，研究人员可以将细胞在体外进行培养、繁殖和实验操作，从而深入研究细胞的生理功能、生化特性和病理变化。
细胞培养技术
的应用范围非常广泛，涉及生物医学、药物研发、基因工程、毒理学
等多个领域。
一、细胞培养技术的基本原理
细胞培养技术是基于细胞的自身生存条件进行设计的。
细胞在体外
培养时，需要提供适当的生长环境，包括营养物质、生长因子、温度、湿度等条件。
在细胞培养中，通常会使用培养基来提供细胞所需的养
分和环境，培养基的种类和配方会根据不同的细胞类型和实验目的进
行选择。
二、细胞培养技术的应用领域
细胞培养技术在生物医学领域有着重要的应用，可以用于研究细胞
生长、细胞信号传导、细胞凋亡等生理过程，也可以用于筛选药物、
评估药效及毒性。
此外，在基因工程和生物技术领域，细胞培养技术
也扮演着关键角色，如基因转染、蛋白表达等方面均需要借助细胞培
养技术。
三、细胞培养技术的挑战和发展
随着科学技术的不断进步，细胞培养技术也在不断发展。
但是，细
胞培养中仍然存在一些挑战，如细胞的纯化、传代过程中的遗传变异
等问题，这些都对研究结果的准确性提出了挑战。
未来，细胞培养技术将继续向着更高效、更精准的方向发展，为生物学研究提供更多可能。
细胞培养技术作为生物学研究中不可或缺的一部分，其重要性不言而喻。
通过不断地探索和创新，相信细胞培养技术将会在更多领域展现出其巨大的应用潜力，为人类的健康和生活质量带来更多的改变和进步。
细胞培养基本知识基本技术
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。
这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。
以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。
一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。
2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。
其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。
3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。
4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。
1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。
2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。
3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。
5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。
6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。
7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。
传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。
总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
第四章 动物细胞培养的基本技术和方法
境
二、细胞传代方法
1.贴壁细胞的消化法传代：
（1）吸弃或者倒掉瓶内陈旧的培养液
（2）于培养瓶内加入适量消化液 （3）消化2-5min，在显微镜下观察细胞状态，发现细胞质回缩，细胞间隙 增大后，应即刻停止消化 （4）吸除或者倒掉消化液 （5）吸管吸取新鲜培养液，按照顺序吹打瓶壁细胞，注意动作要轻柔 （6）计数后，按要求的接种量接种在新的培养基内
结果分析：
（1）作图法 （2）公式法
三、细胞培养的污染检测及排除
培养细胞的污染包括：微生物、化学物质、细胞交叉
1.微生物污染
污染途径：空气、器材、操作、血清、组织样本 污染对细胞的影响：抑制细胞生长，产生有毒物质，促使细胞死亡 微生物污染的检测与排除： （1）真菌污染 培养液中有白色或者浅黄色的漂浮物，细胞间有丝状菌丝体，可以采用霉菌素或者酮康唑对细 胞进行处理 （2）细菌污染 培养液短期颜色变黄、变浑浊，使用5-10倍抗生素剂量冲击法 （3）支原体感染 相差显微镜检测；荧光染色法；电镜检查；DNA分子杂交检查
2.悬浮细胞的传代方法：
（1）直接传代法 （2）离心传代法
三、细胞系的维持
细胞系的维持是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存实现的 注意事项： （1）做好细胞系的档案记录工作
（2）遵从细胞生长规律
（3）防止细胞间的交叉污冻存、复苏和运输技术
一、细胞的冻存
第四节 动物细胞传代培养技术
一、原代培养的首次传代
传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程 首次传代注意事项： （1）待细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面后再传代 （2）传代时候不同细胞需要消化的时间不同，要根据需要具体观察，
及时进行处理
（3）首次传代时，细胞接数量要多一些，促使细胞尽快适应生长环
细胞培养基本技术PPT课件
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
细胞培养的基本原理和技术
细胞培养的基本原理和技术细胞培养是现代生物学研究中的重要技术之一，它可以为疾病的发现、药物的研发、细胞相互作用的探究等提供技术支持，因此在生命科学领域中有着广泛的应用。
在本文中，我们将会从细胞培养的基本原理及技术进行探讨，包括细胞培养的种类、基本原理、培养环境和培养技术。
1.细胞培养的种类细胞培养可以分为体外细胞培养和体内细胞培养两种。
体外细胞培养是指将细胞置于培养液中并在特定的温度、湿度、氧气浓度、pH值等条件下；通过培养皿、培养器等实验设备进行体外培养；而体内细胞培养则是将生物体内的细胞移植到另一个生物体内进行培养。
因为体内细胞培养的操作过于复杂，因此体外细胞培养被广泛应用于现代生物科学研究中。
2.细胞培养的基本原理细胞培养的基本原理可以归纳为两个方面，生理学基础和实验室技术。
生理学基础主要是指细胞是生命体系中的基本单位，对于其生理生化反应机制的深入理解可以为培养细胞提供一些基本的理论指导，具体可以理解为，细胞培养需要提供适合其生长发育的生长基质、培养液、气氛、营养等元素，同时理解细胞的生理学功能、生物化学反应机制有助于提供培养条件的优化。
而实验室技术则包括无菌操作、培养器具、培养液的制备等方面，是保证细胞培养成功的关键。
3.培养环境的设定细胞培养所需要的培养环境包括适合细胞生长的生长基质、培养液、气氛等因素，其中生长基质是细胞生长发育的基本支持物，可以理解为支架。
常见的生长基质有培养皿、网状物、凝胶等，它们都是在实验基础的条件下，为细胞提供生长空间和黏着面的特种物质。
培养液是细胞生长发育所需要的保证，它包括必需的氨基酸、营养素、菌落刺激因子等，在细胞培养中，常常需要通过修改培养液的成分达到生长优化的目的。
而氧气浓度、pH值等则是影响细胞生长和分化的关键因素，理解它们的含义并合理控制可以为培养细胞提供更优质的环境。
4.细胞培养的技术细胞培养技术可以分为无菌操作、细胞接种、细胞增殖、颜色检测、活体显微镜检测等步骤。
《细胞培养技术》课件
contents
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本原理 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养技术的应用实例 • 细胞培养技术的发展前景与挑战
01
细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指在体外模拟体 内环境，用于培养细胞的技术。
该技术通过提供适宜的营养、气 体和生长因子等条件，使细胞在
目前细胞培养技术面临的挑战
细胞来源
目前细胞培养的细胞来源有限，主要来源于肿瘤细胞和胚 胎干细胞，需要寻找更为安全、可靠的细胞来源。
培养环境
细胞在体外培养过程中需要模拟体内的生理环境，如温度 、湿度、pH值等，如何维持这些环境参数的稳定是当前 面临的重要挑战。
免疫排斥
在组织工程和器官移植等领域，免疫排斥反应是影响治疗 效果的重要因素之一，如何降低免疫排斥反应也是当前研 究的重点。
将细胞从旧的培养液中分 离出来，并接种到新的培 养液中。
细胞冻存
将细胞保存于低温或冷冻 状态，以便长期保存或未 来使用。
细胞培养中的注意事项
严格无菌操作
避免微生物污染，保证细胞的 健康生长。
适宜的细胞密度
确保细胞获得足够的营养和空 间，促进其生长和分裂。
定期更换培养液
清除代谢废物，提供新鲜的营 养物质。
01
02
03
04
生物医学研究
用于研究细胞的生长、发育、 分化、凋亡等过程，以及探索 疾病的发生机制和治疗方法。
药物研发
用于筛选和验证药物的有效性 和安全性，以及研究药物的细
胞作用机制。
再生医学
用于组织工程和干细胞治疗等 领域，为损伤修复和疾病治疗
提供新的手段。
植物细胞工程的基本技术用
植物细胞工程的基本技术导言植物细胞工程是一门综合性的学科，涵盖了分子生物学、遗传学、植物学等多个学科的知识。
通过利用细胞培养和遗传改造等技术手段，植物细胞工程可以对植物进行基因的转移和表达，从而实现对植物的遗传改良、功能改造等目的。
本文将介绍植物细胞工程的一些基本技术和方法。
细胞培养技术细胞培养是植物细胞工程的基础技术之一，它通过将植物细胞分离并在含有必需营养物质的培养基中进行体外培养，从而实现植物细胞的繁殖和生长。
常用的细胞培养技术包括悬浮培养、固体培养和液体培养等。
悬浮培养悬浮培养是将植物细胞悬浮在液体培养基中进行培养。
悬浮培养的优点是培养过程方便观察和操作，适用于大量细胞的培养。
常用的悬浮培养方法有摇床培养和气液界面培养等。
固体培养固体培养是将植物细胞培养在含有琼脂或凝胶的固体培养基上。
固体培养具有较好的支撑性，适用于较复杂的植物细胞培养。
常见的固体培养技术包括平板培养和圆盘培养等。
液体培养液体培养是将植物细胞培养在液体培养基中进行培养。
液体培养对培养基的配制和培养过程的操作要求较高，但可以更好地控制培养过程中的环境因素。
常见的液体培养技术包括摇瓶培养、泡沫培养和旋转培养等。
遗传改造技术遗传改造是植物细胞工程的核心技术之一，它通过转移外源基因到植物细胞中，实现对植物的遗传改良和功能改造。
常用的遗传改造技术包括基因转化和基因表达等。
基因转化基因转化是将外源基因导入植物细胞中的过程。
常见的基因转化方法有农杆菌介导的转化、基因枪法和电穿孔法等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的基因转化方法之一，它利用农杆菌将外源基因导入植物细胞中，通过农杆菌与植物细胞之间的共生关系，实现基因的稳定转化和表达。
基因表达基因表达是将导入植物细胞的外源基因在植物细胞中进行转录和翻译，从而实现蛋白质的表达。
常见的基因表达方法包括启动子的选择和转录因子的调控等。
通过合理选择启动子和转录因子，可以实现外源基因在植物细胞中的高效表达。
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Cell Culture
细胞培养基本技术
第四章 细胞培养的基本技术
4.1 基本操作技术和要求
细胞培养基本技术
2
培养室内的无菌操作
培养前准备
制订试验计划和操作程序 准备各种器材物品
培养室和超净台的消毒
0.2%新洁尔灭托洗地面 紫外灯照射30-60分钟 以75%乙醇擦拭无菌操作台面
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8
细胞培养基本技术
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无菌操作中常犯的错误
吸管、剪刀等碰到其他器皿
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无菌操作中常犯的错误
正确的拿管姿势
错误的拿管姿势
拿吸管时手碰到无菌区！
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无菌操作中常犯的错误
培养基浸湿吸管底部的棉花
组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、 骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。
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培养要点
材料新鲜 严格无菌操作 剔除脂肪等附着组织 组织块剪小（直径﹤1mm） 摆放开（间距﹥5mm）
消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化 间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代 细胞。
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55 20--60min
切成1--2mm3小块
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传代时不同的细胞有不同的消化时间，因 而要根据需要注意观察及时处理。
首次传代时细胞接种数量要多一些，使细 胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增 殖。
细胞培养基本技术
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两个概念
原代培养
直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次 的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的 细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。
传代培养
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞 消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称 为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转 化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。
格×稀释倍数 ×104
细胞培养基本技术
15
原理：
（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计 数。
（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方 形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使 用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即 为每ml中之细胞数目。
38
4.3 传代培养和细胞系的维持
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63
传代细胞培养
细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作 叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培 养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。
细胞培养基本技术
40
63
首次传代注意事项
细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分 表面以前（80%），不要急于传代。
34
细胞培养基本技术
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培养要点
36合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%） 合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜
色略白为止（通常为37℃，20-40分钟）
细胞培养基本技术
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常犯的错误
水浴锅未预热
细胞培养基本技术
组织块太大
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常犯的错误
胰蛋白酶消化不足或过度
细胞培养基本技术
吹打用力过重
细胞培养基本技术
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常犯的错误
操作中不换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多
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消化培养法
消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。 它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成 的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤 维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢 物
（3）存活测试之步骤为dye exclusion（染料排除），利用染料会渗入死细 胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般 使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红 色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞 数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分 活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含 血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
细胞培养基本技术
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培养室内的无菌操作
洗手和着装
彻底洗手 以75%乙醇消毒手和前臂 可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。
无菌培养操作
一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰 触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容 器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖 并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖 盖口朝上放置桌面。
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培养细胞的取材
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可 以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织 ）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组 织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容 易培养。
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组织块培养法
新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织 切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游 离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。
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4.2 原代培养
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细胞和组织培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为 培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿 底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基 。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞 计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入 培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立 即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。