Western-blot转膜整个过程
Western blot操作步骤及技巧
Western blot操作步骤及技巧实验器材：电泳及转膜设备、PVDF膜（0.2μM）实验试剂：SDS凝胶配制试剂盒（碧云天）、SDS电泳缓冲液、转膜液（分干转及湿转）、蛋白Loading buffer、预染蛋白Marker、甲醇、PBST/TBST、脱脂奶粉、一抗抗体、二抗抗体、碱性磷酸酶显影液或ECL化学发光显影液、BSA、PMSF、细胞蛋白裂解液实验步骤：一、配胶（具体浓度选择根据所需检测蛋白分子量大小而定，常用10%）1.将玻璃板洗净、用ddH2O冲洗、晾干；2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（AP及TEMED使用前加入），避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡；3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，可以使用ddH2O或者异丙醇封胶，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用ddH2O冲洗干净;4.灌好浓缩胶插入梳子，待胶凝固拔除梳子。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
二、样品处理1.悬浮细胞：a) 1.5 ml EP管或离心管收集细胞，2000rpm、3min去培养液后用温的PBS洗1遍；b)离心尽量去除PBS，加入适量细胞裂解液（裂解液使用前按100-200：1加入PMSF），冰上裂解30min,期间不间断振荡EP管，使细胞裂解充分；c)4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；2.贴壁细胞：a)去培养液后用温的PBS冲洗1遍，尽量去除残留PBS；b)加入适量的冰预冷的裂解液（6孔板细胞密度在80%左右，每孔加100-200μl裂解液,浓度在2-4μg/μl左右）后置于冰上30min，期间不断震荡培养板，使裂解充分；c)收集细胞裂解液在EP管后4℃，12000rpm离心10min，取上清定量；3.组织：a)匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
操作篇：westernblot之转膜
操作篇：westernblot之转膜转膜篇1. 转一张膜需准备 6 张 7.0～8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3～8.6 cm 的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。
要领：（1）用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水；（2）个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok 了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
要领：（1）「用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡」，要领：一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
（2）「在上面垫一张海绵垫」要领：可三张纸先叠在一起在垫于垫子上。
个人感觉就垫 1 张滤纸也没问题。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。
在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
要领：（1）「要在两个边上轻轻的反复撬」要领：应该边撬边用流水缓缓冲洗（2）「直到撬去玻板」要领：撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲（3）转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
（4）最后做成的「三明治」千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教。
Western Blot 操作流程
Western 操作流程1.SDS-PAGE电泳，事先调整好蛋白质样品的浓度，保持一致。
2.转膜（电泳结束前20分钟开始准备，而垫片和滤纸至少1小时前浸泡于含SDS的转移缓冲液中）。
（1）. 剪适当大小的PVDF膜，正常大小：5.5cm*8cm。
?（2）. 甲醇10mL浸泡膜5min，然后按1：4体积比向浸泡膜的容器中加水40mL至甲醇终浓度为20％(慢加快摇) 计时2 MIN。
（3）. 将膜转入无SDS转移缓冲液中（至少浸泡15分钟），慢摇。
（4）. 同时将电泳好的胶转移至无SDS的转移缓冲液中，慢摇10min。
（5）. 按湿转芯，黑面-垫片-滤纸-胶-膜-滤纸-垫片-白面的顺序放好，并且每层都要用玻璃棒赶走气泡，装槽时要黑对黑，白对白，加入含SDS转移缓冲液。
（7）. 湿转100V 1h-1.5h，转移槽中放入冰盒，冰水混合物上进行或者磁力搅拌器搅拌4度层析柜进行。
3. 封闭。
转膜结束后，将膜与胶接触的面为正面朝上， TTBS 缓冲液中浸泡片刻或者直接转移至封闭液中（5%脱脂牛奶），封闭1-2h1.5H。
4.一抗孵育。
封闭结束后，将膜在TTBS缓冲液中洗2次，每次2分钟，将膜转移至一抗孵育盒（5% 牛奶+ 一抗）中，4°C过夜孵育或者室温孵育3h。
注意：4°C过夜孵育的一抗可收集起来放于4°C，一周之内应该没问题，但是在重复使用这些一抗时，还得再加入比原来比例低的一抗，例如，原来按1：5000加的一抗，那么这次可在回收的一抗中按1：10000加。
5. 膜在TTBS缓冲液洗3次，每次6min1.二抗孵育。
将膜转移至二抗孵育盒中（5%牛奶+二抗），1-2h1.5H。
7. TTBS洗膜三次，每次6min.8.ECL Plus检测液检测：（Western Blot 超敏发光液A和B按1：1比例混匀）注意：Western Blot 超敏发光液 4°C避光保存。
使用前需恢复至室温，所以要提前从冰箱中取出。
Westernblot实验操作详细步骤
Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。
b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。
c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。
b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。
b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。
4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。
b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。
c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。
5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。
b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。
d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。
6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。
b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。
7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。
b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。
c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。
8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。
b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。
9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。
b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。
10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。
b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。
11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。
b.按照探针供应商的说明进行操作。
WesternBlot流程
1.配胶和上样电泳2. 转膜（半干转，整个操作中戴手套，不要用手触膜）①在电泳过程中，剪好与分离胶等大的滤纸4张和PVDF膜1张？（国产电泳仪分离胶大小约为8cm×6cm，电泳仪约为8cm×5cm，12孔大板约为9cm×6cm）；配transfer buffer (20 ml 5×transfer buffer，20ml甲醇，加水至100ml)；先在容器中加入20 ml甲醇，放入PVDF膜（切角或用铅笔标记marker位置），浸透后再加入20 ml 5×transfer buffer，加水60ml；然后将PVDF膜和滤纸每四张一起叠放整齐并在transfer buffer中浸透（保证四层中间无气泡）。
②打开电转仪，碳板要擦洗干净，可减低背景。
在准备转膜的部位倒少量transfer buffer，把浸透的四张滤纸从中间慢慢覆盖到碳板上，并用少量transfer buffer湿润。
电泳结束后，小心地将两块玻璃板分开，注意不能使胶有破损或变形，在胶的中间部分倒少量transfer buffer，将PVDF膜从中间慢慢覆盖到胶上（这样不容易产生气泡）。
然后将边缘多余的胶（包括积层胶）切去，在预先放好的四张滤纸上再倒少量transfer buffer，然后膜在下、胶在上，放置在四张滤纸上。
然后再在胶上倒少量transfer buffer，将另四张浸透的滤纸慢慢地从中间覆盖到胶上（滤纸、胶和膜的放置顺序？），如同时转两张膜，则可在第一块胶上铺八张滤纸，后再加第二块膜、胶和四张滤纸，操作同上。
盖上转膜仪盖子，设置时间等，开始转膜，200mA、55min。
为使膜与胶之间接触更为紧密，可在转膜仪上的相应位置压上重物。
3. 丽春红染色：转膜结束后，取出 PVDF膜，用铅笔在正面做好标记，用甲醇浸泡后待甲醇挥发干、用水洗一下，丽春红染色5min以确认蛋白是否有效地从胶转移到了膜上（丽春红可以与膜上的所有蛋白结合、但不会干扰特异蛋白随后与抗体的反应，而氨基黑与蛋白的结合则不可逆。
western-blot实验操作步骤
western-blot实验操作步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。
可按照以下步骤操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。
然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶（分离胶及浓缩胶）可以参考一些文献资料进行配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制， 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
(3) 上样与电泳（1）冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。
（2）电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。
（3）为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
3. 转膜(Transfer)（1）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。
硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
WesternBlot操作流程
Western Blot操作流程本人将自己做 WB实验时的具体操作流程，做了详细的记录并整理。
因为每个实验室的条件不一样，所以本流程仅供参考，具体适合自己的实验操作需要大家摸索。
由于知识量有限，有些描述用词并不专业，请大家谅解。
一、流程图制胶→→电泳跑胶 (1.5-2.5h)→→转膜（3h）→→（可使用立春红检测是否蛋白是否成功转移）TBST 清洗（ 10min）→→封闭（ 2h）→→ TBST 清洗（ 10min）→→附Ⅰ抗（内参：小鼠抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱 4 度过夜）→→ TBST 清洗三次（ 10min/ 次）→→附Ⅱ抗（内参：山羊抗小鼠，轻摇1.5h）→→ TBST清洗三次（ 10min/ 次）→→显影二、物料及配制1、电泳液：一包电泳粉+1000ml双蒸水（可回收使用）2、10%过硫酸铵： 1g 过硫酸铵 +10ml 双蒸水3、转膜液：一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收使用）4、TBST溶液：50ml 20*TBS+950ml双蒸水 +1ml 吐温 20。
（无需回收）5、封闭液：购买6、Ⅰ抗（内参）：将小鼠抗β-Actin：Ⅰ稀释液按1:500稀释待用， 4 度保存。
Ⅰ抗（目的蛋白 58kDa）：将 smad2：Ⅰ稀释液按1:1000稀释待用， 4 度保存。
7、Ⅱ抗（内参）：将山羊抗小鼠：Ⅱ抗稀释液按1:5000稀释代用， 4 度保存。
Ⅱ抗（目的蛋白58kDa）：将山羊抗兔：Ⅱ抗稀释液按1:5000 稀释待用， 4 度保存。
7、显影液：按说明书配制，避光可长期回收使用8、定影液：按说明书配制，可长期回收使用9、发光液：超敏发光液 A 液： B 液=1:1三、步骤（一）制胶1、Tris-甘氨酸 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液的配制溶液成分成分体积（共约10ml ）双蒸水4ml30%丙烯酰胺溶液 3.3ml1.5mol/L Tris （ pH8.8）2.5ml10%SDS0.1ml10%过硫酸氨0.1mlTEMED0.004ml2、Tris-甘氨酸 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 5%积层胶所用溶液溶液成分成分体积（共约5ml）双蒸水 3.4ml30%丙烯酰胺溶液0.83ml1.5mol/L Tris （ pH6.8）0.63ml10%SDS0.05ml10%过硫酸氨0.05mlTEMED0.005ml3、1）将规格 1.0mm 或其它规格的玻璃板固定好。
Western Blotting操作步骤及说明
Western Blot操作方法及步骤1).蛋白质提取Extraction buffer组成:蔗糖0.7 MTris/HCl0.5 MEDTA 50 mMKCl0.1 M配制成母液pH 9.4巯基乙醇2%蛋白酶抑制剂25×取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中），加入500 µl 提取缓冲液，涡旋；完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋；在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液；向两只EP管中各加入1 ml 0.1M NH4Ac（用甲醇溶解配制）；在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；用0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；取上清后空甩EP管，去除多余的溶液；室温干燥蛋白, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。
2). 测定总蛋白浓度。
用BCA蛋白检测试剂盒测定提取物中的蛋白质含量(1)蛋白浓度测定1、考马斯亮蓝G250通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非共价键连接的复合物。
蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子，从而产生在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色①测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度BSA原液浓度：5mg/ml②待测样品稀释用Nanophotometer（纳米光度计）初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间内。
③加样准备测定标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中，加入BCA工作液200μl。
wb转膜条件公式
wb转膜条件公式
【最新版】
目录
1.WB 转膜的概述
2.WB 转膜的公式
3.WB 转膜的步骤
4.WB 转膜的注意事项
正文
一、WB 转膜的概述
WB（Western Blot）转膜是一种将电泳分离后的蛋白质转移至膜上的技术，以便进行进一步的检测和分析。
WB 转膜是蛋白质研究中常用的技术手段，可以帮助研究者了解蛋白质的表达情况、翻译后修饰等信息。
二、WB 转膜的公式
WB 转膜的公式通常表示为：
转膜效率 = (膜上蛋白质量 / 电泳分离蛋白质量) × 100%
三、WB 转膜的步骤
1.制备电泳分离样品：首先需要制备蛋白质样品，并通过电泳技术将蛋白质分离。
2.准备转膜膜：选择合适的转膜膜，并裁剪成适当大小。
3.转膜：将电泳分离后的蛋白质样品与转膜膜一起放入转膜液中，进行转膜处理。
4.固定：转膜完成后，将膜放入固定液中，进行固定处理。
5.检测：固定完成后，选择合适的检测方法进行检测，如酶联免疫吸
附试验（ELISA）等。
四、WB 转膜的注意事项
1.转膜过程中要保持恒温，避免温度对转膜效率产生影响。
2.选择合适的转膜液，根据实验目的和样品特点进行调整。
3.固定处理要充分，以保证后续检测的准确性。
4.检测方法要根据实验目的和样品特点进行选择，确保检测结果的准确性。
western blot 全过程 详细步骤
一：提蛋白：1.PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。
2.在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。
3.4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，实验组18ul)）。
4.取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。
5.96孔板中每孔加2ul蛋白液。
6.每孔加200ulA/B混合液。
7.37度半小时。
8.测浓度以及标化用一起在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还有标化后的浓度。
562波长0.046斜率（实验组值-对照组值）/斜率=浓度浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）9.加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。
二：跑胶1. 1.0玻板，洗干净2.配制10%或者12%分离胶一块胶需要5ml3.灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇4.配制5%浓缩胶2块胶需要4ml5.待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子6.待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝）7.预电泳，100v，10-15min8.加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul9.60v 10-20min，之后100-110v三：转膜1.配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇2.transfer buffer浸泡海绵、滤纸3.pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min4.胶取出，在transfer buffer里泡10min5.黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）6.转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑）四：封闭、一抗、二抗1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度2.一抗4度12h3.pbst洗膜，3次，每次10min4.二抗（1:5000）1h 37度5. pbst洗膜，3次，每次10min6.显影剂A和B各300ulPBST：1000ml’PBS+1mltween5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g sds 10g 加水至1000ml10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸144.1g 加水至1000ml1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇加水至1000ml。
Western blotting操作流程
Western Blotting （His-tag ）一、SDS-PAGE 电泳Sample 加入5×SDS Loading ，99℃、5分钟热处理，SDS －PAGE 电泳。
使用 Marker ：M1：Precidion Plus ProteinTM Dual Color Standards 5μl （Bio_Rad Catalog 161-0374） M2：Perfect ProteinTM Makers 10-225KDa 5μl （Novagen Catalog 69079）二、转膜（Blotting ）1、裁剪SDS －PAGE 胶，使所有样品、Marker 均包含在内，量取裁剪后胶的 长×宽，并裁剪相同尺寸的转膜滤纸12张，PVDF 膜1张；2、将PVDF 膜用甲醇浸泡10秒；3、将胶、转膜滤纸、PVDF 膜分别浸泡在如下图所示的相应转膜缓冲液中3~5分钟；4、依次按照下图所示的顺序在转膜仪的下表面叠放胶、转膜滤纸、PVDF 膜，用干净面巾纸拭干滤纸周围多余的液体，将转磨仪上表面安装好，轻轻下压上盖，使其与滤纸充分接触；5、按照胶尺寸1cm 2= 1mA 设定电流， 转膜120 min 。
三、封闭（Blockin ）1、配制Blockin 溶液，一般40ml 较合适（Blockin ：10ml 、一抗：14ml 、二抗：14ml ）；2、确认转移转膜后PVDF 膜上Marker-M1清晰，此时转膜成功；3、将转印后的PVDF 膜装入干净的水煮袋中，加入10ml 1.5%BSA/TBST ，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT 、摇动1hr 或4℃、O/N 封闭。
四、一抗1、取出封闭后的PVDF 膜，转入新的水煮袋中；A 液（负 极）（正极）C液B液胶PVDF膜2、加入14ml 1.5%BSA/TBST，按照1000：1的比例加入14μl一抗——Penta-HisAntibody, BSA free(QIAGEN Code.34660)，尽量将气泡排干净，封口，用铝箔纸将水煮袋覆盖，RT、摇动1hr进行反应。
半干转膜方法
半干转膜方法
半干转膜方法是一种常用的Western blotting 技术，主要步骤如下：1. 组装转移叠层：
- 用蒸馏水清洗电极。
- 在缓冲液中平衡凝胶。
- 剪裁印迹纸和转移膜，应与胶体同等尺寸。
如果膜需要比胶更大，使用聚脂薄膜面罩。
- 准备印迹纸：每个胶，至少剪裁6张与胶差不多同等大小的印迹纸。
根据所需缓冲液的用量测量印迹纸层的厚度和数目。
用转移缓冲液浸泡至少3张印迹纸。
一张张放于下电极，除气泡。
- 准备膜：对于每个胶，剪裁1个与胶同等大小或稍小一点的膜。
用蒸馏水提前润湿硝化纤维膜或者尼龙膜。
用甲醇提前润湿PVDF 或者其他疏水膜。
然后将膜浸润在转移缓冲液中2-5分钟。
2. 完成叠层：
- 将预先润湿的膜放置在印迹纸上。
- 将胶放置在膜上。
- 用浸润过的三层印迹纸覆盖在胶上。
- 进行电转移。
请注意，在进行半干转膜时，需要严格遵守实验步骤和操作规范，以确保实验结果的准确性和可靠性。
如果你对具体的实验细节或操作步骤有疑问，建议咨询相关专业人士或查阅相关实验手册。
实验记录-Western-Blot之跑胶与转膜
Western blot之跑胶与转膜（一）跑胶：1.蛋白样品准备：取一些之前做蛋白提取定量后已知浓度的蛋白样品，将所有蛋白样品调至等浓度（我们一般加入适量的RIPA），充分混合后，将样品与5X的loading buffer按4：1比例混合，并置于沸水中煮5min使蛋白变性，冷却至室温后放冰上备用（上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品）；2.将胶连同玻璃板放置于电极架上，（梳子的一面朝里）固定好放入跑胶的缸子里，倒入一些running buffer；3.小心拔出梳子，避免破坏胶孔；4.上样：每块胶选1个孔加入5ul marker，加样一定要缓慢、稳，尽量选中间孔加入蛋白样本，尽量避免产生气泡，如果每个蛋白样本上样体积差异较大，可用1Xbuffer增加体积较少的孔，避免孔重差异导致相邻两蛋白条带的长短不一，上样完成后再加入一些1X的running buffer；5.电泳：连上电极，黑----黑，红----红，先开70v试跑，待样品进入分离胶后电压改为100v，（根据你蛋白样本分离情况调整时间），或当溴酚蓝接近或刚出胶底部时候可终止电泳；(二)转膜原理：转膜的原理是利用结合SDS的蛋白抗原带负电荷，在电场作用下从凝胶中转移至膜上。
方法是制作三明治夹板（海绵垫-滤纸-膜-凝胶-滤纸-海绵垫），放转膜槽中转膜，使蛋白质在电场力的作用下，从凝胶转移到膜上，膜可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
1、物品准备：转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）、转膜用的夹板、两块海绵垫、4-6张滤纸、一张PVDF膜。
2、剪切适合大小的膜，放在甲醇溶液中浸泡，滤纸和海绵垫提前放入transfer buffer中浸泡；3、三明治夹板：先在托盘中倒入适量transfer buffer,然后依次放入转膜夹子---海绵垫---滤纸---PVDF膜---胶---滤纸---海绵垫，三明治夹板制作过程中一定要避免产生气泡，一定要充分排出气泡，使夹板夹紧，保证对凝胶有一定压力。
WB快速转膜液的使用方法及步骤
WB快速转膜液的使用方法及步骤WB（Western blot）快速转膜液主要用于Western blot实验中的蛋白电泳转膜步骤，下面是其详细的使用方法及步骤：一、实验前准备：1.将WB快速转膜液从-20℃冷冻保存条件迅速转移到4℃冷藏保存条件下，使其溶解均匀，放置2小时。
2.取出所需的PVDF或NC膜，并用TBST缓冲液浸泡20分钟，去除其中的有机溶剂。
二、电泳结束后进行转膜：1.关闭电泳仪电源，在电泳槽中小心取出胶片和蛋白质凝胶。
2.使用无菌镊子或无菌手套，将蛋白质凝胶上胶及下胶用纸快速剥离，并在电泳槽中洗净。
3.高分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗2次，10分钟/次；低分子量蛋白质在脱胶缓冲液中洗1次，10分钟。
4.将含有蛋白质的凝胶快速转移到已浸泡在TBST缓冲液中的PVDF（或NC）膜上。
5.如有需要，先用标尺切割PVDF（或NC）膜，使其与凝胶大小相匹配。
三、转膜条件：1.将蛋白质凝胶和膜夹在两片不含泡沫的海绵之间，并同时将其与孔板或纸张夹在一起。
2.通过应用约100V的恒定电流进行转膜。
用正极连接电源端口上的红色插孔，负极连接黑色插孔。
3.根据样品大小和此前实验数据，预计转膜时间一般为1-2小时。
如果处理过的样品非常大，转膜时间可能需要延长。
四、将洗膜：1.在转膜完成后，将膜快速从转膜装置中取出，用冷缓冲液迅速冲洗转印膜以去除残余的凝胶。
2.将膜放入含有5%脱脂奶粉的TBST中的封闭沉淀液中，封闭30-60分钟。
五、主要试剂的准备：1. 酶标仪AB染色液准备：根据需要的体积，按照1：50的稀释比例将染色缓冲液（5x）稀释成1x稀释液中。
例如，对于20ml AB染色液，需要将0.4 ml染色缓冲液稀释成20 ml 1x稀释液。
2.抗体溶液准备：将所选择的一抗或二抗按照所需体积稀释成1xTBST中的合适浓度。
六、探测步骤：1.将膜与所选择的抗体孵育，通常在4℃下过夜。
2.将膜置于摇床上，与所选择的一抗或二抗孵育30分钟。
western blot转膜原理
western blot转膜原理
Western blot转膜技术是一种基于免疫学原理的蛋白质检测技术。
其原理是先将待检样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出不同分子量的蛋白质，然后将这些蛋白质从凝胶上转
移到含有亚硝酸纸或聚氨酯膜的硬质支持膜上进行检测。
Western blot转膜的过程主要包括以下几个步骤：
1. 凝胶电泳：将蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，使样品中的蛋白质按
照分子量大小被分离出来。
2. 转膜：然后将凝胶与带有亚硝酸纸或聚氨酯膜的硬质支持膜接触，并施加足够的
压力，使蛋白质从凝胶上转移到支持膜上。
3. 阻滞：为了避免未特异性结合的抗体与膜上的非特异性蛋白质结合，需要给膜进
行一定的阻滞处理，通常使用牛血清蛋白或BSA（牛血清白蛋白）进行阻滞处理。
4. 一抗结合：将特异性抗体加入到膜上，使其与相应的蛋白质结合。
5. 二抗结合：加入标记有酶或荧光基团的第二抗体，使其与一抗结合。
6. 信号检测：通过溶液中特定底物的反应，使标记有酶或荧光基团的二抗在膜上呈
现出特定的荧光或酶促反应产生的色素。
7. 结果分析：根据荧光或色素的强度、位置或大小来分析样品中所含有的蛋白质种类、含量以及存在的修饰状态等。
总之，Western blot转膜技术是一种高灵敏度、高特异性的蛋白质检测方法。
其原理简单易懂，操作简便，广泛应用于分子生物学、免疫学、生物化学等领域中的蛋白质表达、诊断和研究。
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转膜（Trarsmembran）
1 转膜的定义
将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
2 转移膜的选择
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。
大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0.2 μm的膜了，如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。
但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。
聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。
膜的选择主要根据：
p 膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；
p 不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；
p 如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
几种膜的性质对比
PVDF膜NC膜尼龙膜背景低低较高
蛋白结合能力100-200 μg/cm280-100
μg/cm2
>400
ug/cm2
机械强度强干的膜很脆软而结实
溶剂抗性强差差
使用前处理甲醛润湿缓冲液润湿缓冲液润湿价格高较低
低
3 转膜步骤（以槽式湿转为例）
1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10 min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10 min。
如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
3. 装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。
切记：胶放于负极面（黑色面）。
4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100 V，1 h（电流约为0.3 A）。
注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。
4 转膜注意事项
1. 泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min；
a. 凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。
b. PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。
2. 转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板；
3. 转膜条件：0.35 A/250 V/1 h/40 min/冰浴中进行转膜（转膜过程产生大量的热，注意冷却）；
（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。
）
4. 其它注意事项：
a. 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。
因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。
b. 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则
会导致转膜不完全。
c. 保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大和过小都会影响转膜效率。
d. 鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜（NC膜）。
5 转膜后检测（此步可以省略）
转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST（或PBST）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液或硬度墨汁染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
a. 丽春红染色：蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。
b. 印度墨汁染色：只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。
印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。
这时，可改用其他检测方法或换用丽春红S。
注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。