斑马鱼的胚胎发育与影响因素

鲁东大学生命科学学院学院20 10 －20 11 学年第二学期学院______________ 专业_____________ 年级________ 班________ 学号_____________姓名______________密封线 学生须将文字写在此线以下《发育生物学》课程论文课程号：2522080.关键词：斑马鱼；发育；葡萄糖；溶液浓度；温度；TCDD一、斑马鱼简介斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。

斑马鱼是一种常见的热带鱼。

斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。

孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。

卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。

发育温度要求在25-31℃之间。

斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。

经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关 斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。

斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。

斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力.二、斑马鱼的发育过程1〕卵子的发生斑马鱼卵子发生过程中乱母细胞的发育是不同步的。

在卵子发生早期，核内许多小核仁开始富集，其数目在接下来的时期中可以达到1500个，他们分布在和的外围和靠近内部核膜。

斑马鱼卵子发生过程一般分为5个时期，即StageⅠ-Ⅴ;有时也将StageⅡ和Ⅲ作为一个时期将卵子发生分为4个时期。

各个时期的基本特征是：StageⅠ是原始滤泡生长阶段，乱母细胞没有卵黄，是一个有细胞质包围着升值滤泡的圆形球体。

其染色体去浓缩并出现灯刷装状表型，此时DNA高度延伸，形成一个具有典型形态学上的包含RNA和蛋白质的恻环。

染色体的这一构型被认为有利于母源性基因的转录激活，其出现与斑马鱼卵母细胞中RNA合成的高速率是一致的。

在这时期，卵母细胞和滤泡细胞的微小突起（microvilli）开始伸展并延伸到彼此的区域。

一旦形成，这些连接包含粘附连接、细胞桥粒和间隙连接，它们可能与滤泡细胞和卵母细胞间的交流和卵母细胞附近小分子的吸收有关。

同时，卵黄膜组分开始在滤泡细胞和卵母细胞之间富集；其他结构，如线粒体、高尔基体和内质网等富集，反映了产生大量产物的需要。

StageⅡ卵母细胞的特点是富集了大量蛋白质和油脂，对于卵子激活和胚胎发育很重要。

皮层小跑时期的标志是皮层小泡（包含有蛋白质和糖类的滤泡）的出现，推测可能由卵母细胞本身产生。

这些结构在卵母细胞皮层逐渐富集，最后在卵子激活之前通过保外分泌释放出来。

StageⅢ即卵黄生成期的卵母细胞，卵黄前体蛋白和油脂继续富集。

卵黄蛋白的主要组分，卵黄蛋白原，由肝脏产生后通过卵母细胞的内吞作用获得，然后进行蛋白水解分离，最后保存在卵母细胞中，在这里将成为发育中的胚胎必须的营养补充。

卵母细胞的生长结束于StageⅣ即将成熟，其特征是卵母细胞核或GV迁移到未来动物极、核膜最后破裂以及第二次减数分裂中期的减数分裂阻滞。

成熟的卵母细胞被排除并运送到输卵管，成为能够受惊的StageⅤ卵母细胞。

2〕精子的发生精子的发生开始于雄性生殖干细胞即精原细胞的有丝分裂，雄性中的精原细胞的有丝分裂在成年后的生命过程中是持续发生的，因而能够不断产生大量的精细胞。

斑马鱼中同一个精小叶中，精子发生是同步的，因此一个精小叶中仅仅包含精原细胞或精母细胞或精子细胞。

随着精子细胞的成熟，精小叶相连的组织边缘破裂，形成大面积的与输精管相连的成熟精子。

3）斑马鱼的受精作用受精时两性生殖细胞融合并创造出具备源自双亲遗传潜能的新个体的过程。

受惊的第一个功能是将父母的基因传递给后代，第二个功能是在卵细胞质中激发一些确保发育正常进展的系列反应。

斑马鱼的成熟卵子处于第二次减数分裂中期，精子通过受精孔进入卵内，精子入卵后，卵子被激活。

受精后，斑马鱼卵子发生了以下几个变化：(1) 卵膜膨胀举起并远离卵子；(2) 分泌皮层颗粒，受精圆锥体形成并作为精子进入卵子的结构；(3) 细胞质开始流向动物极，起始核质分离，之一过程在早期卵裂中继续进行。

4)斑马鱼的胚胎发育胚胎发育是从一个单细胞受精卵开始，到最终具有数以万计的细胞分化并分化为神经、运动、消化、排泄、生殖、内分泌等多个系统的能行使复杂功能的完整生物体。

在这个漫长的胚胎发育过程中，有两各方面至关重要。

一方面是通过细胞周期完成从一个单细胞受精卵到多细胞成体的过程；另一方面是通过细胞分化过程中完成多种不同功能的器官和系统形成。

这两个方面对于同一个细胞来说是相互竞争的，一个细胞一旦分化，它的分裂能力将大大降低；这两个方面在胚胎发育过程中又是相互对话、相互偶联并受到严格调控的，如果这两方面相互对话的途径受到影响，就会刀子一些早期遗传疾病的发生甚至胚胎死亡。

斑马鱼的胚胎发育可分为7个阶段，分别是：（1）合子期；（2）分裂期；（3）囊胚期；（4）原肠胚期；（5）体节期；（6）咽囊期；（7）孵化期。

1） 合子期合子是一个包含卵黄和细胞质的半透明混合物，在动物极存在一个小的清晰的细胞质断层，即生殖泡的残余。

2） 卵裂期卵裂类型包括经线lie和纬线裂，该时期的特点为细胞分裂间期短；细胞变小；转录不活跃；不等裂等。

斑马鱼的受精卵为端黄卵，卵裂局限于胚盘部分，其卵裂方式为不完全卵裂。

斑马鱼受精后40分左右卵裂开始，平均大约每隔15分卵裂一次。

钱5次卵裂均为经裂，产生单细胞层。

从第6次卵裂开始，经裂与纬裂交替进行。

在第12次分裂之前，不同细胞的分裂是同步的。

3） 囊胚期从第八次卵裂开始，就进入囊胚期形成盘状卵裂。

与其他真骨鱼类不同的是，斑马鱼的囊胚期不形成囊胚腔，只在胚盘的下层细胞中形成一些小的细胞外间隙；同时，细胞分裂周期开始延长，这标志着中胚囊转换开始4） 原肠期原肠作用指囊胚细胞有规则的移动，是未来的内胚层的和中胚层细胞潜入胚胎内部而未来的外胚层细胞铺展在胚胎的便面从而形成原肠胚。

在原肠胚时期，斑马鱼的生殖层开始形成。

斑马鱼的原肠运动主要包括外包‘内卷和汇聚伸展。

外包始于囊胚期末，1\2外包标志着原肠期的开始期。

5） 体节期体节期发育完成时，胚胎包括8000-10000个细胞。

最显著的特征是近轴中胚层节律性分节从而形成体节。

此外，还具有许多特性：眼原基和耳原基开始出现；闹神经外胚层变厚；脊索细胞开始扩展并延伸到胚胎尾部；随着肌膈膜的形成，体节呈现出交叉缝式。

6） 咽囊期咽囊期体轴从早期的弯曲变为伸直；循环、色素细胞开始分化，同时鰭条开始发育。

7） 孵化期孵化期胚胎与以前具有相同的生长速率，完成了基本器官系统的快速形态发生；脑和胸鳍的了软骨发育；表现出孵化不同步性；在72hpf，鱼鳔膨胀；开始觅食，具有主动避敌行为。

三、斑马鱼发育的影响因素1〕葡萄糖溶液浓度聊城大学农学院的李俊霞等人通过用不同浓度的葡萄糖溶液处理孵育48h后的胚胎后发现：1.5%、2.0%葡萄糖处理与对照组之间的水平差异在0.05水平显著，其余组与对照组无显著差异。

孵育60h 后，浓度1%~2%葡萄糖溶液中大部分胚胎已经孵化，与对照组相比，差异达0.01显著水平。

这说明浓度1%~2%葡萄糖或蔗糖可以大大促进斑马鱼胚胎发育的速度。

孵育72h后，对照组中只有不到1\3的胚胎幅画，而在加有葡萄糖的溶液中，孵化率均超过85%，几乎都在90%以上，接近100%。

由此可知，葡萄糖对斑马鱼胚胎发育有明显的促进作用。

2〕TCDDt etrachlorodibenzo-p-dioxin四氯二苯并-p-二恶英( 除草剂中一种剧毒的杂质) TCDD氯化氧撑萘类化合物也是一类重要的除草剂,其中最重要的化合物是四氯二苯-p-二恶英(Tetrachlorodibenzo-p-dioxin TCDD).TCDD有22种不同的异构体,在环境中通常以混合物形式出现.TCDD的化学性质相当稳定,在超过700℃的温度下才发生化学分解.TCDD具有亲脂性,与土壤中的固体及其他物质紧密结合.致死性 董武、魏强等报道24hpf （受精后24h）染毒至180hpf，摄食对照群，0.1μg/L，0.3μg/L，0.5μg/L，1μg/L，10μg/L 染毒群的死亡率分别是0，0，5%，60.2%，61.8%，100%。

10μg/L 染毒群在144 hpf 已全部死亡。

这种试验条件下180 hpf的LC50约为0.3～0.5μg/L。

Henry等测定240hpf的LC50为2.5ng TCDD/g egg。

下颌发育短小 斑马鱼下颌发育短小已成为TCDD引起的典型毒性之一［10～14］。

24hpf开始对斑马鱼胚胎持续静态染毒至观察结束，1ppb染毒群在60hpf引发下颌生长的显著（P<0.05）抑制，且作用强度与TCDD浓度正相关的［10］。

对下颌与身长的比值进行研究，证明TCDD的对下颌的抑制作用是特异的，不是继发于对胚胎发育的抑制。

软骨染色观察显示TCDD能显著抑制头部软骨的生长，特别是Meckel’s 软骨，但并不影响软骨的形成。

为了确定TCDD对胚胎的作用时间，分别在0，12，24，36，48，60，72，84hpf开始染毒，96hpf观察对下颌发育的影响。

0～24hpf染毒对下颌抑制的程度无明显区别，随后24～84hpf染毒对下颌的抑制作用逐渐降低。

可见于24hpf完成的神经嵴细胞的分化过程［15］不是TCDD产生下颌短小毒性的关键时期（critical period）。

神经系统 Adrian等发现TCDD（2hpf）染毒可减小胚胎脑容量，且相同身长的鱼，脑容量的减小程度随TCDD浓度增加而加剧。

各组内胚胎脑容量与身体大小线性相关（r2 values：丙酮对照组＝0.7014, 100ppt 染毒组＝0.6336, 120ppt 染毒组＝0.6364）。

测定神经元密度后与脑容量相乘，进而分析神经元总量的变化。

100，120ppt染毒组168hpf表现出神经元显著的缺失。

眼部杆锥层和脑部（松果体，midbrain-hindbrain boundary，端脑，间脑）的解剖学检查表明TCDD染毒对神经系统的结构发育没有影响心脏 受精后斑马鱼胚胎静态染毒TCDD 1h，显示出对心脏的一系列毒性：48hpf心肌细胞的数量的减少，随后出现心脏成环（altered looping）和形态学改变，72hpf心脏容量全面缩小。

这些变化伴随着心脏功能的损伤，120hpf血液倒流和心输出量减少多发，最终出现心室停顿血液循环 受精后立即接触TCDD的斑马鱼胚胎全胚循环（overallc irculation）48hpf出现［7，9］，接下来的两天血流速度下降，直到96hpf血流停止［7～9］，伴随多血管红细胞灌注率的减少。