最新固定化酶与固定化细胞课件ppt

• 固定化细胞（定义）：将具有一定生理功能的生物 细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的方 法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一 门技术。
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系统。
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优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体的功能 基团进行偶联。
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1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙
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2）偶联方法：
偶联成功与否取决于： •载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。 •酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
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优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
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3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
角叉菜胶包埋法： 滴至
角叉菜胶＋E (or cell)
KCl 溶液中
IE(or IC) IE (or IC)
聚丙烯酰胺凝胶包埋法：
AP
Acr+ Bis+E (or cell)
IE (or IC)
TEMED 29
2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微孔 膜内 。
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二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
网格型
微囊型
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1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用， 使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂 上。
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根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
半透膜：直径几十微米到几百微米，厚 约25nm。
半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜 孔径的小分子底物和产物可以自由进出， 被称为“人工细胞”。
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
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戊二醛有两个 醛基，均可与酶 或蛋白质的游离 氨基反应,使酶蛋 白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
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交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
包埋条件 酶活性
天然凝胶 琼脂、海藻酸钙、温和 角叉菜胶、明胶
不变
强度 差
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光 聚合反应 部分失活 高 交联树脂
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海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至
海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中
碎。 ③位阻应该较小：尽可能不妨碍酶与底物的接近。 ④成本低：酶固定化的成本要尽可能的低。
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优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。
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2. 固定化细胞（immobilized cell）
固定在载体上并在一定空间范围内进行生 命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。
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什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
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酶固定化方法要求
①不破坏酶活性中心的构象：酶的固定化不能破坏酶 活性中心的构象，尽量防止活性部位的氨基酸残基 受到影响；
②载体要求： a.固定化的载体应与酶结合较为牢固。 B.载体不能与底物、产物等发生化学反应。 C.载体必须有一定的机械强度，防止因机械搅拌而破
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常用的偶联反应有：重氮化法、叠 氮法、溴化氰法、烷基化法等。
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优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。 •缺点：反应条件较激烈，易影响酶 的空间构象而影响酶的催化活性。
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3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
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缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团 被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用 带来不便。
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4. 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为：
网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
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②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
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第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
四 原生质体的固定化方法
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一、固定化酶和细胞的定义及特点
1.固定化酶(immobilized enzyme) 通过化学或物理的手段将酶定位于限定
的空间区域内，使其保持活性并可反复利 用。
硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-
纤维素 16
优点：条件温和，操作简 便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解吸 附。
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2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
固定化酶与固定化细胞
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游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，使用成本高。 3.酶在游离体系中更容易自水解 4.分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白
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• 固定化酶（定义）：用物理或化学手段定位在限定 的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的 酶。（1971年在美国召开的第一届国际酶工程会议）