毛细管电泳发展历史
毛细管电泳展望
五毛细管电泳展望一、毛细管电泳的兴起与发展毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),又称高效毛细管电泳(HPCE)是近年来发展最快的分析化学研究领域之一.1981年Jorgenson等[1]在75μm内径的毛细管内用高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳。
1984年Terabe等[2]发展了毛细管胶束电动色谱(MECC)。
1987年比Hjerten[3]建立了毛细管等电聚焦(CIEF),Cohen和Karger[4]提出了毛细管凝胶电泳(CGF)。
1988—1989年出现了第一批CE商品仪器,1989年第一届国际毛细管电泳会议召开,标志了一门新的分支学科的产生.短短的几年内,由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对生物大分子(肽、蛋白、DNA等)的高度分离分析的要求,得到了迅速发展,正逐步成为生命科学及其它学科实验室中一种常用的分析手段.近三年来国际毛细管电泳会议与会者均达700—800人,1996、1997两年公开发表的有关CE论文达3600余篇。
可参见相关综述则[5-8]。
欧洲、美国国内及日本也相继召开CE地区性国际会议。
我国在CE领域研究起步早、发展快、研究工作较全面、有的研究成果达到国际先进水平。
定期召开全国CE 会议及亚太地区国际会议,在国际上已有一定的影响。
1984年中国科学院化学所竺安教授在国内率先开展CE研究,迄今国内已有几百个单位开展CE研究和应用.从CE理论到各种模式及各方面应用,国内均在进行。
1998年举行的第三届全国CE会议共收录论文129篇,同时举行的第二届亚太国际会议也取得了成功。
毛细管电色谱(CEC)、CE/MS联用、低背景毛细管梯度凝胶电泳、手性药物分离、逆流聚焦及脱氧核糖核酸(DNA)各种CE测定方法等一批研究成果均达到国际先进水平。
二、毛细管电泳基本原理CE是以高压电场为驱动力。
以毛细管为分离通道,依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异,而实现分离的一类液相分离技术.仪器装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮瓶,在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电泳。
高效毛细管电泳技术
2.1 电渗现象
当固体与液体接触时,固体表面带一种电荷,则 因静电引力使其周围液体带有相反电荷,在液-固界 面形成双电层,二者之间存在电位差。
202X 添加副标题
毛细管电泳
目录
一、概述-毛细管和电泳技术
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毛细管柱是毛细管电泳(CE)的核心部件,目前多为2575μm之间,材料为聚四氟乙烯、玻璃和弹性石英,以石英 居多。 电泳:在电解质溶液中,带电离子在电场力的作用下,以不 同的速度向与其所带电荷相反的电极迁移的现象。由于不同 离子所带电荷及性质的不同,迁移速率不同,可实现分离。
3.2 DNA分析
DNA分析包括碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、引物、探针、单链 DNA、双链DNA分析。用CE测DNA序列的应用很多, 如用短寡核苷酸
引物库测DNA 序列、高速DNA 序列、毛细管阵列、毛细板阵列。
3.3 环境分析
01
水源是人类生存最重要的环境 资源,对水质的分析是CE 最 广泛的应用领域之一。CE 的 工作环境是水介质,这一特点 为环境分析带来极大方便。目 前,CE已经可以准确测量出 水环境中的多种多环芳烃、多 氯联苯等。
1. 邓光辉用毛细管电泳安培检测法检出了辣椒粉样品中的苏丹红 I 号。 2. 张辰凌等以 20 mmol/L 乳酸溶液为背景电解质,用毛细管电泳-电容耦合非接触
电导法检测了牛奶中的三聚氰胺的含量。 3. 管月清等采用毛细管电泳-电化学检测法同时测定了肉制品中盐酸克伦特罗与沙丁
胺醇的含量。
四、毛细管电泳的特点
毛细管电泳和毛细管电色谱
其他领域
毛细管电泳还应用于食品分析 、冶金、地质等领域,可用于 金属离子、矿物成分等的分离
和检测。
02 毛细管电泳技术
CHAPTER
进样技术
压力进样
通过施加压力使样品进 入毛细管,适用于大体
积样品。
电动进样
利用电场力驱动样品进 入毛细管,适用于低粘
电解质浓度
影响电场强度和离子迁移率。
温度
影响分子热运动和扩散系数。
毛细管材料和内壁处理
影响样品在毛细管内的吸附和分离效 果。
03 毛细管电泳实验
CHAPTER
实验流程
安装毛细管
选择合适的毛细管,将其插入 仪器,确保密封良好。
运行实验
设定合适的实验参数,如电压、 温度、检测波长等,开始实验。
准备毛细管电泳仪
进系统
用于将样品注入到毛细管中。
实验材料
毛细管
具有微米级内径的玻璃或石英管,是电泳的分离通道。
电解质溶液
用于提供电泳所需的离子环境。
样品
待测物质,需进行适当预处理。
清洗液
用于清洗毛细管和仪器,保持实验的准确性。
04 毛细管电色谱简介
CHAPTER
定义与原理
定义
毛细管电色谱(CEC)是一种将高效电泳分离与高效液相色谱的固定相相结合 的分离技术。
亲和电泳
利用特异性亲和作用进行分离 ,如抗体-抗原、酶-抑制剂等
。
检测方法
紫外可见光谱
利用紫外可见光谱检测分离出的组分。
电化学检测
利用电化学方法对分离出的组分进行检测。
荧光检测
利用荧光物质标记待测组分,通过荧光信号 进行检测。
毛细管电泳
• 从二十世纪八十年代初开始,Jorgenson 等使用更细的毛细管及内径为75μm的熔 融石英管做CZE,在30kV电压下每米毛 细管的效率高达4×105的理论塔板数, 这一开创性的成果成为毛细管电泳发展
3.应用领域的不断扩展
• 与传统电泳一样,CE的主要应用领域是生命科 学,分离对象涉及氨基酸,多肽,蛋白质,核 酸等生物分子,对蛋白质结构分析具有重要意 义的肽图,对人体基因工程具有决定性作用的 DNA测序等许多当代生命科学中分离分析难题, CE都已涉及。
• 在应用于生命科学的同时,CE近年来已迅速扩 展到其它领域,包括食品化学,药物化学,环 境化学,毒物学,医学和法医学等,特别是在 手性分子和生物大分子的分离方面,CE具有独 特的优势。
以电场力驱动产生的EOF,与HPLC 中靠外部泵压产生的液流不同。EOF 的流型属扁平流型或称“塞流”。扁 平型的塞子流不会引起样品区带的增 宽,是毛细管电泳高效的重要原因 。
HPLC的流型则是抛物线状的 层流,它在壁上的速度为零,中心 速度为平均速度的2倍。
Van Deemter方程:
HAB/u Cu
• 目前,CE的研究热点包括:DNA的高速 测序,蛋白质的高效分离,糖类分析, 细胞分析,手性拆分等等。此外,毛细 管电泳还可用于物理化学常数的测定, 生产工程控制等。
历史的简单回顾
• 瑞典科学家Tiselius在1937年首先提出电泳,创 造了Tiselius电泳仪,并建立了移动界面电泳方 法。1948年他获得了诺贝尔化学奖。
毛细管电泳仪的原理
毛细管电泳仪的原理
毛细管电泳仪(capillary electrophoresis,CE)是一种电泳技术,它利用电场对生物分子进行分离和分析。
它是由美国科学家 A.J.P. Martin在20世纪80年代中期发展而来的,已被广泛应用于生物化学,分子生物学,分析化学,环境科学,药物学和其他科学领域。
毛细管电泳仪的基本原理是将样品放入毛细管中,然后把毛细管放置在一个电极板上,当电极板上的电极产生电场时,样品就会沿着电场线移动并分离。
毛细管的直径很小,介质的库仑数也比较低,这就使得电泳过程中离子的移动更快,分离效率更高。
毛细管电泳仪还具有众多优点,比如快速、灵敏、准确、简单等。
它能够实现快速、灵敏的分离,分离效率高达99.5%;它可以分离各种大小的生物分子,甚至可以分离蛋白质;它能够检测和分析复杂的样品;它也可以分析有机溶剂中的有机酸,如乙酸和丙酸;它还可以分析有机物的各种复杂分子,如芳烃和芳香族烃。
由于毛细管电泳仪的优势,它在医学、科学研究等领域得到了广泛的应用,在诊断疾病,研究蛋白质,检测抗体等方面都取得了巨大的成功。
它是一种高效、灵敏、准确的技术,也是一种经济而又可靠的方式,能够实现高通量的分析。
毛细管电泳
毛细管电泳
(Capillary Electrophoresis,CE)
第一节
概述
气相色谱虽然分离效率、选择性、灵敏度都很高,但 是它只适用于热稳定性好、易挥发的物质。 高效液相色谱虽然可以分析热稳定性差、难挥发的物 质,但是缺乏高灵敏度的通用型检测器。对于大分子 物质因其分子扩散系数小、传质阻力大,使柱效率大 大降低,以至于难以分离相对分子质量大于2000的物 质。 经典电泳技术操作繁琐费时、定量困难,且很难满足 现代生命科学研究的要求。
第二节 毛细管电泳理论
一、电泳法的基本原理
当带电粒子以速度v在电场中移动时,所受的 电场力为: FE = qE 式中: FE为电场力; q溶质粒子所带的有效电荷; E电场强度。
带电粒子运动时所受的阻力,即摩擦力为:
F = fv
式中: F为摩擦力;
f摩擦系数;
v溶质粒子在电场中的迁移速度。
当平衡时,电场力和摩擦力相等而方向相反:
特 点
1. 仪器简单,操作方便,容易实现自动化。
2. 分离效率高,柱效可达105~107块/m。
3. 分析速度快,几十秒~几十分钟。 4. 实验成本低,溶剂和试样消耗极少。 5. 操作模式多,分析方法开发容易。 6. 应用范围极广。
三、毛细管电泳的几种模式
1. 毛细管区带电泳 (capillary zone electrophoresis,CZE) 溶质在毛细管内的电解质溶液中以不同速度迁移而形成 一个一个独立的溶质带的电泳模式,其分离基础是淌度的 差别。 特点:简单,但不能分离中性物质。 2. 胶束电动色谱 (micelle electrokinetic chromatography,MECC) 在操作缓冲溶液中加入大于临界胶束浓度的表面活性剂。 特点:不仅分离离子型化合物,也能分离中性化合物。
毛细管电泳
第五章毛细管电泳色谱科学自从1903年俄国的茨维特发明了液固柱色谱之后,已有近100年的历史,但是在20世纪末的20年以前所未有的速度发展,特别是进人生命科学。
材料科学和信息科学时代,对分离分析提出越来越高的要求。
气相色谱法(GC)虽然分离效率、选择性、灵敏度都很高,但是它只适用于热稳定性好、易挥发的物质。
高效液相色谱法(HPLC)虽然不受热稳定性及挥发性的限制,可以分析热稳定性差。
难挥发的物质,但是和GC相比,缺乏灵敏的通用型检测器,实验中需消耗大量的有机溶剂,特别是对于大分子物质因其分子扩散系数小、传质阻力大,使柱效率大大降低,以至于难以分离分子量大于2000的物质。
经典电泳技术虽然和离心法、色谱法一起成为分离生物高聚物最有效和最广泛应用的三大方法,对生物化学的发展起了重要的推动作用,但是这些电泳技术操作烦琐、费时、定量困难,也很难满足现代生命科学研究的要求。
Jorgeson和Lukacs在充分研究电泳理论。
技术的基础上,将色谱理论和电泳技术相结合,于本世纪80年代初从理论和实际两个方面发展了高效毛细管电泳,并迅速在全球范围掀起研究热潮。
现在,高效毛细管电泳已经成为分离科学领域中极为重要的前沿课题之一。
一、电泳基本原理电泳指带电粒子在电场作用下作定向运动的现象。
电泳有自由电泳和区带电泳两类,分析工作者感兴趣的是区带电泳。
区带电泳是将样品加于载体上,并加一个电场。
在电场作用下,各种性质不同的组分以不同的速率向极性相反的两极迁移,此时不考虑样品与载体之间的相互作用,因此电泳不是一个色谱分离过程。
实际上,样品与载体之间总有一定作用力,人们就利用这种作用力,并与电泳过程结合起来,以期得到良好的分离。
因此,电泳又称电色谱。
区带电泳总是在固体或类固体这类载体上进行,常用载体有滤纸(故称纸电泳)、凝胶(故称凝胶电泳),以及醋酸纤维膜、淀粉、琼脂高聚物等。
图5-1 区带电泳设备示意图电泳设备简单,操作方便。
毛细管电泳分析技术的发展
毛细管电泳分析技术的发展毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)是一种高效、高分辨率的色谱技术,在药物、食品、环境、疾病等领域具有广泛的应用。
随着科学技术的发展,毛细管电泳分析技术也不断发展,并逐步成为一种主流的分析技术。
毛细管电泳分析技术的原理是基于不同物质在电场中的迁移速率不同,通过控制电场强度和电荷数目等条件,把样品中的各组分分离出来,以便进行定性和定量分析。
与传统的色谱分析技术相比,毛细管电泳分析技术具有分析速度快、分离效率高、分析重复性好、试剂用量少等优点。
毛细管电泳分析技术的发展可以分为三个阶段。
第一阶段是20世纪70年代至80年代初,毛细管电泳分析技术被作为一种新兴的分析方法被引入。
这个时期的毛细管电泳分析仪器比较原始,不够精密,使用范围也相对狭窄。
第二阶段是80年代中期至90年代中期,毛细管电泳分析技术逐渐得到了广泛应用,同时也出现了一些技术上的突破,例如:深色物质的检测、自动进样、联用检测等。
第三阶段是90年代末至今,毛细管电泳分析技术融入了一些新技术和新思路,如微芯片技术、基于液相金属定量质谱技术的毛细管电泳、光电子束刻录技术等。
这些新技术和思路的出现,极大的丰富了毛细管电泳分析技术的应用范围和性能。
毛细管电泳分析技术主要包括毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)、毛细管等温电泳(Capillary Isoelectric Focusing,CIEF)、毛细管电泳色谱(Capillary Electrophoresis Chromatography,CEC)等。
其中,毛细管区带电泳是最基本的毛细管电泳技术,其在化学、生物等领域的应用都很广泛。
毛细管等温电泳常常用于蛋白质和多肽的分离和分析。
毛细管电泳色谱是融合了毛细管电泳和液相色谱的分析技术,其与现代分析科学的研究方向高度契合,是目前发展最为迅速的毛细管电泳技术之一。
毛细管电泳技术发展及应用前景
【资料】毛细管电泳技术发展及应用前景毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis, CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管分离法(CESM),毛细管电泳方法虽新工艺,但历史悠久,它是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。
电泳作为一种技术出现,已有近百年的历史,但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术,是由1937年A. Tiselius 首先提出。
传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热,1967年Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis, CZE)。
但他没有完全克服传统电泳的弊端。
现在所说的毛细管电泳技术(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出,他们使用了75mm的毛细管柱,用荧光检测器对多种组分实现了分离。
1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳,开创了毛细管电泳的重要分支:胶束电动毛细管色谱(MEKC)。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。
同年,Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。
近年来,将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中,又发展了电色谱,扩大了电泳的应用范围。
当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后,发生了奇迹般的变化:分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化,分离效率达百万理论塔片数;分析片段能大能小,小到分辨单个核苷酸的序列,大到分离Mb到DNA;分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。
CE可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。
它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平,并使单细胞分析,乃至单分子分析成为可能。
长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。
毛细管电泳技术是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力,根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术,迅速发展于80年代中后期,它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容,是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展,它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平,并使细胞分析,乃至单分子分析成为可能。
毛细管电泳19390
A
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高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较
(1)分离过程: 相同
HPCE 与HPLC 都是一种液相分离分析技术。都是 差速迁移过程,可用相同的理论来描述,如保留值、 塔板理论和速率理论等。
A
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小结:高效毛细管电泳法的特点 (多、快、好、省)
1.分离模式多:
2.分析速度快、分离效率高
在3.1min内分离36种无机及有机阴离子,4.1min内分离 了24种阳离子; 分离柱效:105~107/m理论塔板数;
3.操作方便、消耗少
进样量极少(纳升),水介质中进行;
4.仪器简单、易自动化
电源、毛细管、检测器、溶液瓶
A
7
传统电泳的缺陷: (1) 焦耳热效应:电流通过电泳介质而产生 的热效应。
使电泳分离介质温度分布不均匀,引起溶 液对流,从而导致区带展宽,降低分离效率。 焦耳热效应随电场强度的增大而迅速加剧,限 制了高电压的使用。
(2)无法在线检测,定量精度较差。
A
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2.高效毛细管电泳技术
1981年,Jorgenson和Luckas,用75m内径的石 英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸,柱效高达 40万/m,使电泳技术发生了根本变革,迅速发 展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析 技术——高效毛细管电泳。
总之,毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电 荷所引起的管内液体的整体流动。
电渗流的特点:具有一定流 型,其电渗驱动力沿毛细管 均匀分布,所以电渗速度的 径向分布几乎是均匀的。
A
毛细管凝胶电泳
02 毛细管凝胶电泳的基本原理
CHAPTER
电泳
电泳是指带电粒子在电场中的迁移行为,其迁移 速度与粒子的大小、电荷量以及电场强度有关。
电泳技术利用了带电粒子在电场中的迁移行为差 异来实现混合物中组分的分离。
在毛细管凝胶电泳中,电泳是实现组分分离的重 要手段之一。
凝胶电泳
凝胶电泳是一种利用凝胶网络 对带电粒子进行分离的技术。
凝胶网络可以减少粒子的扩散, 提高分辨率,并使不同大小的 粒子在电场中以不同的速度迁 移。
凝胶电泳常用于蛋白质、DNA 等生物大分子的分离。
毛细管凝胶电泳的分离原理
毛细管凝胶电泳是将凝胶电泳技 术应用于毛细管中,利用毛细管 的高效分离特性实现混合物中组
在核酸分离中的应用
DNA测序
毛细管凝胶电泳结合荧光标记技术,可以对DNA进行高通量测序,广泛应用于基因组学和生物信息学 研究。
RNA表达分析
通过毛细管凝胶电泳可以分离和检测不同表达水平的RNA分子,用于研究基因表达调控和疾病发生机 制。
在临床诊断中的应用
病原体检测
毛细管凝胶电泳可以用于检测病原体如病毒、细菌等的基因组,有助于快速诊断和鉴别 感染性疾病。
分的分离。
在毛细管凝胶电泳中,组分的分 离主要依赖于其在电场中的迁移 行为和与凝胶网络的相互作用。
通过调整毛细管凝胶电泳的条件, 如电场强度、凝胶类型和配方等,
可以实现不同组分的分离。
03 毛细管凝胶电泳的实验技术与操作
CHAPTER
实验准备
仪器设备
准备毛细管电泳仪、高压电源、 进样装置、检测器等必要设备, 确保仪器正常工作并按照操作规
加样与电泳
毛细管电泳
缓冲溶液离子强度,影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流,明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加,电 渗流下降。
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(4)温度的影响
毛细管内温度的升高,使溶液的黏度下降,电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热”;
焦耳热:毛细管溶液中有电流通过时,产生的热量; HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强 度成正比。 温度每变化1,将引起背景电解质溶液黏度变化2%~3%;
R 2(t2 t1) W2 W1
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9 影响分离效率的因素——区带展宽
(1)纵向扩散的影响
在HPCE中,纵向扩散引起的峰展宽:σ2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小,可 获得更高的分离效率,大分子生物试样分离的依据。
(2)进样的影响
当进样塞长度太大时,引起的峰展宽大于纵向扩散。分 离效率明显下降;理想情况下,进样塞长度:
1948年,获诺贝尔化学奖;
2
经典电泳分析
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 法和技术叫电泳法或电泳技术。
按形状分类:U型管电泳、柱状电泳、板电泳; 按载体分类:滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳; 传统电泳分析:操作烦琐,分离效率低,定量困难,无 法与其他分析相比。
3
毛细管电泳发展概述
c 加入有机溶剂如甲醇、乙腈,使 电渗流增大。
21
8 HPCE中的参数与关系式
(1)迁移时间(保留时间)
HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱 理论也适用。
t Lef Lef Lef L
ap ap E ap V
V—外加电压;L—毛细管总长度;
(2)分离效率(塔板数)
毛细管电泳
– 电泳 是指在电场作用下,溶液中的带电粒子 作定向移动的现象。 – 电渗 是指在电场作用下,毛细管或固相多孔 物质内液体沿固体表面移动的现象。
毛细管电泳的特点
由于毛细管具有良好的散热效能,允许在窄内径毛细管两端加上高达30kV 的高电压,分离毛细管的纵向电场强度可达400V/cm以上,可以在很短的时 间内达到很高的分离效率,具有以下特点: (1)分离速度快(高压,高电场强度) 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子,4.1min内分离了24种阳离子 (2)分离效率高 (3)运行成本低 (4)样品与试剂消耗量少(1~50nL) (5)可供选择的分离模式多,应用范围广 (6)分离一般在水溶液介质中进行 (7)方法简单,仪器自动化程度高 (8)环境污染小
毛细管胶束电动色谱 的特点
a,缓冲溶液中加入离子型表面活性剂,其浓度达到临界浓度,形成一疏水内核,外部带负电的 胶束.在电场力的作用下,胶束在柱中移动.
b,电泳流和电渗流的方向相反,且ν电渗流 > ν电泳 ,负电胶束以较慢的速度向负极移动;
c,中性分子在胶束相和溶液(水相)间分配,疏水性强的组分与胶束结合的较牢,流出时间长; d,可用来分离中性物质,扩展了高效毛细管电泳的应用范围;
c, 氨基酸,蛋白质,多肽等的所带电荷与溶液pH有关,在酸性溶液中带正电荷,反之带负电荷. 在其等电点时,呈电中性,淌度为零;
d,聚焦:具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移,分别到达满 足其等电点pH的位 置时,呈电中性,停止移动,形成窄溶质带而相互分离; e, 阳极端装稀磷酸溶液,阴极端装稀NaOH溶液; f, 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测 g,电渗流在CIEF中不利,应消除或减小.
毛细管电泳发展历史综述
毛细管电泳的发展历史中文摘要本文简要的回顾了毛细管电泳的发展历史,对其发展和应用现状进行概述,并对未来的发展提出一些设想,作为我们研究课题的重点,特别对毛细管电泳安培检测技术进行了较为详细的评述。
从电导检测、电位检测和安培检测的三种方法用于毛细管电泳这项分离技术的发展过程,到基础理论的研究、检测池的设计与改进、电极的改进及其应用的简单介绍到未来的发展动向等方向逐一涉及,一般的药物、氨基酸和糖类的分析到目前应用的热点进行了综述。
从毛细管电泳安培检测技术需要进一步完善和发展考虑,提出了本论文的设想,在毛细管电泳安培检测的方法学研究及其在药物分析中的应用方面做出一些有意义的工作。
鉴于在毛细管电泳安培检测技术中,用于分离的高压电场对安培检测有着严重干扰,影响检测的灵敏度,而且分离毛细管与工作电极对接也存在一定困难等原因,前人已做了大量的研究工作,并提出了种种解决办法,但还存在不尽如人意的地方。
在原有的工作基础上,我们进一步进行了毛细管电泳安培检测的研究工作,设计制作了一种高压电场隔离接口和相应的安培检测池,并对工作电极进行了改进,兹将主要研究内容报告如下:第一部分概述了毛细管电泳的发展历史,对电导检测、电位检测特别是安培检测的基本原理及其应用工作进行了详细介绍,指出了三种检测技术的优缺点,以及人们为降低噪音、提高检测度方面所做的一些工作,最后还简单介绍了本文的目的、意义和内容。
第二部分设计制作了一种电场隔离接口和安培检测池,并对检测电极做了进一步改进。
对高压电场隔离接口的强度、稳定性、平衡时间、导电效率及隔离电场性能等进行了详细的研究。
结果表明:该接口稳定,隔离电场效果好,可以满足实际工作的需要;制作的安培检测池可以解决分离毛细管与工作电极对接困难的问题,其工作电极可以方便的插入分离毛细管而不碰壁。
组装了一套毛细管电泳安培检测系统,并利用该系统分离检测了三中种对苯二酚,结果令人满意。
此外,我们通过对电极的改进,削弱了在毛细管电泳安培检测中存在的峰扩展现象,进一步提离了分离效率。
毛细管电泳分析方法的工作原理介绍
毛细管电泳分析方法的工作原理介绍毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE), 是近年来发展最快的分析方法之一。
1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。
1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。
1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。
1988~1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。
短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶,抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。
CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。
CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。
二者之间的差异在于:CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快;对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多;CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl 级, 流动相则需几百毫升乃至更多;但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。
CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多;检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测;一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近;CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。
总之, CE的优点可概括为三高二少:高灵敏度, 常用紫外检测器的检测限可达10-13~10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19~10-21mol;高分辨率, 其每米理论塔板数为几十万;高者可达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万;高速度, 最快可在60s内完成, 在250s内分离10种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子;样品少, 只需nl (10-9 L)级的进样量;成本低, 只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。
高效毛细管电泳(WY)
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4.2 电渗流
1.电渗流现象
当固体与液体接触时,固体表面由于某种原因带一种电荷,则因静 电引力使其周围液体带有相反电荷,在液-固界面形成双电层,二者 之间存在电位差。 当液体两端施加电压时,就会发生液体相对于固体表面的移动,这种 液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。
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3.HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质:
内表面带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极;
内表面带正电荷,溶液带负电荷,电渗流流向阳极; 石英毛细管;带负电荷,电渗流流向阴极;
改变电渗流方向的方法:
(1)毛细管改性 表面键合阳离子基团;
(2)加电渗流反转剂
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4. 柱恒温系统
毛细管电泳操作中柱温的影响包括两个方面:
一是焦耳热上升,导致峰形、柱效及分离度恶化 二是温度波动导致分析结果重现性差 毛细管的温控方式一般有气体、液体和固体控温
三种,其装臵的复杂程度依次加大,但控温效果也 依次提高。
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1、气冷恒温
通常指通过空调控制环境温度或是在分离室内用风扇等来达到强制 对流散热效果,加速毛细管外壁的热交换,从而实现温度控制。气冷 控温系统容易实现,不影响分离操作,但控温效果不是十分理想。 2、液冷恒温 将毛细管臵于一恒温液体中,能实现比较精确的温度控制。一般选 用水、煤油或是氟代烷烃等作为冷却介质。冷却介质一般由专门的制 冷系统冷却或恒温,通过一定的路径进行循环。液冷控温方法对毛细 管和仪器设计的要求比较高,需要系统有很好的密封性、电绝缘性和 安全保护设计。 3、固体温控
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毛细管电泳的发展历史中文摘要本文简要的回顾了毛细管电泳的发展历史,对其发展和应用现状进行概述,并对未来的发展提出一些设想,作为我们研究课题的重点,特别对毛细管电泳安培检测技术进行了较为详细的评述。
从电导检测、电位检测和安培检测的三种方法用于毛细管电泳这项分离技术的发展过程,到基础理论的研究、检测池的设计与改进、电极的改进及其应用的简单介绍到未来的发展动向等方向逐一涉及,一般的药物、氨基酸和糖类的分析到目前应用的热点进行了综述。
从毛细管电泳安培检测技术需要进一步完善和发展考虑,提出了本论文的设想,在毛细管电泳安培检测的方法学研究及其在药物分析中的应用方面做出一些有意义的工作。
鉴于在毛细管电泳安培检测技术中,用于分离的高压电场对安培检测有着严重干扰,影响检测的灵敏度,而且分离毛细管与工作电极对接也存在一定困难等原因,前人已做了大量的研究工作,并提出了种种解决办法,但还存在不尽如人意的地方。
在原有的工作基础上,我们进一步进行了毛细管电泳安培检测的研究工作,设计制作了一种高压电场隔离接口和相应的安培检测池,并对工作电极进行了改进,兹将主要研究内容报告如下:第一部分概述了毛细管电泳的发展历史,对电导检测、电位检测特别是安培检测的基本原理及其应用工作进行了详细介绍,指出了三种检测技术的优缺点,以及人们为降低噪音、提高检测度方面所做的一些工作,最后还简单介绍了本文的目的、意义和内容。
第二部分设计制作了一种电场隔离接口和安培检测池,并对检测电极做了进一步改进。
对高压电场隔离接口的强度、稳定性、平衡时间、导电效率及隔离电场性能等进行了详细的研究。
结果表明:该接口稳定,隔离电场效果好,可以满足实际工作的需要;制作的安培检测池可以解决分离毛细管与工作电极对接困难的问题,其工作电极可以方便的插入分离毛细管而不碰壁。
组装了一套毛细管电泳安培检测系统,并利用该系统分离检测了三中种对苯二酚,结果令人满意。
此外,我们通过对电极的改进,削弱了在毛细管电泳安培检测中存在的峰扩展现象,进一步提离了分离效率。
第三部分在自组装的毛细管电泳安培系统上,进行了毛细管电泳安培检测在药物分析中的方法学研究,建立了此种药物的毛细管电泳安培检测方法。
1. 用毛细管电泳安培检测法同时测定了银黄注射液中氯原酸与黄芩苷的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到了较优化的实验条件。
以直径为100μm的铜微电极为工作电极,于电极电位+0.8V(vs.Ag/Ag CI)处,40mmoI/L的Na2B407(pH值为13.4)min为缓冲溶液时, 氯原酸与黄苓苷在12min内得到良好的分离. 氯原酸与黄苓苷分别在5.0×10-3~0.5mg/mL浓度范围内与电泳峰电流呈良好的线性关系, 检测下限分别为1.0×10-4mg/ml和5.0×10-5mg/ml。
2. 用毛细管电泳安培检测同时测了复方芦丁片中芦丁和抗坏血酸的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到优化的条件。
以直径为50μm的碳纤微电极为工作电极,电极电位在+0.8V(vs.Ag/AgCI), 40mm oI/L的Na2B407-H3BO3(pH值为7.5)为缓冲溶液时, 芦丁和维生素C在10min内得到了良好的分离, 芦丁和维生素C分别在5.0×10-8~5.0×10-4g/mL、8.0×10-8~5.0×10-4g/mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系,其检测下限分别为2.0×10-8g/mL、5.0×10-8g/mL。
3.用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药连翘中连翘苷与芦丁的含量,研究了各种实验效果的影响,得到了优化的实验程序。
以直径50μm的碳纤维微电极为工作为电极,电极电位在+1.2V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI /L的Na2B407-H3BO3(pH值为8.4)+40mmoI/LSDS为缓冲溶液时, 芦丁和连翘中连翘苷在10min内得到了良好的分离. 芦丁和连翘苷分别在为1.0×10-3m g /mL和5.0×10-4m g /mL.4、用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药槐花中芦丁和槲皮素的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到了优化的实验步骤。
以直径为50μm的碳纤维微电极为工作电极,检测电位为+1.2V(vs.Ag/AgC I), 20mmoI/L的Na2B407-(pH值为8.4)+40mmoI/LSDS为缓冲溶液时,芦丁和连翘在10min内得到良好的分离。
芦丁和连翘苷分别在5.0×10-3~0.5m g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系,检测下限分别为1. 0×10-4m g /mL和5.0×10-5m g /mL.5 、用毛细管电泳安培检测法同时测定丹参注射液中丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到了优化的实验条件。
以直径为50μm的碳纤维电极为工作电极,电极电位+0. 8V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI/L的Na2B407-(pH值为8.4)+40mmoI/LSDS为缓冲溶液. 在此条件下, 丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸在10min内得到良好的分离。
丹参素、原儿茶醛和原儿茶酸分别在0.01~0.2m g /mL、0.002~0. 1m g /mL和0.002~0.1m g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好的线性关系,检测下限分别为0.002、0.00 1和0.001m g /mL。
6、用毛细管电泳安培法同时测定了中药天麻中天麻素,对羟基苯甲醇和香草醛的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到了优化的实验条件。
以直径为50μm的碳纤维微电极为工作电极,电极电位为+ 1.0V(vs.Ag/AgCI), 20mmoI/L的Na2B407-(pH值为8.4)+30mmoI/L胆酸钠为缓冲溶液时,天麻素、对羟基苯甲醇和香草醛在12min内到了良好的分离。
天麻素、对羟基苯甲醇和香草醛分别在0.020~0.5、0.031~0.5和0.025~ 5.0 m g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈现良好线性关系,检测下限分别为0.005、0.01和0.006 m g /mL 。
7、用毛细管电泳安培检测法同时测定了中药儿茶中儿茶素和表儿茶素的含量,研究了各种实验条件对分离效果的影响,得到了优化的实验条件。
以直径50μm的碳纤维微电极为工作电极,电极电位为+0.9V(vs.Ag/A gCI), 20mmoI/L的Na2B407-(pH值为8.8)+80mmoI/L SDS为缓冲溶液时, 儿茶素和表儿茶素在10min内得到了良好的分离.儿茶素和表儿茶素分别在5.0×10-2~1.0m g /mL和5.0×10-2~2.0m g /mL浓度范围内与电泳峰电流呈良好线性关系, 检测下限分别为0.02m g /mL和0.01m g /mL。
通过以上工作,证明所设计的高压电场隔离接口和安培检测池能够满足实际工作需要,希望能对毛细管电泳安培检测方法学的研究起到一定的促进作用,对安培检测技术的发展有一定的帮助。
第一节毛细管电泳的历史与发展传统的电泳作为一种分离技术,是根据在电场作用下,不同的溶质由于其不同的迁移速率,以不同的迁移速度向其所带电荷的相反方向移动,从而使得不同的溶质得以分离的方法.而毛细管电泳(CE)又称之为高效毛细管电泳(HPCE),则是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术,其迅速发展于二十世纪八十年代后期。
CE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容,是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展,它使得分离分析科学从微升级水平进入到纳升级水平,并使得单细胞的分析,乃至单分子的分析成为可能。
与此同时,也使长期困扰我们的生物大分子如糖类、蛋白质等的分离分析,因为CE的产生和迅速发展而有了新的转机。
一.历史的简单回顾溶液中荷电粒子在电场中的泳动现象,早在19世纪初就已被发现[1],与色谱工作一开始就作为分析方法来研究不同,电泳在Michaelis[2]关于酶的鉴别工作之前,只是作为一种物理化学现象来研究。
在十九世纪中叶,对溶液中荷电离子的电场作用下的泳动现象,Wiedemann和Buff[3,4]开始进行研究,后来在实验的基础上,Kohlrausch[5]导出了离子移动的理论公式,描述了包括区带电泳,等速电泳和移动界面电泳在内的电泳基本理论,电泳在真正意义上进入分析化学是在Sverdberg和Tiselius[6]的开拓性研究之后,他们在1926年提出了移动界面电泳技术。
然而,只是在Tiselius[7,8]公布了移动界面电泳技术的细节之后,电泳技术才开始得到较为迅速的发展,并成为生物医学的基础研究手段之一,成功的应用于人血清的分离,获得了血清白蛋白等。
毛细管电泳发展的历史相当悠久,其发展可以追溯到二十世纪六十年代中期,瑞典科学家Hjerten[9]首先用内径为3mm的石英毛细管进行了电泳分离。
后来,Mikkers等[10]首先从理论上研究了电场聚焦现象及其对分离区带扩展的影响,随后在实验上用200μm内径的聚四氟乙烯管实现了高效电泳分离,这项研究成为CZ E发展史上的第一个重大突破。
从二十世纪八十年代初开始,Jorgenson等[11,12]使用更细的毛细管及内径为75μm的熔融石英管做CZE,在30kV电压下每米毛细管的效率高达4×105的理论塔板数,这一开创性的成果成为毛细管电泳发展历史上的一个里程碑,从此,毛细管电泳技术开始了突飞猛进的发展。
二.毛细管电泳技术的发展1.分离模式的发展传统的电泳模式只能用于荷电离子的分离。
1984年,Terabe[13]等在CE电解质溶液中加入离子表面活性剂,在溶液中形成离子胶束作假固定相,实现了中性离子的分离,这种模式称为胶束电动色谱(micellar elect rokinetic chromatography,MEKC),此后,又相继发展了环糊精EKC,微乳胶EKC等[14,15],目前,ME KC已成为应用非常广泛的电泳模式之一。
1983年,Hjerten[16]首先将聚丙烯酰胺凝胶毛细管用于CE分析,发展了毛细管凝胶电泳(capillary elect rophoresis,CGE)。
CGE具有极高的分辨本领,可用于蛋白质碎片的分离及DNA序列的快速分析。
此后,随着毛细管电泳研究的深入,其它分离模式如毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,CI EF)[17],毛细管等速电泳,毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)[18,19]等分离模式不断引入,极大的拓宽了毛细管电泳技术的应用范围。