乳酸乳球菌电转化方法的优化
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
菌 中进行复制 ， 质粒大小为 ３ ． ６ １ ｋ ｂ ， 由强启动子 Ｐ ３ ２及其 下
收稿 日期 ： ２ ０ １ ３— ０ １—１ ７ 基金 项 目： 农业 部 转基 因生 物 新 品种 培育 重 大专 项 （ 编 号：
低， 而 电转化法则具有省 时、 简便 、 受体范围广泛等优点 ， 已成 为 目前乳酸菌转化 的主导方法 。然而影响电转化效率 的因素
电阻 、 细菌生长 时期 及电击缓 冲液 等影 响电转化的因素入手 ， 根据 每微 克 Ｄ Ｎ Ａ获得 的转化子 的多少 ， 评 价乳 酸乳球菌 的 电转化效率 。结果显示 ： 当电压 为 ２ ． ０ ｋ Ｖ、 电阻为 ４ ０ ０ Ｑ、 细菌处 于对数生 长中期 、 电击 缓冲液为磷 酸缓冲液 时 ， 电
击乳酸乳球菌 Ｍ Ｇ １ ３ ６ ３ 的转化效率最高 ， 为１ ３ ０ ０个／ ｇ 。表 明通过优 化 电转 化参数 ， 可 以提高乳酸乳 球菌 的转化效
率， 为拓展乳酸乳球 菌的应用范围奠定基础 。 关键词 ： 乳 酸乳 球菌 ； 电转化 ； 电压／ 电阻 ； 生长时期 ； 电击缓 冲液
Ｅ—ｍ ａ ｉ ｌ ： ｗ ｇ ｊ ｐ ｈ ｄ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｎ 。
Ｇ Ｍ１ ７液体培养基 ： 分别 称取 大豆蛋 白胨 ５ ｇ 、 胰 蛋 白胨 ５ ｇ 、 酵母浸提物 ２ ． ５ ｇ 、 维生素 Ｃ ０ ． ５ ｇ 、 Ｍｇ Ｓ Ｏ ４ ０ ． ２ ５ ｇ 、 磷酸氢
Hale Waihona Puke 事动物发育生物 学研 究。Ｔ ｅ ｌ ： （ ０ ２ ５ ） ８ ４ ３ ９ ０ ３ ４ １ ； Ｅ— ｍ ａ ｉ ｌ ： ｊ ｉ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ ｙ ｕ
＠ｙ ａ ｈｏ ｏ ． ｃ ｏ ｎ． ｒ ｅ ｒ ｌ 。
１ ． １ 培 养 基 的 配制
通信作者 ： 王公金， 博士， 研究员， 主要从事动物胚胎工程研究。
．－—
—
３ ４． － — —
江苏农业科学
２ ０ １ ３年第 ４ １ 卷第 ８期
于建 宁， 宋小敬 ， 王公金 ， 等．乳酸乳球 菌电转化方法 的优化［ Ｊ ］ ． 江苏农业科学， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ ８ ） ： ３ ４— ３ ６
乳 酸乳球菌 电转化方法 的优化
于建宁 ， 宋小敬 ， 王公金 ， 潘伟芹 ， 徐小波 ， 于峰祥 ， 李 燕
乳球 菌的电转化方法 ， 为后期 乳酸菌 的深入 研究和广 泛应用
奠定 基 础 。 １ 材 料 与 方 法
２ ０ １ １ Ｚ Ｘ ０ ８ ０ ０ ６一 Ｏ Ｏ ４ ） ； 江苏 省 农业 科 技 自主创 新 资金 ［ 编号 ： Ｃ Ｘ
（ １ Ｏ ） ４ ２ １ ］ 。 作者简介 ： 于建宁 （ １ ９ ８ Ｏ 一） ， 女， 山东烟台人 ， 博士 ， 副研究 员， 主要从
较 晚。但是近年来 ， 随着乳酸菌各类表达调控元件的分离 ， 相 继发展 了一 批 适 用 于 乳 酸 菌 的 克 隆 载 体 与 表 达 载 体 。 ｐ Ｍ Ｇ ３ ６ ｅ是最 常用 于乳酸乳 球菌 的一 种表达 型质 粒 ， １ ９ ８ ９年 由Ｖ ａ ｎ ｄ ｅ ｒ 等学者构建成功 ， 可在大肠杆菌 （ Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ ） 与乳酸
中图分类号 ： Ｑ ９ ３ ９ ． ９ 文献标志码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） Ｏ ８— ０ ０ ３ ４— ０ ３
乳酸菌 （ １ ａ ｃ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ， Ｌ Ａ Ｂ ） 是一类广泛分布于 自然
界， 在工业、 农业和医学等领域 与人类生活密切相关 ， 微好 氧，
游的部分开放 阅读框 、 多克隆位点 、 来 自乳酸乳球菌乳脂亚种 蛋白酶基 因的转录终止子及 Ｐ ＷＶ ０ １复制子 、 红霉素抗性基因 Ｅ ｍ ｒ 等组成 。近来 ， 科研工 作者 以 ｐ Ｍ Ｇ ３ ６ ｅ为基 本质粒 进行 了很 多改造 ， 如加上 ｌ ａ ｃ Ｚ基 因、 Ｎ ｓ ｒ 基 因、 Ｎ ｉ ｓ ｉ ｎ基 因等 ， 替代 原有 的红霉素抗性 ， 使该质粒得到了更深入 的应用 。
由 于乳 酸 乳 球 菌 属 于 革 兰 氏 阳 性 菌 ， 具 有 厚 且 致 密 的 刚
能够发酵碳水化合物 、 产生乳酸 的革 兰氏阳性菌 。乳酸 菌包
括乳球菌和乳杆 菌， 其 中乳 酸乳球 菌 （ Ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ ） 是乳 球菌属 （ Ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ） 中最重要 、 最典 型的一个种 ， 乳酸乳 球菌 为兼性 厌氧的革 兰氏阳性球菌 ， 细胞对称生长 ， 因易 于培 养、 生长迅速等优点而成为表达外 源基 因的理想菌株 ， 因此 常作
（ １ ． 江苏省农业科学院畜牧研究所 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ １ ４ ； ２ ． 山东省荣 成市畜牧兽 医局 ， 山东荣成 ２ ６ ４ ３ ０ ０ ； ３ ． 南京师范 大学 医学分子生物学重点实验室 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ ９ ７ ）
摘要 ： 乳酸菌转化效率不 高是 制约其广泛应用的关键 因素 。为建立乳酸乳球 菌 的高效 电转化方法 ， 主要从 电压 、
性细胞壁 ， 常规的化 学方法无法使 外源 Ｄ Ｎ Ａ进人 受体 细胞 。 目前 ， 乳酸菌转化外 源 Ｄ Ｎ Ａ的方法主要有原生质体转化法和
电转化法 。原生 质体转 化法操 作繁 琐、 耗 时较 长 、 转 化效 率
为乳酸菌基 因工程受体菌的标 准菌株 。与 目前 日益完善的大
肠杆菌 、 酵母菌 表达 系统相 比， 乳酸菌 的分子生物学研究起始
较多， 如乳 酸菌是否经过前期处理 （ 甘氨 酸、 溶菌 酶、 醋酸锂 、
Ｄ Ｔ ｒ等）
、 乳酸菌所处 的生长周期及 电转化 的参数都会对
转化效率产生重要影响 。因此 ， 本试验 以乳 酸乳球 菌为研
究对象 ， 从 影响电转化效率的几个因素人手 ， 探讨常用乳酸菌
质粒 ｐ ＭＧ ３ ６ ｅ 转化到乳 酸乳球菌 中的效率 ， 建立 并优化 乳酸
收稿 日期 ： ２ ０ １ ３— ０ １—１ ７ 基金 项 目： 农业 部 转基 因生 物 新 品种 培育 重 大专 项 （ 编 号：
低， 而 电转化法则具有省 时、 简便 、 受体范围广泛等优点 ， 已成 为 目前乳酸菌转化 的主导方法 。然而影响电转化效率 的因素
电阻 、 细菌生长 时期 及电击缓 冲液 等影 响电转化的因素入手 ， 根据 每微 克 Ｄ Ｎ Ａ获得 的转化子 的多少 ， 评 价乳 酸乳球菌 的 电转化效率 。结果显示 ： 当电压 为 ２ ． ０ ｋ Ｖ、 电阻为 ４ ０ ０ Ｑ、 细菌处 于对数生 长中期 、 电击 缓冲液为磷 酸缓冲液 时 ， 电
击乳酸乳球菌 Ｍ Ｇ １ ３ ６ ３ 的转化效率最高 ， 为１ ３ ０ ０个／ ｇ 。表 明通过优 化 电转 化参数 ， 可 以提高乳酸乳 球菌 的转化效
率， 为拓展乳酸乳球 菌的应用范围奠定基础 。 关键词 ： 乳 酸乳 球菌 ； 电转化 ； 电压／ 电阻 ； 生长时期 ； 电击缓 冲液
Ｅ—ｍ ａ ｉ ｌ ： ｗ ｇ ｊ ｐ ｈ ｄ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｎ 。
Ｇ Ｍ１ ７液体培养基 ： 分别 称取 大豆蛋 白胨 ５ ｇ 、 胰 蛋 白胨 ５ ｇ 、 酵母浸提物 ２ ． ５ ｇ 、 维生素 Ｃ ０ ． ５ ｇ 、 Ｍｇ Ｓ Ｏ ４ ０ ． ２ ５ ｇ 、 磷酸氢
Hale Waihona Puke 事动物发育生物 学研 究。Ｔ ｅ ｌ ： （ ０ ２ ５ ） ８ ４ ３ ９ ０ ３ ４ １ ； Ｅ— ｍ ａ ｉ ｌ ： ｊ ｉ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ ｙ ｕ
＠ｙ ａ ｈｏ ｏ ． ｃ ｏ ｎ． ｒ ｅ ｒ ｌ 。
１ ． １ 培 养 基 的 配制
通信作者 ： 王公金， 博士， 研究员， 主要从事动物胚胎工程研究。
．－—
—
３ ４． － — —
江苏农业科学
２ ０ １ ３年第 ４ １ 卷第 ８期
于建 宁， 宋小敬 ， 王公金 ， 等．乳酸乳球 菌电转化方法 的优化［ Ｊ ］ ． 江苏农业科学， ２ ０ １ ３ ， ４ １ （ ８ ） ： ３ ４— ３ ６
乳 酸乳球菌 电转化方法 的优化
于建宁 ， 宋小敬 ， 王公金 ， 潘伟芹 ， 徐小波 ， 于峰祥 ， 李 燕
乳球 菌的电转化方法 ， 为后期 乳酸菌 的深入 研究和广 泛应用
奠定 基 础 。 １ 材 料 与 方 法
２ ０ １ １ Ｚ Ｘ ０ ８ ０ ０ ６一 Ｏ Ｏ ４ ） ； 江苏 省 农业 科 技 自主创 新 资金 ［ 编号 ： Ｃ Ｘ
（ １ Ｏ ） ４ ２ １ ］ 。 作者简介 ： 于建宁 （ １ ９ ８ Ｏ 一） ， 女， 山东烟台人 ， 博士 ， 副研究 员， 主要从
较 晚。但是近年来 ， 随着乳酸菌各类表达调控元件的分离 ， 相 继发展 了一 批 适 用 于 乳 酸 菌 的 克 隆 载 体 与 表 达 载 体 。 ｐ Ｍ Ｇ ３ ６ ｅ是最 常用 于乳酸乳 球菌 的一 种表达 型质 粒 ， １ ９ ８ ９年 由Ｖ ａ ｎ ｄ ｅ ｒ 等学者构建成功 ， 可在大肠杆菌 （ Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ ） 与乳酸
中图分类号 ： Ｑ ９ ３ ９ ． ９ 文献标志码 ： Ａ 文章编 号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ３ ） Ｏ ８— ０ ０ ３ ４— ０ ３
乳酸菌 （ １ ａ ｃ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ， Ｌ Ａ Ｂ ） 是一类广泛分布于 自然
界， 在工业、 农业和医学等领域 与人类生活密切相关 ， 微好 氧，
游的部分开放 阅读框 、 多克隆位点 、 来 自乳酸乳球菌乳脂亚种 蛋白酶基 因的转录终止子及 Ｐ ＷＶ ０ １复制子 、 红霉素抗性基因 Ｅ ｍ ｒ 等组成 。近来 ， 科研工 作者 以 ｐ Ｍ Ｇ ３ ６ ｅ为基 本质粒 进行 了很 多改造 ， 如加上 ｌ ａ ｃ Ｚ基 因、 Ｎ ｓ ｒ 基 因、 Ｎ ｉ ｓ ｉ ｎ基 因等 ， 替代 原有 的红霉素抗性 ， 使该质粒得到了更深入 的应用 。
由 于乳 酸 乳 球 菌 属 于 革 兰 氏 阳 性 菌 ， 具 有 厚 且 致 密 的 刚
能够发酵碳水化合物 、 产生乳酸 的革 兰氏阳性菌 。乳酸 菌包
括乳球菌和乳杆 菌， 其 中乳 酸乳球 菌 （ Ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｓ ） 是乳 球菌属 （ Ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ） 中最重要 、 最典 型的一个种 ， 乳酸乳 球菌 为兼性 厌氧的革 兰氏阳性球菌 ， 细胞对称生长 ， 因易 于培 养、 生长迅速等优点而成为表达外 源基 因的理想菌株 ， 因此 常作
（ １ ． 江苏省农业科学院畜牧研究所 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ １ ４ ； ２ ． 山东省荣 成市畜牧兽 医局 ， 山东荣成 ２ ６ ４ ３ ０ ０ ； ３ ． 南京师范 大学 医学分子生物学重点实验室 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ ９ ７ ）
摘要 ： 乳酸菌转化效率不 高是 制约其广泛应用的关键 因素 。为建立乳酸乳球 菌 的高效 电转化方法 ， 主要从 电压 、
性细胞壁 ， 常规的化 学方法无法使 外源 Ｄ Ｎ Ａ进人 受体 细胞 。 目前 ， 乳酸菌转化外 源 Ｄ Ｎ Ａ的方法主要有原生质体转化法和
电转化法 。原生 质体转 化法操 作繁 琐、 耗 时较 长 、 转 化效 率
为乳酸菌基 因工程受体菌的标 准菌株 。与 目前 日益完善的大
肠杆菌 、 酵母菌 表达 系统相 比， 乳酸菌 的分子生物学研究起始
较多， 如乳 酸菌是否经过前期处理 （ 甘氨 酸、 溶菌 酶、 醋酸锂 、
Ｄ Ｔ ｒ等）
、 乳酸菌所处 的生长周期及 电转化 的参数都会对
转化效率产生重要影响 。因此 ， 本试验 以乳 酸乳球 菌为研
究对象 ， 从 影响电转化效率的几个因素人手 ， 探讨常用乳酸菌
质粒 ｐ ＭＧ ３ ６ ｅ 转化到乳 酸乳球菌 中的效率 ， 建立 并优化 乳酸