2种光生物反应器在微藻培养中的性能比较

第23卷第1期烟台大学学报(自然科学与工程版)Vol .23No .12010年1月Journal of Yantai University (Natural Science and Engineering Editi on )Jan .2010 文章编号:1004-8820(2010)01-0032-06 收稿日期:2008-03-21 基金项目:国家十五重点科技攻关项目(2001BA707B03);农业部辽宁省海水增养殖与生物技术重点实验室开放课题项目(K2006-03);烟台市科技攻关计划项目(2009219). 作者简介:孙利芹(1973-),女,山东烟台人,博士,副教授,主要从事生物化工领域的教学和科研工作;通讯联系人:王长海(ch wang2001@sina .com ),教授,博士生导师.2种光生物反应器在微藻培养中的性能比较孙利芹1,2,王长海2,史　磊1(1.烟台大学海洋学院,山东烟台264005;2.大连理工大学生物科学与工程系,辽宁大连116024)摘　要:对自主研发的平板式光生物反应器和柱状气升式内环流光生物反应器的主要性能参数进行了测定,以纤细角毛藻为培养对象对两者性能进行了综合评价.结果表明:平板式光生物反应器具有高的液体循环速度和相对较小的光衰减程度,更有利于藻体细胞对光的吸收,纤细角毛藻的培养密度和生长速率分别达到6.98×108/mL 和1.42/d,并且操作简单、容易放大,适合于微藻的规模化高密度培养;柱状气升式内环流光生物反应器培养效率相对较低,纤细角毛藻的培养密度和生长速率仅为1.52×108/mL 和0.935/d,但其培养环境稳定、主要培养参数容易控制,可实现无菌化纯培养,在探索微藻生长动力学、优化微藻培养条件和转基因微藻的培养等方面具有优势.因此在微藻培养时应根据实际的应用目的不同选择适合的光生物反应器.关键词:光生物反应器;微藻;性能参数;应用比较中图分类号:Q949 文献标识码:A 海洋微藻为光合自养生物,在其生长过程中如何提高微藻细胞对光能和营养物质的利用效率是微藻高密度培养的关键问题.微藻细胞对光的利用效率受到入射光强度、光照时间、光生物反应器形状、材质等因素的影响,其中光生物反应器因其几何形状的不同,决定了光暗循环时间、光衰减程度等性能参数的不同,从而影响了细胞对光的利用效率.传统的海洋微藻培养多采用开放式培养系统,存在培养条件难以控制、生产周期受季节限制、易受污染等不可克服的缺点,其培养效率和所获产品的附加值均较低.自20世纪50年代以来人们将开发的重点转向密闭式光生物反应器的研制,尤其是1983年Pirt 等人的开创性研究工作为光生物反应器的设计、运转原理及生物工程原理奠定了基础,继其之后各种新型的密闭式光生物反应器如搅拌罐式、板式、管式等反应器相继问世,呈现出良好的发展势头,并成功用于盐藻、紫球藻、雪藻等的培养[1-6].但与传统生物反应器及发酵工业相比,光生物反应器的研制开发尚处于初级研究阶段,尤其是其应用研究涉及面较窄,仅局限于少数几种微藻,并且在微藻高密度培养技术方面缺少完整、系统的研究[7].本研究在自行研制的柱状气升式内环流光生物反应器基础上,又开发出平板式光生物反应器,并将其用于海洋微藻的培养.本文旨在对2种光生物反应器的主要性能进行比较,并对其用于微藻培养的特点进行评价,为2种光生物反应器能更好地用于海洋微藻的培养和工业化生产提供理论依据.1　材料与方法　第1期孙利芹,等:2种光生物反应器在微藻培养中的性能比较1.1　藻种纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis ),原种购于中国海洋大学微藻种质库,经本实验室活化后用于实验藻种.1.2　培养基采用本实验室优化的培养基配方:Na 2Si O 3・9H 2O 012g /L;Na NO 3110g/L;NaHCO 30115g/L;KH 2P O 40.02g/L;V B1217mg/L;V B12115μg/L;f/2微量元素1mL,无菌海水配制.1.3　微藻生物量的测定藻体细胞计数:培养液经适当稀释后以血球计数板计数,每个样品计6次后取平均值.比生长速率的测定[1]:比生长速率计算公式:K =21303(lg N -lg N 0)/t .1.4　反应器主要性能参数的测定1.4.1　液体循环时间的测量　液体循环时间的测定采用双pH 电极,脉冲注入适量的20%H 2S O 4或30%Na OH,根据pH 电极的响应曲线,重复6次,计算液体的平均循环时间(t c ).1.4.2　液体循环速度的测量　液体循环速度根据通气率和测得的液体平均循环时间计算得到.1.4.3　光衰减的测量　采用水下照度计(Z DS -10型),将照度计水下探头放到培养液内部与入射光垂直的截面上的不同水平点测量3次,取光照强度的平均值.1.5　反应器的主要结构特点及装置简图42L 柱状内环流气升式光生物反应器(AL 2CBR )的结构特点为:①整体为玻璃-不锈钢结构,耐酸和碱的腐蚀、可全方位接受光照,具有pH 、温度和溶解氧自动调节、监控和记录的功能;②可进行完全灭菌,实现藻体的纯培养.反应装置简图见图1.图1　42L 柱状光生物反应器Fig .1　42L colu mnar phot obi oreact or30L 平板式光生物反应器(FPP BR )的结构特点为:①反应器材质为有机玻璃,透光性能良好、可全方位接受光照,具有pH 、温度和CO 2自动调节、监控和记录的功能,光源外置,光辐照可在任意范围内进行调节;②反应器灭菌采用稀盐酸处理;③反应器整体结构简洁、呈扁平垂直立体式,装拆方便,便于清洗.装置流程图见图2.图2　30L 平板式光生物反应器Fig .2　30L flat 2p late phot obi oreact or2　结果分析2.1　通气速率与液体循环时间、循环速度的关系以海水为介质,在不同的通气条件下,对柱状气升式内环流光生物反应器的液体循环时间和循环速度进行测定,结果见图3.图3　内环流反应器中通气速率,液体循环时间和循环速度的关系Fig .3　Relati onshi p bet w een aerati on rate,circulati on ti m eand liquid fl o w vel ocity in internal l oop phot obi oreact or因该类型反应器的结构限制,其通气量可选择的范围较窄.实验中通气量可维持在1～12L /m in 范围内.由图3可见,随着通气量的增加液体的循环时间逐渐减小,并且,当通气量增加到5L /m in 时,液体循环速度和循环时间变化趋势则明显趋于平稳,即通气量的增加对液体循环时间33烟台大学学报(自然科学与工程版)第23卷　的影响减小.这表明当通气量较高时,由于随着循环速度的增加液体循环的阻力也不断增大,液体循环速度的增加较缓慢,当通气量为12L /m in 时,液体循环速度达到最大.根据所测数据得出该反应器液体循环时间(t c )与通气量(X )之间的关联式为t c =15.5X -0.0125.(1)液体循环速度V c 与通气量(X )的关联式为V c =-e-5X 2+0.0035X +0.148.(2) 与柱状气升式内环流光生物反应器不同,平板式光生物反应器的结构相对简洁,可选择通气量的范围比较宽广;考虑到实际微藻培养过程中大的通气流速形成的机械剪切力可能对藻细胞造成一定的损伤,因此,本实验将通气量限制1～19L /m in 范围内.从图4可见,通气量1～5L /m in 范围内,液体循环时间和循环速度与通气量几乎成直线相关性,当通气量为11L /m in 时,液体循环速度和循环时间的变化基本趋于平稳,通气量的增加对液体循环时间的影响逐渐减弱.当通气量为19L /m in 时,液体循环速度达到最大值.平板式光生物反应器中液体循环时间(t c )、液体循环速度(V c )和通气量(X )之间的关系也可用下述方程式来表示:t c =2.47X -0.834,(3)V c =-0.42X4+1.49X 3-1.20X 2+0.90X +0.14.(4)图4　平板反应器中通气速率,液体循环时间和循环速度的关系Fig .4　Relati onshi p bet w een aerati on rate,circulati on ti m eand liquid fl ow vel ocity in flat p late phot obi oreact or在海洋微藻培养过程中,单个细胞接受光照的时间和在培养介质中的运动速度是其生长的主要限制性因素,而这两者与培养液在反应器中的循环时间、循环速度和通气量大小有直接关系.通过对比2种结构的气升式光生物反应器中三者的关系发现,在单位体积通气速率相同的情况下,在平板反应器中的液体循环时间要少于在柱状气升式内环流光生物反应器中的时间,以通气比为012vv m (平板反应器按装液量为25L,通气量为5L /m in 计算,柱状反应器按装液量为40L,通气量8L /m in 计算,以下同)为例,平板反应器中的液体循环时间和循环速度分别是5148s 和0148m /s,分别比后者少3917%和4117%.而且,由于具有简单的平面式结构使得在同等气体压力下,平板反应器中的通气量更容易被提高,本实验条件下很容易达到19L /m in,而同等条件下由于柱状气升式内环流光生物反应器中大液体流动阻力的限制使其难以获得高的通气量,最终导致液体循环时间的增加.这说明在介质相同的情况下,反应器几何结构间的差异是影响液体循环时间和循环速度的重要因素之一.2.2　光衰减程度的比较为了考察光在2种反应器中的衰减情况,分别将纤细角毛藻稀释成不同浓度梯度,在入射光强度为310mW /c m 2,通气比为012vv m 的条件下,测量光在不同浓度的藻液和不同反应器中的衰减量,每个测量点重复3次,取平均值.结果如图5所示.图5　光在反应器中的衰减规律Fig .5　A ttenuati on rule of light in phot obi oreact or由图5可见,随着藻液密度的提高,光在2种反应器中呈现出不同程度的衰减,且在低的藻细胞密度时,光在2种反应器中的衰减程度相差不大,但当纤细角毛藻的细胞密度超过4×107/mL43　第1期孙利芹,等:2种光生物反应器在微藻培养中的性能比较时,光在平板反应器中由初始入射光强310mW /c m 2衰减到1.24mW /c m 2,衰减率为59%,而同样情况下光在柱状内环流反应器中的衰减率为78%.当细胞密度增大到1.6×108/mL 时,光在柱状内环流反应器中的光照强度衰减到0.165mW /c m 2,而同样的光照强度下,纤细角毛藻在平板式反应器中的细胞密度可以达到315×108/mL,这说明在高的细胞密度下,平板式光生物反应器更能保持相对高的透光性,从而保证细胞能够有效地进行光合作用,有利于藻细胞密度的提高.2.3　2种光生物反应器在微藻培养中的应用在其他培养条件相同的实验条件下(温度23～25℃,pH 715～815,通气比012vv m ,初始接种密度1×107/mL,培养周期10d ),以纤细角毛藻的培养为例,考察了2种光生物反应器中光照强度对纤细角毛藻生长的影响,结果如图6.图6　2种反应器中光照强度对纤细角毛藻生长的影响Fig .6　Effect of light density on cell gr owth of ch .gracilis int w o kinds of phot obi oreact or尽管在2种反应器中纤细角毛藻的生长速率和培养密度均与光照强度成正相关关系,即藻细胞的生长随着光照强度的增加而增加;但培养效率存在着很大的差异.当初始光照强度为513mW /c m 2时,平板光生物反应器中纤细角毛藻培养密度和生长速率达到了4.28×108/mL 和1122/d,分别是柱状气升式内环流光生物反应器中纤细角毛藻培养密度和生长速率的2.85和1140倍.可见,在相同的培养条件下,平板式光生物反应器比柱状气升式内环流光生物反应器有更高的培养效率.图7　2种反应器中通气速度对纤细毛藻生长的影响Fig .7　Effect of aerati on on cell gr owth of ch .gracilis in t w okinds of phot obi oreact ors在同等实验条件下(温度23～25℃,pH 715～815,光照强度513mW /c m 2,初始接种密度1×107/mL,培养周期10d ),考察了2种光生物反应器中通气速率对纤细角毛藻生长的影响.由图7可见,在不同的反应器中,通气速率对微藻生长的影响是不一致的.柱状气升式内环流光生物反应器中,随着通气速率的增加,微藻的生长速度和细胞密度随之增加,当通气速率为9L /m in 时,微藻细胞的生长均达到最大值,此时纤细角毛藻培养密度和生长速率分别为1152×108/mL 和01935d -1;而平板光生物反应器中,纤细角毛藻细胞的生长随着通气速率的增加而迅速增加,当通气速率为15L /m in 时,培养密度和生长速率分别达到了6.98×108/mL 和1142d -1,分别是柱状气升式内环流光生物反应器中纤细角毛藻培养密度和生长速率的4159和1152倍.由此进一步说明平板式光生物反应器比柱式内环流气升式光生物反应器具有更高的培养效率.2.4　2种反应器的性能比较根据2种光生物反应器的主要参数及其在纤细角毛藻培养中的应用,结合反应器自身的结构特点,对2种光生物反应器的性能作出综合的评价见表1.平板式光生物反应器具有光径小、A /V 比高和L /D 低的特点,可以获得高的培养效率,而且由于该光生物反应器结构简单,可以很容易根据需要进行无限性地放大,适合微藻的工业化大规模培养.相比之下,柱状气升式内环流光生物反应器的培养效率相对较低,结构复杂,放大困难,但53烟台大学学报(自然科学与工程版)第23卷　该类型的光生物反应器具有培养环境稳定,无菌化程度高,多种环境参数可以精确定量和控制的特点,在微藻的生长特性、培养条件优化和转基因微藻等基础理论研究方面具有很大的价值.表1　两种类型光生物反应器的性能比较Tab.1　The assess ment of p r operties of t w o type of phot obi oreact ors光生物反应器类型评价项目光径/c m光/暗循环时间(L/D)3/m s采光面积/体积(A/V)/(c m2・L-1)平均培养密度/(108・mL-1)平均生长速率/h-1液体混合方式培养温度控制反应器放大环境参数控制无菌化程度平板式反应器10.04001005～71.29通气鼓泡较难,不稳定容易相对稳定一般柱状内环流反应器16.8(内径)6420(总体)21.40.8～10.87通气内环流容易,稳定难柔和稳定高 3以通气比为012vv m计算.3　讨　论在微藻的高密度培养过程中,由于藻体细胞间的相互遮挡使光线不能透过高密度培养液,使入射光在穿透培养液的过程中存在着不断衰减的现象,距培养表面越远藻体细胞所能接受到的光强就越弱,且培养密度越高这种光衰减现象就越严重.即在与反应器表面垂直的光照方向上,入射光存在着不均匀的梯度分布现象,反应器表面的光照强度最大,而随着培养液深度的增加反应器内部所能接受到的光照强度也就越来越弱,并形成光照表面的“受光区”和远离反应器表面内部的“黑暗区”两个流动的相对稳定区域,使藻体细胞处于类似光/暗循环(L/D)的间歇光照状态.在一定的细胞密度下,每个细胞在受光区每次接受光照的平均时间、在反应器中完成一个循环周期所接受光照的相对时间的长短、是否处于光补偿点以下以及在黑暗区的时间长短直接影响整体培养的效率.因此,光生物反应器的光径、采光面积和体积比(A/V)及光/暗循环时间(L/D)等是影响其性能的主要参数[9-12].JC Merchuk等通过液体循环时间的测量比较了鼓泡式、气升式和气升螺旋管式柱状反应器用于紫球藻培养的效果,结果显示带有螺旋管的气升式反应器由于具有小的液体循环时间和高的通气速率更有利于紫球藻产量的提高[13].Zhang Cheng wu等报道了由100个板式反应器单元组成的平板式光生物反应器系统,用于微藻N anno2 chloropsis sp.的高密度培养,细胞密度达到6×108个/mL,并指出该反应器操作简单,占地面积小,投资费用低,是目前由于大规模密闭式光生物反应器培养微藻投资最少的反应器[14].本论文的研究结果与上述研究相一致,通过对比各种培养参数,两种光生物反应器在微藻培养方面各有优势.42L柱状气升式内环流光生物反应器由于结构限制,相同通气比下液体循环时间较长,而且通气量达到一定程度后不再容易继续增大.但此类反应器具有培养环境稳定,对温度、pH、溶解氧浓度(DO)、液体循环速度、光照强度等各种参数可以精确定量和控制的特点,可实现真正意义上的无菌培养,在探索微藻生长动力学、优化微藻培养条件和转基因微藻的培养等方面具有优势;但是该反应器结构复杂、操作繁琐、难于放大,培养效率相对较低,因此在大规模培养方面没有优势.与柱状气升式内环流光生物反应器相比,30L平板式光生物反应器具有小光径(10c m)、高A/V比(100)和低L/D(<70m s),具有高的培养效率;此外,该类型的反应器结构简洁、可以随意调节放置角度以便使其获得最佳的取光效果,从而可以克服由于培养后期高的细胞密度造成的光衰减程度增大带来的光合作用效率降低的不足,而且容易放大和加工制造、可以根据需要设计不同的光径、操作条件容易控制、占地面积小,使其在微藻的高密度大规模培养方面具有很大的价值.参考文献:[1]　孙利芹,史磊,王长海.平板式光生物反应器在饵料63　第1期孙利芹,等:2种光生物反应器在微藻培养中的性能比较微藻中的应用[J].烟台大学学报:自然科学与工程版, 2007.[2]　刘志伟,余若黔.微藻培养的光生物反应器[J].现代化工,2000,20(12):56-58[3]　W ang Changhai,Sun Yingying,Xing Ronglian,et al. Effect of liquid circulati on vel ocity and cell density on the gr owth of Pariet ochl oris incisa in flat p late phot obi oreact ors [J].B i otechnol ogy and B i op r ocess Engineering,2005,10 (2):103-108[4]　J ian L i.Online eati m ati on of stirred2tank m icr oalga pho2 t obi oreact or culture based on diss oled oxxygen measure ment [J].B i oche m ical Engineering Journal.2003,14:51-65. [5]　陈必链,梁世中,王娟,等.搅拌式光生物反应器培养紫球藻的条件优化[J].福建师范大学学报:自然科学版,2004,20(2):91-96.[6]　Luo Hup ing.Analysis of phot obi oreact ors f or cultureing high2value m icr oalgae and cyanobactera bia an advanced di2 agnostic technique CARPT[J].Che m ical Engineering Sci2 ence,2003,58:2519-2527.[7]　Singh S,A rad(Malis)S,R ich mond A.Extracellular polysaccharide p r oducti on in outdoor mass cultures of Por phy2 ridiu m s p in flat p late glass react or[J].J App l Phyco,2000,12:269-275.[8]　刘娟妮,胡萍,姚领,等.微藻培养中光生物反应器的研究进展[J].食品科学,2006,27(12):772-776.[9]　R ich mond A.Efficient utilizati on of high irradiance for p r oducti on of phot oaut otr op ic cell mass:a survey[J].J App l Phycol,1996,8:381-387.[10]　Gr obbelaar J U,et al.I nfluence of high frequency light/dark fluctuati ons on phot osynthetic characteristics of m i2 cr oalgae phot oaccli m ated t o different light intensities and i m2 p licati ons for mass algal cultivati on[J].J App l Phycol, 1996,8:335-343.[11]　许波,王长海.微藻的平板式光生物反应器高密度培养[J].食品与发酵工业,2003,29(1):36-40 [12]　鞠宝,王长海.光强、循环速度和温度对螺旋藻生长的影响[J].海洋通报,1999,18(3):35-40.[13]　Merchuk J C,M Gluz,IMuk paris on of phot obi oreact ors for cultivati on of the red m icr oalga Por ohyrid2 iu m s p[J].Jour mal of Chem ical Technol ogy and B i otechnol o2 gy,2000,75:1119-1126.[14]　Zhang Cheng wu.An industrial2size flat p late glass re2 act or for mass p r oducti on of Nannochl or op sis s p[J].Aquacul2 ture,2001,195:35-49.Character isti c Co m par ison of Two Photob i oreactors i n M i croa lga l CultureS UN L i2qin1,2,WANG Chang2hai2,SH ILei1(1.School of Ocean,Yantai University,Yantai264005,China;2.Depart m ent of B i ol ogical Science and Technol ogy,Dalian Uni2 versity of Technol ogy,Dalian116024,China)Ab s trac t:This paper is intended t o co mp rehensively evaluate the p r operties of30L flat p late phot obi oreact or and42L colu mnar air2lift internal l oop phot obi oreact or.The main para meters of t w o phot obi oreact ors are deter2 m ined,and chaetoceros g racilis are cultured f or comparing their characteristics.Results indicate that the flat p late phot obi oreact or has higher circulati on vel ocity and l ower light attenuati on degree and could be more bene2 ficial t o abs orbing light efficiently,and the cell nu mbers and gr owth rate of chaetoceros gracilis can reach t o 6.98×108/mL and1.42/d res pectively under favorite culture conditi ons.A ls o,it can be used in m icr oalgal high2density culture in large scale.Co mpared with flat p late phot obi oreact or,cell nu mbers and gr owth rate are only1.52×108/mL and0.935/d res pectively in colu mnar air2lift internal l oop phot obi oreact or,however,the operati onal fact ors can be contr olled stably,and it could cultivate m icr oalgae under axenic conditi on.There2 fore,this kind of phot obi oreact or has advantages in research of m icr oalgal gr owth dyna m ics and conditi on op ti2 m izati on.The findings suggest that different types of phot obi oreact or should be e mp l oyed t o culture m icr oalga based on different app licati on pur pose.Key wo rd s:phot obi oreact or;m icr oalgae;perf or mance para meter;app licati on comparis on(责任编辑　周雪莹)73。