第四章++基因在大肠杆菌和酵母的高效表达

MCS
T7启动子 lacZ pET28a 结构
三、 蛋白质的融合表达

蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的 编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行
表达。

在这种融合蛋白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于
N端，目的蛋白位于C端。

通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性
蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚
分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的重折叠（refolding）：二硫键形成
化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成随 机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成 相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好
药动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有 无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生 物医药领域中的巨大潜力。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
tac Me t b-Gal Apr ori Me Apr ori tac Me
化学合成A链 和B链的编码
t b-Gal
第四章 基因在大肠杆菌、 酵母中的高效表达
湖南师范大学生命科学学院 袁婺洲
本章目录
4.1 基因的表达系统与表达策略 4.1.1 基因的表达系统 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略 4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性
断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回
收目的蛋白。
谷胱甘肽S－转移
酶（GST）融合蛋
白表达系统
pGEX载体
酶促裂解法：多残基位点
亲和层析
启动子 担体基因 接头 目的基因
表达
Met
Arg Ile-Glu-gly-Arg
Stop
凝血因子Xa的识别、作用序列
Ile-Glu-gly-Arg
酶解回收
Stop
凝血因子Xa的识别、作用序列
Ile-Glu-gly-Arg
酶解回收
四、

蛋白质的分泌型表达
是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带有N端信 号肽的前体形式首先在细胞质中合成，随后穿膜运 送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过 程中，信号肽被信号肽酶切除。将目的蛋白的基因 置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型 表达。
融合型目的蛋白表达系统的构建
用于融合蛋白构建的担体蛋白： 谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 免疫亲和层析 pRIT2T
金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）
硫氧化还原蛋白（TrxA）
b-半乳糖苷酶（LacZ） 泛素蛋白（Ubi）
维持良好空间构象
免疫亲和层析
pTrxFus
维持良好空间构象
以融合形式表达目的蛋白的优缺点
R R
A 肽（21）
S
B 肽（30）
S S
高尔基体内的特异性肽酶
C
N S S N S S
C
基因工程法制人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人 胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合
性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
基底水平转录
Plac
O
高效转录
Plac UV5
O
2.
核糖体结合位点
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构： ①位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列：5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它与大 肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合； ②翻译起始密码子AUG； ③ SD序列与翻译起始密码子之间的距离(7bp)及碱基 组成； ④基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
Me
序列
A peptide t
B peptide t
M
N
M
C N
M
源自文库
M
C
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
b-Gal
M N
A M
C N
b-Gal
M M
B
C
CNBr 处理
N C N C N C N C
分离纯化
S N S S N S
大肠杆菌表达外源基因的优势
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 基因克隆及表达系统成熟完善 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白
目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白表达率高
目的蛋白溶解性好
目的蛋白需要回收
目的蛋白的回收
化学断裂法：如溴化氰（CNBr）它与多 肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反 应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定， 在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽 降解片段。
酶促裂解法
酶促裂解法：单残基位点
蛋白内切酶 切割位点 Arg-C Glu-C Lys-C Arg-C Lys-C 担体蛋白
包涵体的变性与复性操作
（1）包涵体的溶解与变性 拆开错配的二硫键和次级键
能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：
清洗剂：SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂：盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的 氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂：如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强
分泌表达的优点：
①信号肽被切除后的蛋白质N末端的氨基酸序列与天然蛋白 是一致的 ②周质空间中的蛋白酶活性比细胞质中的要低，从而使蛋 白质较稳定地存在于周质中 ③周质中只有少量的细菌蛋白，使分离纯化更容易 ④周质空间存在一个氧化的环境，使得二硫键更容易形成
五 性

蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复
细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二）真核表达系统
酵母表达系统

全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子， 它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构， 这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大 肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会 丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的 同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存 在于细菌细胞内。
二、 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌 表达系统
优点： 1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA的速度高于大肠杆菌5倍；
2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠 杆菌DNA任何序列的转录； 3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有 抗性； 4）T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达 产物可占细胞总蛋白的25％以上。
极端pH：廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应
包涵体的变性与复性操作
（2）包涵体的复性与重折叠（refolding）：
包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠
通过次级键的形成使蛋白质复性
包涵体的变性与复性操作
包涵体的复性
分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生 试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+

包涵体表达形式的优点：
能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和 细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离
心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本 上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁
4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达
第一节 基因的表达系统与表达策略

基因的表达系统 基因的高效表达策略

一、基因的表达系统


表达载体的组成：
DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 性基因 及Amp, Tet抗
载体与受体系统

载体：pET表达系统（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42 等a/b/c三套，及pRSET）

大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基 因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG （异丙基硫代β－D－半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合 成。
哺乳动物细胞系


可以悬浮培养, 生 长快, 连续传代 精确的糖基化 胞外表达 人本身的细胞系， 人的表达系统
二、基因的高效表达策略

用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持 蛋白质原有的功能 表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策 略,考虑如何便于分离 用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质，保持结构 完整
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子
启动子的可控性 乳糖启动子Plac的可控性：
阻遏蛋白 基底水平转录
P 乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳 糖苷（IPTG）
O 诱导
高效转录
P
O
启动子
启动子的可控性 乳糖启动子Plac的可控性：
CAP
Plac 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5 O cAMP 高效转录
包涵体表达形式的缺点：
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物 活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收
得到具有正确空间构象的目标蛋白。
以包涵体形式表达目的蛋白的操 作
如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），
外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量
20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此， 以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达 的载体。
N Arg C N
每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决 定簇
梭菌蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶 假单孢菌蛋白酶 猪胰蛋白酶
单残基位点断裂的蛋白酶
如在精氨酸、谷氨酸、赖氨酸 残基处切开酰胺键，使目的蛋白分离
目的蛋白
C
酶促裂解法：多残基位点
亲和层析
启动子 担体基因 接头 目的基因
表达
Met
Arg Ile-Glu-gly-Arg
HS
A S
HS
S
+ 2e + 2H+
HS
+ R-S-S-R
B
S-S-R
S S
HS
HS
2R-SH
六、
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
胰岛素的结构及其生物合成
N C
信号肽
B 肽
信号肽酶
C 肽
A 肽
C 肽（31）
K R S S S N S S C

目的基因转录的调控系统:这一系统包括启动子,抑制物基因和 转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等. 蛋白质的翻译系统:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和 终止密码子.

表达系统的种类

原核表达系统 真核表达系统 酵母 植物拟南芥 昆虫 哺乳动物细胞系
一） 原核表达系统：细菌


第二节
基因在大肠杆菌中的高效表达
大肠杆菌高效表达设计 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统
蛋白质的融合表达
蛋白质的分泌型表达 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性
一、外源基因在大肠杆菌中高效表达的设计
启动子
终止子
核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
1.启动子
启动子的构建
启动子
PlL
-35 区序列
T T G A C A
-10 区序列
G A T A C T
PrecA
PtraA Ptrp Plac Ptac
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T