第四章++基因在大肠杆菌和酵母的高效表达
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
基因工程课后习题答案
2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。
穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。
探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。
通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。
cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。
5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。
8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
第4章 基因在大肠杆菌和酵母中的表达
降低包含体形成的措施： 降低培养温度；诱导物浓度； 培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。
包含体复性方法： 尿素； 透析、稀释和超滤复性法； PEG、TritonX、肝素、人工伴侣等
原核表达系统的优点与不足
优点：
产量高、表达高效； 操作简单（可调控表达、方便纯化）； 可大规模发酵生产； 成本低。
不足：
缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。 表达产物易形成包含体。
第二节 真核表达——目的 基因在酵母中的表达
酵母菌表达外源蛋白的优点：
遗传背景清楚 属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加 工系统 可发酵生产 不产生内毒素，属安全的表达系统
2
ü 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标
蛋白质的纯化就比较简单
2. 蛋白质酶解的程度不甚严重
3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境）
4. 蛋白质的N-末端结构真实
正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在 体内对信号肽进行切割
五、包含体及复性
包含体（inclusion body）：蛋白质在大肠杆菌中 大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物 活性的固体颗粒。
T7 RNA聚合酶/T7启动子的优点：
合成RNA的速度高；
只识别T7启动子，不启动其它基因的转录；
对利福平（能抑制大肠杆菌RNA聚合酶）等抗 生素有抗性，能表达一些大肠杆菌RNA聚合酶 不能转录的序列；
产物量大，可达总蛋白的25％以上。
1
94kDa 67 kDa 43 kDa
Ch05 基因在大肠杆菌酵母中的高效表达(part two)课件
(2) 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克 处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：
吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 共转化现象极为罕见
(3) 酵母菌电击转化法
酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质 粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细 胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于受体 细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高 达105 / mg DNA。
乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因
108 aaLeabharlann 55 aaATGATG ATG
preS1 preS2
399 aa
226 aa 281 aa
226 aa S
TAA
S 多肽 M 多肽 L 多肽
传统乙肝疫苗的制备
乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第 一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出 来的。
用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型 互补基因和显性标记基因两大类 (1) 营养缺陷型的互补基因
营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE
但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难
(2) 显性标记基因
显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白
目的基因能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域
4.2.4 酵母菌的转化系统
酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的特点 用于转化子筛选的标记基因
4.2.4.1 酵母菌的转化程序
(1) 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质 体转化法 原生质体转化法的一个显著特点是：一个受体细胞可同 时接纳多个质粒分子
极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达
极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达杨梦华;李颖;关国华;江正强【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2005(45)2【摘要】以海栖热袍菌 (Thermotoga maritima) MSB8菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出木聚糖酶(XylanaseB)基因, 将此基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和毕赤酵母表达载体pPIC9K,并分别转化大肠杆菌 BL21和毕赤酵母GS115.该木聚糖酶在大肠杆菌细胞中表达量高, 但不能分泌; 而在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外.酶学性质分析表明,此酶分子量约为40kD,其最适反应温度为90℃, 最适反应pH值为6.65,且在碱性条件下稳定,具有重要的工业应用前景.【总页数】5页(P236-240)【作者】杨梦华;李颖;关国华;江正强【作者单位】中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较 [J], 周晨妍;刘振华;王丹丹;李同彪;朱新术;王燕2.极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 薛业敏;毛忠贵;邵蔚蓝3.耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质 [J], 张慧敏;李剑芳;邬敏辰;魏喜换;杨严俊4.链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1 木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达 [J], 张红莲;姚斌;王亚茹;袁铁峥;张王照;伍宁丰;范云六5.短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 刘伟丰;毛爱军;祝令香;乔宇;于巍;董志扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因在大肠杆菌和酵母的高效表达
MCS
T7启动子 lacZ pET28a 结构
三、 蛋白质的融合表达
蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的 编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行
表达。
在这种融合蛋白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于
N端，目的蛋白位于C端。
通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性
载体与受体系统
载体：pET表达系统（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42 等a/b/c三套，及pRSET）
大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基 因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG （异丙基硫代β－D－半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合 成。
4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达
第一节 基因的表达系统与表达策略
基因的表达系统 基因的高效表达策略
一、基因的表达系统
表达载体的组成：
DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 性基因 及Amp, Tet抗
融合型目的蛋白表达系统的构建
用于融合蛋白构建的担体蛋白： 谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 免疫亲和层析 pRIT2T
金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）
硫氧化还原蛋白（TrxA）
b-半乳糖苷酶（LacZ） 泛素蛋白（Ubi）
本章目录
4.1 基因的表达系统与表达策略 4.1.1 基因的表达系统 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略 4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性
外源基因在大肠杆菌中的表达
PL 和 PR 表达系统
转录调控的机理
由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的
阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。
由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。
缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃ 提高到 42℃ 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响。
T7 表达系统
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。
T7 表达系统
T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L 时抑制，Pi﹤1mmol/L 时激活)，具有较高的转录水平。
基因工程简答题总结
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
第五章 基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达
酵 母
酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其 基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁 殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少 真核基因成功表达。
基因表达的基本过程
基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。 首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使 RNA, messenger RNA )； 然后， tRNA （转运 RNA, transfer RNA）将 各种氨基酸运送到核糖 体 并 按 照 mRNA 的 密 码 子顺序将各种氨基酸连 接成特定的氨基酸序列 (translation) 最终得到基 因的表达产物（蛋白 质）。
第二节 克隆基因在大肠杆菌中的表达
大肠பைடு நூலகம்菌表达载体的成份
SD
编码序列
R
－35
－10
TT
Tcr
Ori
启动子 起始密码子
AUG、GUG、UUG
终止密码子
UAAU、UGA、UAG
大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体， 含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大 肠杆菌中有效复制的复制子。
大肠杆菌表达载体的成份
⑴启动子 要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导 ⑵转录终止子 使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水 平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。 ⑶核糖体结合位点 在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’） (4)筛选标记基因
第五章 基因在大肠杆菌、酵 母中的高效的表达
第一节 基因的表达系统与表达策略 第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达 第三节 基因在酵母中的表达
第一节基因的表达系统与表达策略
原核生物表达载体
•
增强子
启动子(promoter, P)
指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基 因转录的一段DNA序列。
• 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 • 具有保守序列：
-10区（pribnow box）：TATAAT
-35区：RNA聚合酶的δ因子的识别位点
RNA聚合酶保护区 结构基因
5 3 5
表达体系的发展表达体系的发展表达体表达体载体载体宿主宿主第一代第一代原核生物表达体系原核生物表达体系质粒质粒噬菌体噬菌体细菌细菌第二代第二代酵母表达体系酵母表达体系穿梭质粒穿梭质粒酵母酵母第三代第三代哺乳类细胞表达体系哺乳类细胞表达体系病毒病毒脂质体脂质体培养细胞培养细胞第四代第四代基因直接导入基因直接导入dnadna本身本身生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞个体个体基因工程的目的是使目的基因能基因工程的目的是使目的基因能高效表达高效表达
非融合型表达载体：---天然完整蛋白
分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌 至胞周间隙
（一）融合型表达载体
Foreign DNA
P
SD
融合型表达载体
融合基因
技术关键：克隆基因插入原核序列3’端 而维持正确阅读框架。 • 选择合适酶切位点
• 加人工合成的DNA接头 • 构建位相载体
载体部分序列
EcoRI BamHI
共有序列
• RNA聚合酶识别并结合启动子，但 并不开始转录 • 各种启动子启动转录能力不同。
• 启动子强弱取决于-35区和-10区的 碱基组成及其间隔序列
终止子（terminator，T）
位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终 止信号的DNA序列
6、与转译有关的原核细胞结构：—— 核糖体结合位点
生物制药复习题（有答案）
生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。
(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。
（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。
经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。
（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
（12）连续培养行下去的一种培养方法。
（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。
（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。
这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。
第一章+基因工程概述
转 基 因 植 物
抗除草剂的水稻
3.基因工程在医药领域的应用
1. 遗传性疾病： 肿瘤、心脑血管病、糖尿病、过度肥胖综合症、老 年痴呆症、骨质疏松症等 2. 抗衰老：端粒酶编码基因 动物疾病模型的建立 基因诊断 基因治疗 器官移植
基 因 治 疗
器官移植
三 、基因工程与其他课程的关系
1997年3月11日，马来西亚政府反对任何企图克隆 人类的尝试；世界卫生组织总干事中岛宏宣称反 对克隆人的研究；欧盟委员会声明反对克隆人。 美国总统克林顿在维尔穆特克隆羊出现后，召集 一群科学家，限他们在90天之内就该不该让“克 隆人”成为可能给出一个答案； 法国总统密特朗在听到杰里．豪关于人体胚胎复 制的消息时曾打电话说：“这个消息令人毛骨悚 然。”
第一 个转 化成 功 的重 组 DNA 分子
3. 基因工程的发展
基因工程的发展： 1. 1972-1976年，日本人，somatostatin(抑促生长素)； 2. 1978年，美国人，生长激素基因（HGH）； 3. 1980年，美国/瑞士人，a干扰素－基因； 4. 1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）； 基因工程的腾飞： 1. 1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠； 2. 1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因） 3. 1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫 缺陷症（SDID） 4. 1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD； 5. 1997年，美国人，威尔穆特克隆多利绵羊和转基因波莉绵羊
一波未平，一波又起。1998年1月6日，美 国科学家里查德堂而皇之地在美国《科学》 杂志上公开声明，准备进行克隆人的研究！ 比尔．盖茨说：“当然应该克隆人。如果 谁第一个掌握了这个技术，他就是我真正 的、也是唯一的竞争对手。” 英国和俄罗斯也不反对克隆人。
基因工程习题集
《基因工程》习题集第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？2.基因工程诞生的条件与标志分别是什么？3.简述基因工程的发展简史。
4.基因工程有哪些主要应用？5.通过本章的学习，请举两个基因工程应用的具体例子并加以简单说明。
第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？4. 什么是人工微小染色体？有哪些类型？5. 什么是穿梭载体？6. 表达载体应该具备什么条件？7. 限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项有哪些？8. DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？9. DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA分子末端进行连接？10. 碱性磷酸酶有什么作用？11. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？12. 在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA片段？13. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？14. 举例说明大肠杆菌DNA聚合酶Ι在基因工程中的应用。
15. 请描述用载体pUC18来克隆DNA片段的过程。
在这个克隆实验中，你怎样选择含有克隆片段的重组子？第三章基因工程的常规技术1. 琼脂糖凝胶电泳的原理是什么2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些？3. 探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？4. 探针的间接标记有什么优点？什么是ABC荧光（显色酶）标记法？5. Southern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？6. Northern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？7. Western杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？8. 菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？9. 简述PCR技术的基本原理。
10. PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？11. 提高PCR反应特异性的因素有哪些？12. 什么是逆转录PCR？13. 什么是反向PCR?14. 什么是多重PCR？15. 什么是荧光定量PCR？16. 什么是基因芯片技术？17. DNA芯片有哪些主要的应用？18. 什么是蛋白质芯片？19. 什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？20. 什么是cDNA文库？它的构建流程是什么？21. 构建cDNA文库需要用到哪些工具酶？22. 合成cDNA第二条链有哪些方法？23. 简述酵母双杂交系统的基本原理。
外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
Ptrp 除去色氨酸
Ptrp
Ptrp
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
Otrp 高效转录
Otrp
启动子的可控性
启动子
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因
Ptrp
工程中常使用温度敏感型的cI突
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的
密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码 子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：
生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体 fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势
子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含 有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞 中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠 杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个 高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用
ori
筛选Apr、Tcs的转化子
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
大肠杆菌和酵母类生物的基因组编辑
大肠杆菌和酵母类生物的基因组编辑近年来，基因组编辑技术迅速发展，被广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中大肠杆菌和酵母类生物的基因组编辑技术受到越来越多的关注，成为研究热点。
一、大肠杆菌基因组编辑技术大肠杆菌是一种常见的细菌，具有广泛的应用价值。
通过基因编辑技术，可以在大肠杆菌中增加、删除、替换特定的基因，进而改变其代谢通路、获得所需产物或者制备新药物等。
基因编辑技术的主要手段包括CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、ZFN系统等，其中CRISPR/Cas9系统最为常用。
该系统借助RNA导向蛋白Cas9剪切DNA的特性，靶向编辑目标基因，实现精准的基因组编辑。
大肠杆菌基因组编辑技术的主要应用包括：1. 代谢工程。
利用基因组编辑技术调控代谢通路，可改变细菌的代谢产物，例如利用大肠杆菌菌株结合基因组编辑技术，生产出可溶性人类胰岛素。
此外，还可以通过基因组编辑技术提升大肠杆菌对废弃物或渣滓的生物降解能力，促进废物资源化利用。
2. 蛋白生产。
利用基因组编辑技术可以改变大肠杆菌的蛋白表达水平，从而提升蛋白的合成产量。
此外，还可以利用大肠杆菌高效、稳定的蛋白质表达系统，将外源基因导入大肠杆菌进行蛋白质工程研究。
3. 基因疗法。
基因组编辑技术可用于纠正生物体中的基因突变，治疗遗传性疾病。
例如，可以利用基因组编辑技术修复大肠杆菌中的缺陷基因，防止癌症等疾病的发生。
二、酵母类生物基因组编辑技术酵母类生物是常见的真核细胞，具有广泛的实用价值。
利用基因编辑技术控制酵母类生物基因表达，可生产出新型酵母菌株，进而制备生物材料、生产化学品，还可以促进生物剂量的研究等。
酵母类生物基因组编辑技术的主要应用包括：1. 生物材料生产。
酵母菌株具有广泛的生物材料生产应用。
通过基因组编辑技术可设计合成新的代谢途径，提高生物合成产物的效率。
例如，利用酵母细胞制备出使用情况更为广泛的高强度酒精及生物丁醇生产方式，实现较高内生LOGy。
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
基因在大肠杆菌和酵母的高效表达
蛋白内切酶 切割位点
梭菌蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶 假单孢菌蛋白酶 猪胰蛋白酶
Arg-C Glu-C Lys-C Arg-C Lys-C
担体蛋白
目的蛋白
N
Arg C N
C
酶促裂解法：多残基位点
启动子 担体基因 接头 目的基因
Met
Arg
Stop
Ile-Glu-gly-Arg
凝血因子Xa的识别、作用序列
表达
Ile-Glu-gly-Arg
亲和层析 酶解回收
四、 蛋白质的分泌型表达
是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带有N端信 号肽的前体形式首先在细胞质中合成，随后穿膜运 送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过 程中，信号肽被信号肽酶切除。将目的蛋白的基因 置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型 表达。
谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象
以融合形式表达目的蛋白的优缺点
目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白表达率高 目的蛋白溶解性好 目的蛋白需要回收
糖苷（IPTG）
O 诱导
高效转录
PO
启动子的可控性
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
cAMP
CAP
高效转录
基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
Plac 葡萄糖代谢
O cAMP浓度降低
基底水平转录
Plac
O
高效转录
Plac UV5 O
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断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回
收目的蛋白。
谷胱甘肽S－转移
酶（GST）融合蛋
白表达系统
pGEX载体
酶促裂解法：多残基位点
亲和层析
启动子 担体基因 接头 目的基因
表达
Met
Arg Ile-Glu-gly-Arg
Stop
凝血因子Xa的识别、作用序列
Ile-Glu-gly-Arg
酶解回收
MCS
T7启动子 lacZ pET28a 结构
三、 蛋白质的融合表达
蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的 编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行
表达。
在这种融合蛋白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于
N端，目的蛋白位于C端。
通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性
HS
A S
HS
S
+ 2e + 2H+
HS
+ R-S-S-R
B
S-S-R
S S
HS
HS
2R-SH
六、
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
胰岛素的结构及其生物合成 人胰岛素的生产方法 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
胰岛素的结构及其生物合成
N C
信号肽
B 肽
信号肽酶
C 肽
A 肽
C 肽（31）
K R S S S N S S C
分泌表达的优点：
①信号肽被切除后的蛋白质N末端的氨基酸序列与天然蛋白 是一致的 ②周质空间中的蛋白酶活性比细胞质中的要低，从而使蛋 白质较稳定地存在于周质中 ③周质中只有少量的细菌蛋白，使分离纯化更容易 ④周质空间存在一个氧化的环境，使得二硫键更容易形成
五 性
蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复
蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚
分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的重折叠（refolding）：二硫键形成
化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成随 机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成 相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好
极端pH：廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应
包涵体的变性与复性操作
（2）包涵体的复性与重折叠（refolding）：
包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠
通过次级键的形成使蛋白质复性
包涵体的变性与复性操作
包涵体的复性
分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生 试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+
载体与受体系统
载体：pET表达系统（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42 等a/b/c三套，及pRSET）
大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基 因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG （异丙基硫代β－D－半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合 成。
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子， 它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构， 这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大 肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会 丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的 同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存 在于细菌细胞内。
目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白表达率高
目的蛋白溶解性好
目的蛋白需要回收
目的蛋白的回收
化学断裂法：如溴化氰（CNBr）它与多 肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反 应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定， 在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽 降解片段。
酶促裂解法
酶促裂解法：单残基位点
蛋白内切酶 切割位点 Arg-C Glu-C Lys-C Arg-C Lys-C 担体蛋白
哺乳动物细胞系
可以悬浮培养, 生 长快, 连续传代 精确的糖基化 胞外表达 人本身的细胞系， 人的表达系统
二、基因的高效表达策略
用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持 蛋白质原有的功能 表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策 略,考虑如何便于分离 用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质，保持结构 完整
大肠杆菌表达外源基因的优势
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 基因克隆及表达系统成熟完善 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白
R R
A 肽（21）
S
B 肽（30）
S S
高尔基体内的特异性肽酶
C
N S S N S S
C
基因工程法制人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人 胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合
性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆
细胞周质内含有种类繁多的内毒素
二）真核表达系统
酵母表达系统
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的
药动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有 无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生 物医药领域中的巨大潜力。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链分别表达法
tac Me t b-Gal Apr ori Me Apr ori tac Me
化学合成A链 和B链的编码
t b-Gal
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子
启动子的可控性 乳糖启动子Plac的可控性：
阻遏蛋白 基底水平转录
P 乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳 糖苷（IPTG）
O 诱导
高效转录
P
O
启动子
启动子的可控性 乳糖启动子Plac的可控性：
CAP
Plac 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5 O cAMP 高效转录
二、 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌 表达系统
优点： 1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA的速度高于大肠杆菌5倍；
2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠 杆菌DNA任何序列的转录； 3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有 抗性； 4）T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达 产物可占细胞总蛋白的25％以上。
包涵体表达形式的缺点：
以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物 活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收
得到具有正确空间构象的目标蛋白。
以包涵体形式表达目的蛋白的操 作
如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），
外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量
20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此， 以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达 的载体。
N Arg C N
每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决 定簇
梭菌蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶 假单孢菌蛋白酶 猪胰蛋白酶
单残基位点断裂的蛋白酶
如在精氨酸、谷氨酸、赖氨酸 残基处切开酰胺键，使目的蛋白分离
目的蛋白
C
酶促裂解法：多残基位点
亲和层析
启动子 担体基因 接头 目的基因
表达
Met
Arg Ile-Glu-gly-Arg
4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达
第一节 基因的表达系统与表达策略
基因的表达系统 基因的高效表达策略
一、基因的表达系统
表达载体的组成：
DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 性基因 及Amp, Tet抗
融合型目的蛋白表达系统的构建
用于融合蛋白构建的担体蛋白： 谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 免疫亲和层析 pRIT2T
金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）
硫氧化还原蛋白（TrxA）
b-半乳糖苷酶（LacZ） 泛素蛋白（Ubi）
维持良好空间构象
免疫亲和层析
pTrxFus
维持良好空间构象
以融合形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体的变性与复性操作
（1）包涵体的溶解与变性 拆开错配的二硫键和次级键
能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：
清洗剂：SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂：盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的 氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂：如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强
第二节
基因在大肠杆菌中的高效表达
大肠杆菌高效表达设计 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统