亲和层析
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此产生亲和基质
间隔臂：用于克服空间位阻从而促进配体和靶分子的结 间隔臂：
合
封闭： 封闭：用亲水性低分子量化合物如乙醇胺来封闭残留的活
化基团
亲和层析操作
1、样品预处理 、 2、柱的填充和制备 、 3、 3、上样 4、洗涤 、 5、洗脱 、 6、再生 、
样品预处理
为了获得好的分辨率和延长柱子的使用寿命，上柱前尽量使 用离心或者过滤的办法去除颗粒性的污染物。 样品的体积和粘度 样品太粘，如果是因为样品的高浓度，可以使用上样缓冲液 稀释。 如果高粘度是由于核酸污染物引起，可以通过多聚阳离子高 分子化合物例如聚乙烯亚胺和硫酸鱼精蛋白除去，核酸引起 的高粘度可以使用核酸酶消化。
AU 2.0
1.5
1.0
Starting material Eluate
0 200 400 600 V olume (ml)
0.5
0.0
纯化 IgM 抗体
Sample: 75 ml cell culture supernatent containing αShigella IgM Column: HiTrap IgM Purification Binding buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M potassium sulphate, pH 7.5 Elution buffer: 20 mM sodium phosphate, pH 7.5
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
常见问题的处理
堵柱子（柱压力高） 堵柱子（柱压力高）
1、细胞裂解液脏（离心、过滤减少颗粒物） 2、在位清洗柱（HCl、NaOH，如果是蛋白沉在柱子上，在样 品和缓冲液中加入非离子去污剂（0.1-2% Triton X-100，或 Tween 20。）
没有吸附
1、超声功率（大；蛋白炭化、小；蛋白没有释放。超
One step refolding and purification from inclusion bodies 1 (2)
(His)6 fusion protein from E. coli on Ni2+ HiTrap™ Chelating HP, 1 ml
A280 1.0
Start refolding
其他常用配体包括： 肝素 - 纯化抗凝血酶III，凝血因子脂酶等 Cibacron Blue(颜料) - 纯化白蛋白，干扰素等 外源凝集素如刀豆球蛋白A - 多糖，糖蛋白等 Glutathione谷胱甘三肽 - 重组融合蛋白 等等. 可自行把所需配体偶联到活化偶联介质，最常用的 是NHS activated 4 Fast Flow 和CNBr activated 4 FF； 要注意化学基最好不会参与配体和被纯化生物分子 的 结合作用中
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
Affinity Chromatography
亲和层析
亲和层析（ ） 亲和层析（AC）
什么是亲和层析? 什么是亲和层析 原理 应用范围? 应用范围? 如何使用? 如何使用 常见问题的处理
什么是亲和层析? 什么是亲和层析
亲和层析是一种层析技术，通过生物分子之 间特异性的的相互作用分离生物分子. 原理：填料上的配基与生物大分子特异结合， 用特殊的洗脱条件把被吸附的生 物分子洗脱 下来。一种亲和色谱填料只能用于一种或有 限的一类生物分子。
10 20 30 40 50 60 65 ml
0.75
fr. fr. fr. 38 40 42 fr. fr. 46 49
0.5
Manually using a syringe: • Sample loading • Gua-HCl wash • Urea wash
Start elution
0.25
亲和层析中几个重要的参数
分辨率：如图所示，显示两个峰的分离程度
柱效
N = 5.54(V R1 / w h ) w h 是半峰高的峰宽 V R1 是峰的洗脱体积 H = L/N 塔板数N依赖于所选择的试验条件，例如流速和上 样量。在一定的条件下，使用与基质没有相互作用 的物质，例如丙酮检测塔板数。
洗脱策略
亲和层析没有通用的洗脱方案 选择性洗脱和非选择性洗脱 选择性洗脱
pH洗脱 离子强度洗脱 竞争性洗脱 降低洗脱液的极性 促溶性洗脱 梯度洗脱和阶段式洗脱
再生
每次试验完成以后，使用盐浓度达到2 M 再生离子交换填料， 可以去除任何以离子键结合的物质。 Cleaning-in-place (CIP) 能够去除填料上的强结合物质、沉 淀蛋白和变性物质。 NaOH 是非常有效的清洁剂，用于溶解不可避免的沉淀蛋白 以及脂类物质。 NaOH 能够与有机溶剂和去污剂有效结合，再生填料。
Result:4 ml eluted GST-(His)6, A280:1.65. Total amount: 4.5 mg
SDS-PAGE
Starting material Flow-through
94.0 67.0 43.0 30.0 20.1 14.4
Eluted GST-(His)6 GST standard
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
影响因素
１.螯合金属离子：Ｎi 2+、Cu 2+ 、Zn 2+ ２.缓冲液和样品中不能含有Ni 2+、EDTA等 ３.在缓冲液中加入适量 的表面活性剂或者减少盐浓度 可以降低非特异的疏水吸附。 ４.样品通常溶解在pH5.5~8.5的缓冲液中，pH高，载 量也高。 pH不能小于5.5，否则金属离子会脱落。
0
Linear gradient: 20 mM to 500 mM imidazole in 10 to 20 column volumes
柱上复性
One step refolding and purification from inclusion bodies 2 (2)
SDS-PAGE analysis of fractions from Ni2+-loaded HiTrap™ Chelating HP 1 ml
亲和层析的特点
容易使用 纯度 > 95 % 一步纯化 去除特异杂质 快速分离
亲和层析意义
亲和层析是最有效的生物活性物质纯化方法， 它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取 得很高的纯化倍数 很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中 很高的纯化倍数 得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳 性质更加稳 定，其结果提高了活性回收率。此外它可以 减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋 减少纯化步骤 白的纯化十分有利。
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
亲和层析分类及配体性质
特异性配体亲和层析
强特异性配体
通用性配体亲和层析 金属离子 染料 疏水基团 组氨酸 赖氨酸
弱特异性配体 非生物分子配体 生物分子配体
抗原、抗体 抗原、 抑制剂 底物 组蛋白 核酸酶
Байду номын сангаас
辅助因子 外源凝素 钙调蛋白
配基偶联在介质上，纯化能与配体结合的生 物分子； 通常一步便能得到高纯度的样品； 配体的特异性越强， 所获产品纯度越高 用抗体亲和介质提纯单抗非常方便，以重组 蛋白A的载量最高；蛋白G则能结合更多不同 源的IgG 金属螯合介质(Chelating Sepharose Fast Flow) 可反复螯合不同金属，再用已结合依赖不同 金属 的蛋白，一种介质可做多种纯化工作
金属螯合亲和色谱
原理： 原理：利用蛋白表面的一些氨基酸，例如组氨 酸等能与多种过渡金属离子如Cu2+、Zn2+ 、 Ni2+ 、 Co 2+ 、 Fe2+ 发生特殊的相互作用，因此螯合了金 属离子的琼脂糖 凝胶就能够选择性的吸附那些含有 组氨酸的蛋白 和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋 白和核苷酸。
Sample Application Dilute sample, wash column 10 ml equilibration buffer: 5 mM imidazole, 6 M GuaHCl, pH 8.0 Load sample and wash column: 20 mM imidazole, 6 M urea pH 8.0 Refolding Linear gradient from 6 to 0 M urea in 30 column volumes Flow rates: 0.1 ml/min to 1 ml/min Wash with 5 ml buffer including 0 M urea Purification and Elution
单克隆抗体与多克隆抗体的分离 融合蛋白的分离 酶的分离 DNA结合蛋白 . . . . . . 结合蛋白 任何蛋白，可以结合它的配体!! 任何蛋白，可以结合它的配体
纯化单抗
Sample: 600 ml mouse monoclonal IgG 2a Gel: rProtein A Sepharose Fast Flow Elution: 20 mM Sodium Citrate, pH 4.0 Result: 83 mg Mab, recovery 95%
介质的保存
主要是阻止微生物的生长 不常用的介质通常储存在密闭容器中，+4 °C 到 +25 °C 注意：介质不能冰冻，因为冰可以破坏介质的结构。 注意：介质不能冰冻，因为冰可以破坏介质的结构。 常用的介质的储存 常用的介质通常储存在+4 °C 到 +8 °C并且有抗菌剂0.01 M NaOH 或 20% ethanol 注意：介质不能冰冻，因为冰晶可以破坏介质的结构。 注意：介质不能冰冻，因为冰晶可以破坏介质的结构。
2
亲和层析载体
不溶于水，具有亲水和中性的骨架 不溶于水， 具有足够的可衍生化的官能团， OH、 具有足够的可衍生化的官能团，如-OH、-NH2、COOH、 CHO等 COOH、-CHO等 孔径足够大 良好的生物、力学、 良好的生物、力学、化学和热稳定性 一般以交联型琼脂糖为介质
载体的处理
载体的处理： 载体的处理：常用溴化氰活化 配体偶联：配体共价附着的一个适当预活化的基质， 配体偶联：配体共价附着的一个适当预活化的基质，以
His-tagged融合蛋白的纯化
Sample:5 ml cytoplasmic extract containing (His)6-tagged GST Column:In HisTrap kit Elution:Phosphate buffer, 500 mM imidazole, pH 7.4
间隔臂：用于克服空间位阻从而促进配体和靶分子的结 间隔臂：
合
封闭： 封闭：用亲水性低分子量化合物如乙醇胺来封闭残留的活
化基团
亲和层析操作
1、样品预处理 、 2、柱的填充和制备 、 3、 3、上样 4、洗涤 、 5、洗脱 、 6、再生 、
样品预处理
为了获得好的分辨率和延长柱子的使用寿命，上柱前尽量使 用离心或者过滤的办法去除颗粒性的污染物。 样品的体积和粘度 样品太粘，如果是因为样品的高浓度，可以使用上样缓冲液 稀释。 如果高粘度是由于核酸污染物引起，可以通过多聚阳离子高 分子化合物例如聚乙烯亚胺和硫酸鱼精蛋白除去，核酸引起 的高粘度可以使用核酸酶消化。
AU 2.0
1.5
1.0
Starting material Eluate
0 200 400 600 V olume (ml)
0.5
0.0
纯化 IgM 抗体
Sample: 75 ml cell culture supernatent containing αShigella IgM Column: HiTrap IgM Purification Binding buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M potassium sulphate, pH 7.5 Elution buffer: 20 mM sodium phosphate, pH 7.5
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
常见问题的处理
堵柱子（柱压力高） 堵柱子（柱压力高）
1、细胞裂解液脏（离心、过滤减少颗粒物） 2、在位清洗柱（HCl、NaOH，如果是蛋白沉在柱子上，在样 品和缓冲液中加入非离子去污剂（0.1-2% Triton X-100，或 Tween 20。）
没有吸附
1、超声功率（大；蛋白炭化、小；蛋白没有释放。超
One step refolding and purification from inclusion bodies 1 (2)
(His)6 fusion protein from E. coli on Ni2+ HiTrap™ Chelating HP, 1 ml
A280 1.0
Start refolding
其他常用配体包括： 肝素 - 纯化抗凝血酶III，凝血因子脂酶等 Cibacron Blue(颜料) - 纯化白蛋白，干扰素等 外源凝集素如刀豆球蛋白A - 多糖，糖蛋白等 Glutathione谷胱甘三肽 - 重组融合蛋白 等等. 可自行把所需配体偶联到活化偶联介质，最常用的 是NHS activated 4 Fast Flow 和CNBr activated 4 FF； 要注意化学基最好不会参与配体和被纯化生物分子 的 结合作用中
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
Affinity Chromatography
亲和层析
亲和层析（ ） 亲和层析（AC）
什么是亲和层析? 什么是亲和层析 原理 应用范围? 应用范围? 如何使用? 如何使用 常见问题的处理
什么是亲和层析? 什么是亲和层析
亲和层析是一种层析技术，通过生物分子之 间特异性的的相互作用分离生物分子. 原理：填料上的配基与生物大分子特异结合， 用特殊的洗脱条件把被吸附的生 物分子洗脱 下来。一种亲和色谱填料只能用于一种或有 限的一类生物分子。
10 20 30 40 50 60 65 ml
0.75
fr. fr. fr. 38 40 42 fr. fr. 46 49
0.5
Manually using a syringe: • Sample loading • Gua-HCl wash • Urea wash
Start elution
0.25
亲和层析中几个重要的参数
分辨率：如图所示，显示两个峰的分离程度
柱效
N = 5.54(V R1 / w h ) w h 是半峰高的峰宽 V R1 是峰的洗脱体积 H = L/N 塔板数N依赖于所选择的试验条件，例如流速和上 样量。在一定的条件下，使用与基质没有相互作用 的物质，例如丙酮检测塔板数。
洗脱策略
亲和层析没有通用的洗脱方案 选择性洗脱和非选择性洗脱 选择性洗脱
pH洗脱 离子强度洗脱 竞争性洗脱 降低洗脱液的极性 促溶性洗脱 梯度洗脱和阶段式洗脱
再生
每次试验完成以后，使用盐浓度达到2 M 再生离子交换填料， 可以去除任何以离子键结合的物质。 Cleaning-in-place (CIP) 能够去除填料上的强结合物质、沉 淀蛋白和变性物质。 NaOH 是非常有效的清洁剂，用于溶解不可避免的沉淀蛋白 以及脂类物质。 NaOH 能够与有机溶剂和去污剂有效结合，再生填料。
Result:4 ml eluted GST-(His)6, A280:1.65. Total amount: 4.5 mg
SDS-PAGE
Starting material Flow-through
94.0 67.0 43.0 30.0 20.1 14.4
Eluted GST-(His)6 GST standard
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
影响因素
１.螯合金属离子：Ｎi 2+、Cu 2+ 、Zn 2+ ２.缓冲液和样品中不能含有Ni 2+、EDTA等 ３.在缓冲液中加入适量 的表面活性剂或者减少盐浓度 可以降低非特异的疏水吸附。 ４.样品通常溶解在pH5.5~8.5的缓冲液中，pH高，载 量也高。 pH不能小于5.5，否则金属离子会脱落。
0
Linear gradient: 20 mM to 500 mM imidazole in 10 to 20 column volumes
柱上复性
One step refolding and purification from inclusion bodies 2 (2)
SDS-PAGE analysis of fractions from Ni2+-loaded HiTrap™ Chelating HP 1 ml
亲和层析的特点
容易使用 纯度 > 95 % 一步纯化 去除特异杂质 快速分离
亲和层析意义
亲和层析是最有效的生物活性物质纯化方法， 它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取 得很高的纯化倍数 很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中 很高的纯化倍数 得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳 性质更加稳 定，其结果提高了活性回收率。此外它可以 减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋 减少纯化步骤 白的纯化十分有利。
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
亲和层析分类及配体性质
特异性配体亲和层析
强特异性配体
通用性配体亲和层析 金属离子 染料 疏水基团 组氨酸 赖氨酸
弱特异性配体 非生物分子配体 生物分子配体
抗原、抗体 抗原、 抑制剂 底物 组蛋白 核酸酶
Байду номын сангаас
辅助因子 外源凝素 钙调蛋白
配基偶联在介质上，纯化能与配体结合的生 物分子； 通常一步便能得到高纯度的样品； 配体的特异性越强， 所获产品纯度越高 用抗体亲和介质提纯单抗非常方便，以重组 蛋白A的载量最高；蛋白G则能结合更多不同 源的IgG 金属螯合介质(Chelating Sepharose Fast Flow) 可反复螯合不同金属，再用已结合依赖不同 金属 的蛋白，一种介质可做多种纯化工作
金属螯合亲和色谱
原理： 原理：利用蛋白表面的一些氨基酸，例如组氨 酸等能与多种过渡金属离子如Cu2+、Zn2+ 、 Ni2+ 、 Co 2+ 、 Fe2+ 发生特殊的相互作用，因此螯合了金 属离子的琼脂糖 凝胶就能够选择性的吸附那些含有 组氨酸的蛋白 和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋 白和核苷酸。
Sample Application Dilute sample, wash column 10 ml equilibration buffer: 5 mM imidazole, 6 M GuaHCl, pH 8.0 Load sample and wash column: 20 mM imidazole, 6 M urea pH 8.0 Refolding Linear gradient from 6 to 0 M urea in 30 column volumes Flow rates: 0.1 ml/min to 1 ml/min Wash with 5 ml buffer including 0 M urea Purification and Elution
单克隆抗体与多克隆抗体的分离 融合蛋白的分离 酶的分离 DNA结合蛋白 . . . . . . 结合蛋白 任何蛋白，可以结合它的配体!! 任何蛋白，可以结合它的配体
纯化单抗
Sample: 600 ml mouse monoclonal IgG 2a Gel: rProtein A Sepharose Fast Flow Elution: 20 mM Sodium Citrate, pH 4.0 Result: 83 mg Mab, recovery 95%
介质的保存
主要是阻止微生物的生长 不常用的介质通常储存在密闭容器中，+4 °C 到 +25 °C 注意：介质不能冰冻，因为冰可以破坏介质的结构。 注意：介质不能冰冻，因为冰可以破坏介质的结构。 常用的介质的储存 常用的介质通常储存在+4 °C 到 +8 °C并且有抗菌剂0.01 M NaOH 或 20% ethanol 注意：介质不能冰冻，因为冰晶可以破坏介质的结构。 注意：介质不能冰冻，因为冰晶可以破坏介质的结构。
2
亲和层析载体
不溶于水，具有亲水和中性的骨架 不溶于水， 具有足够的可衍生化的官能团， OH、 具有足够的可衍生化的官能团，如-OH、-NH2、COOH、 CHO等 COOH、-CHO等 孔径足够大 良好的生物、力学、 良好的生物、力学、化学和热稳定性 一般以交联型琼脂糖为介质
载体的处理
载体的处理： 载体的处理：常用溴化氰活化 配体偶联：配体共价附着的一个适当预活化的基质， 配体偶联：配体共价附着的一个适当预活化的基质，以
His-tagged融合蛋白的纯化
Sample:5 ml cytoplasmic extract containing (His)6-tagged GST Column:In HisTrap kit Elution:Phosphate buffer, 500 mM imidazole, pH 7.4