微生物遗传育种学3

• 微生物在正常生长情况下进行DNA复制 时，首先DNA双链解开成为单链，然后 两条单链各自与细胞游离的碱基互补配 对形成新链。如果此时双链之间有嘧啶 二聚体存在，则因二聚体的交联作用， 阻碍双链分开，复制到此处就无法进行 下去，造成DNA异常状态。
2、DNA损伤修复
图:光复活作用
暗修复作用（dark repair）
2、紫外线的辐射剂量 用于微生物诱变的紫外线剂量表示方法，可分绝对 剂量和相对剂量。绝对剂量单位通常按每秒时间内 每平方厘米多少尔格能量来计算。相对剂量单位可 用致死率或照射时间表示。 通过改变照射时间或距离来改变剂量。一般在灯管 长度l／3范围内，强度和距离成反比关系，在此范 围以外，则强度和距离的平方成反比关系。 早期育种工作者一般认为杀菌率以90-99%效果较 好，近年来，认为较低的杀菌率有利于正突变菌株 的产生，以70-80%或更低的杀菌率为好。
• （5）后培养 照射完毕的菌悬液加入到适合于正突 变体的培养基中，在适宜温度下培养1.5-2h。有些 微生物的增殖培养基中加入适量的酪素水解物、色 氨酸或异烟肼等物质，可以抑制修复，有利于突变 体繁殖和减少细胞悬液在贮存过程中的死亡，能提 高突变率。 • （6）稀释涂布，后培养后，从中取一定量的培养 物，作不同稀释，涂皿，并且以未经紫外线照射的 菌悬液作对照皿培养后挑取菌落，以待筛选。
• 另一方面，如果烯醇式5—BU直接渗入到 DNA中去时，它也可立即取代胞嘧啶的位 置与鸟嘌呤配对，从而在DNA复制过程中 将碱基对G—C转换为A—T。同样引起碱基 对改变。 • 这一过程完全是上一个过程的回复。这也 可以解释为什么经5—BU诱发突变的菌株 再培养在5—BU培养液中可以发生回复突 变。
• 近年来发现5—BU，或5—FU等碱基类似物 是良好的辐射增敏剂。它们渗入DNA后， 可明显提高对辐射的敏感度
二、烷化剂
• 烷化剂由于其诱变效率较高，化合 物种类又多，因而是一类重要的常 用诱变剂。 • 烷化剂主要包括硫芥、氮芥类、环 氧衍生物、重氮烷和亚硝基类等化 合物（表3.1)。
•烷化剂具有活泼的烷化基团，在细胞内和极性溶 剂中与水分子发生水合作用生成正碳离子 CH2+，正碳离子很快与带负电荷的亲核基团诸如 硫氢基、硫酯、电离的酸根和非电离的胺基起反 应。 •生物系统的烷化作用主要是通过和生物大分子的 氧、氮和硫原子起反应，进而伤害生物体遗传物 质而发生突变作用的。
第二节
化学诱变剂
• 化学诱变剂是一些能和DNA起作用，改变 其结构，并引起遗传变异的化学物质。 • 化学诱变剂包括四大类：碱基类似物、烷 化剂、移码突变剂以及其他类等。
• 化学诱变剂都是与DNA起化学作用，从而引起 遗传物质的改变。因而诱变效应和它们的理 化特性有很大关系，在使用以前必须认真了 解和掌握。 • 例如这些化合物的稳定性以及影响其稳定性 的条件，如温度、光照、pH等、化合物的半 衰期、与溶剂或增溶剂是否起反应等等。 • 绝大多数化学诱变剂都具毒性，其中90%以上 是致癌物质或极毒药品，要注意使用安全。
•
性质：土黄色结晶，熔点118℃，不稳定，难溶 于水，遇光可分解而释放NO，同时结晶由土黄色 变为黄绿色，为致癌物质，须保存在棕色瓶中， 操作时要十分注意。NTG不溶于水，须加助溶 剂，使用时现用现配。
•NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突 变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变 株。 •其中处理细菌、放线菌等微生物时，不经淘汰，就 可以直接得到10%以上的营养缺陷型突变株，而用一 般诱变剂处理只能达到千分之几至百分之几。 •NTG还能使多基因并发突变，在复制叉附近一个基 因突变能诱发临近位置的基因陆续连锁突变。
第一节
物理诱变剂
• 物理诱变剂包括：紫外光、X射线、γ射线、 快中子、α射线、β射线和超声波等。其 中紫外光沿用最广，诱变抗生素高产突变 株有很优异的效果。 • 近年来随着实用放射物理技术的普及，应 用γ射线和快中子等物理因子于诱变育种 的逐渐增多，特别是在常规诱变剂效果不 明显时加以使用。
• 物理诱变剂分为： • 电离辐射（ionizing radiation）和 非电离辐射（noionizing radiation)
鸟嘌呤的N—7位置是与所有烷化剂最易起作用的 位点。其次是鸟嘌呤N—3、腺嘌呤N—3和胞嘧啶 N—3位置，但烷化剂不能和胸腺嘧啶反应，腺嘌 呤的烷化作用也较少发生。烷化剂的诱变效应相 当复杂，可以诱发多种突变，其中碱基置换的基 因点突变为主要诱变反应。
（一）烷化剂的性质（以亚硝基胍为例）
• 亚硝基胍，简称NG(或NTG，NNNG)结构式：
机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可 以被错误地掺入DNA，引起诱变效应 酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似 ， 与A配对 5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互 变异构 烯醇式5-BU不与A而与G配对 A：T→ G：C
5-BU在以酮式或烯醇式状态存在时引起的 A︰T→G┇C的转换
A:T G:C
（2）NTG难溶于水，可按NTG31毫克加3.1 毫升的比例加入丙酮使其先溶解，再用 柠檬酸缓冲液稀释。 （3）用同样的缓冲液冲洗制备好孢子或菌 体悬液，然后取NTG处理液与孢子液混 合，在一定温度下处理。
• （3）制备菌悬液，用生理盐水制备菌悬 液，加入玻璃珠震荡分散，分散程度达 90-95%，菌悬液浓度：细菌约1*108/mL， 放线菌约107-108/mL，霉菌约106-107/ mL。
血球计数板法
• （4）紫外线照射，将盛有菌液的平皿置于 距灯管一定距离下照射。照射时平皿要打 开盖子，并且缓慢振荡(采用振荡嚣或电磁 搅拌设备均可)，以求照射均匀。最好在黄 色或红色灯光下操作。特别对光修复能力 强的菌株更要注意。
一、碱基类似物
• 这是一类分子结构和天然嘧啶碱或嘌呤碱相似的 化合物，这些类似物加入微生物培养基时，很容 易渗入到微生物的DNA分子中去，通过DNA复制而 引起突变。 • 常用的碱基类似物有嘧啶类似物和嘌呤类似物， 如：5—溴(或氟)尿嘧啶(5BU或5FU)、5—碘尿嘧 啶和5—溴脱氧尿嘧苷(5BUdR)等为嘧啶类似物； 2-氨基嘌呤，6-巯基嘌呤是腺嘌呤结构类似物。
A:T
A:Buk G:Bue A:T G:C G:C
G:Bue
G:C A:Buk
A:BU
A:T
A:BU
从上面可以理解到，为什么像5-BU这 类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢 和繁殖着的微生物才起作用，而对休止 细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA 分子却不起作用。
（二）碱基类似物的诱变处理方法
1、由核酸内切酶切开二聚体 的5’末端，形成3’-OH和5’-P 的单链缺口 2、核酸外切酶从5’-P到3’-OH 方向切除二聚体，并扩大缺口。 3、DNA聚合酶以另一条互补 链为模板，从原有链上暴露的 3’-OH端起合成缺失片段。 4、连接酶将新合成的3’-OH 与原有的5’-P相连接。
（二）紫外线诱变
• 由于酸碱条件影响NTG的诱变效果，因 此，无论是配制NTG溶液，还是制备菌悬 液都要用适宜的缓冲溶液。常用的有磷 酸缓冲液和Tris缓冲液。
（二）NTG的处理方法：
（1）根据处理菌体特性，选用一定范围pH值的 缓冲液(柠檬酸、Tris或磷酸缓冲液)制备菌 体或孢子悬液。如需使用萌发的孢子来处 理，则在处理以前，将孢子培养若干小时。
• 都是以量子为单位的可发射能量的射线
非电离辐射——紫外线
紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用 广泛、效果明显的物理诱变剂。紫外线可 由紫外灯管产生，设备简单、操作方便、 价格低廉。它的诱变频率高，而且不易回 复突变。迄今仍是微生物育种中最常用和 最有效的诱变剂之一。
（一）紫外线的诱变机制和DNA损伤修复
100 致死率（%） 80 60 40 20 0 0s 30s 60s 90s 120s 150s 180s 210s 240s 照射时间（s） 紫外线照射致死率
3、紫外线诱变的步骤
选择出发菌株
前培养
制备菌悬液
后培养
诱变处理
筛选
保藏
• 3、紫外线诱变的步骤与方法 • （1）出发菌株，细菌斜面培养到对数期， 霉菌或放线菌培养到孢子成熟。 • （2）前培养，细菌以肉汤为主，适量加入 核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养 基，同时还可以加入抑制修复的物质，如咖 啡碱或异烟肼等。或将菌体培养到最佳生理 状态（对数期）；霉菌、放线菌培养到绝大 部分孢子刚刚萌发。
1、紫外线的诱变机制 • 紫外线被DNA吸收后引起突变的原因主要有： • ①DNA与蛋白质的交联 • ②胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用 • ③DNA链的断裂 • ④形成嘧啶二聚体。 • 而形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。
• 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。 嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合 物，其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚 体的形成和消除。
（一）碱基类似物的诱变机制
（以5-BU为例）
• 性质：5—溴(氟)尿嘧啶 (5—BU，或5— FU)为白色无味结晶粉末，溶于水或醇 中，几乎不溶于氯仿和乙醚。
• 将细菌培养在含有5—BU的培养液中，5— BU当即被渗入到菌体中去，取代胸腺嘧啶 而与腺嘌呤配对，这是5—BU以酮式结构存 在的情况。 • 也有时5—BU以烯醇式结构状态存在于DNA中， 当DNA复制到这个碱基时，烯醇式5—BU即与鸟 嘌呤配对，在下一次DNA复制时，鸟嘌呤又按 正常碱基配对原则和胞嘧啶配对，这样，原来 的碱基对A—T就转变为G—C。
• 1、紫外线的有效光谱 紫外光是一种人眼不能感知的电磁波，位于可 见光紫光的外侧，波长在40—390nm。由于DNA分 子的紫外光吸收值为260nm，因而，波长在200 300 nm的紫外光才有诱变作用，诱发微生物突变 的紫外线最有效的波长是253.7nm。 • 一般用来灭菌消毒的30W紫外灯管，光谱分布范 围广，较平均，诱变效率较差。而15W紫外灯 管，放射出来的紫外线大约有80%波长集中在 253.7nm，因此诱变效果较好。
• NTG在水溶液中随着不同的pH将产生不同的分 解物，从而影响诱变效应。 • 当溶液pH低于5.5时， NTG分解成HNO2 ，HNO2 本身就具有诱变作用； • 当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲 烷，对核酸起烷化作用，引起微生物突变； • 当溶液pH在6.0时，NTG本身和DNA起烷化反应 而导致突变。通常在pH6.0的条件下进行诱变 处理。
嘧 啶 的 紫 外 线 光 化 产 物
• 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺 嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体， 它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引 起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常 配对，从而引起突变或死亡。 • 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较 少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开。
第三章
工业微生物育种诱变剂
第一节 物理诱变剂 第二节 化学诱变剂
1927年就有人指出x射线所诱发的 果蝇性状变异是基因突变。二次世界大 战后，又发现化学物质氮芥子气对细胞 也有类似于x射线的损伤能力。其后人 们逐渐发现有诱变效应的天然物或人工 合成物很多。
• 诱变剂（mutagen）：能诱发基因突变, 并使突变率提高到超过自发突变水平的 物理或化学因子都叫做诱变剂。 • 种类：大体上可分为物理的、化学的和 生物的三大类。 • 下面按照诱变剂引起遗传物质结构变化 的特点讨论几种有代表性的诱变剂的作 用机制。
诱变处理的步骤： 斜面
液体培养基（前培养）
5-BUHale Waihona Puke Baidu
饥饿培养（8-10h）
涂布培养（诱变处理）
筛选
• 诱变处理方法： • 将待处理的微生物孢子或菌体涂布在含一 定浓度的碱基类似物的培养基平皿上。在 培养过程中处理。 • 5—BU，或5—FU一般选用剂量为5—300微 克／毫升，如菌体事先经饥饿法处理，即 将待处理的微生物，特别是细菌放置在生 理盐水中培养过夜，消耗掉菌体内贮存的 部分物质，再接种在含5—BU，或5—FU的 培养基上，可提高碱基类似物渗入DNA的 量，效果更好。