大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
大鼠皮层神经元细胞原代培养 ppt课件
Hale Waihona Puke ppt课件11实验步骤
5 剪碎：
将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用 手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗 三次，转移至离心管中离心1000 rpm 5min 。
6 消化：
加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化 20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。
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实验步骤
布局
器械
PBS 剪碎组织块
取脑，分离皮层神经 元
剥离血管及筋膜
PBS
冰盒
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酒精
PBS
断头
清洗血液
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实验步骤
3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿
内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无 菌的生理盐水冰浴上。
4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯
培养基
材料
包被
剥膜
消化
低温操作
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影响因素
材料选择
胎鼠就要胎鼠，新 生鼠就要新生鼠， 不能混淆
★易于操作 ★有一些受体，在 培养的工作中失去 功能，会不能再生
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影响因素
培养基选择
不建议血清培养
1 血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，影响神经元产量； 2 抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验； 3血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，
皮层神经元细胞原代培养
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☞ 主要内容 :
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实验原理
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。
辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。
5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代
大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂Poly-L-lysine (Sigma,P2636)DMEM (Invitrogen,11995-065)二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪x13ml 移液管( Biologix, 30-0138A1)南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-011) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141)4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112)5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056)6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B )7) dd H 2O8) 75％酒精1) 2) 100 ml 小烧杯3) 200 目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790)6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641)7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010)9)10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B11) 注射器：50ml、5ml 各112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15 分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30 分钟。
2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2取PLL用DPBS将其稀释至100 pg/ml 。
2.3以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。
一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定_姜茜
·技术方法·一种改进的大鼠皮层神经元原代培养方法及其性质鉴定姜 茜,姜玉武■,王静敏,秦 炯,吴希如(北京大学第一医院儿科,北京 100034)[摘 要]目的:对原有大鼠皮层神经元原代培养方法进行改进,以获得数量更多、纯度更高、体外生长时间更长的神经细胞进行相关实验研究。
方法:使用3种不同成分的液体对培养器皿进行序贯预处理,分离16～17d 胎龄的Wi s t a r 大鼠胎鼠皮层,采用木瓜蛋白酶化学消化与机械吹打相结合的方法制备单细胞悬液,经细胞计数后按照不同实验目的进行梯度密度接种。
细胞接种当日4～6h 将含有血清的接种培养液换为添加B 27的N e u r o b a s a l 无血清培养基,培养第3天(D I V 3)用终浓度10μm o l /L 的阿糖胞苷(c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ,A r a -C )处理24h 抑制胶质细胞增殖,以后每周半量换液1次。
用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e dp r o t e i n 2,M A P 2)与细胞核双标记法鉴定培养神经细胞的纯度,并以免疫荧光法检测突触前、后标记物以评估突触形成情况。
结果:与单纯多聚赖氨酸预处理培养器皿,胰蛋白酶化学消化法分离细胞及含血清培养基培养的原方法相比,方法改进以后收获的细胞产量明显增加,且消化过程对细胞损伤小,接种后细胞分散均匀,杂质少,纯度高,树突、突触发育正常,可长期存活。
结论:该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠皮层神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型。
[关键词]大脑皮质;神经元;细胞,培养的;木瓜蛋白酶;免疫组织化学[中图分类号]R 329.2 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2009)02-0212-05d o i :10.3969/j .i s s n .1671-167X .2009.02.019A ni m p r o v e dm e t h o df o r p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n a n d c e l l i d e n t i f i c a t i o nJ I A N GQ i a n ,J I A N GY u -w u ■,WA N GJ i n g -m i n ,Q I NJ i o n g ,WUX i -r u (D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s ,P e k i n g U n i v e r s i t y F i r s t H o s p i t a l ,B e i j i n g 100034,C h i n a )A B S T R A C T O b j e c t i v e :T o i m p r o v e p r e v i o u s m e t h o d o f p r i m a r y r a t c o r t i c a l n e u r o nc u l t u r e t o g e t p u r e ra n d m o r e l o n g -l a s t i n g c e l l s f o r s t u d y .Me t h o d s :T i m e d -p r e g n a n t W i s t a r r a t s a t a g e s t a t i o n a l a g e o f 16o r 17d a y s (16-17d )w e r e u s e d .F e t a lb r a i n s w e r e r e m o v e d a n d t h ec e r e b r a l c o r t i c e s w e r ed i s se c t e d o u t .P a p a i n d i g e s t i o na n dm e c h a n i c a l d i s s o c i a t i o nw e r ec o m b i n e dt oc o n d u c t m o n o -c e l l s u s p e n d i n g m e d i a .F o u r t o s i x h o u r s (4-6h )p o s t -p l a t i n g ,a l l p l a t i n g m e d i a w e r e r e m o v e df r o mc u l t u r e s a n d r e p l a c e d w i t h N e u r o b a s a l m e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h B 27.O n t h e t h i r d d a y ,10μm o l /L c y t o s i n e a r a b i n o s i d e (A r a -C )w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e f o r 24h t o i n h i b i t t h e o u tg r o w t ho f g l i a l c e l l s .H a l f o f th e c u l t u r e m e di u mw a s c h a n g e d e v e r yw e e k .T h e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o f n e u r o nc e l l s w e r eo b s e r v e db yl i g h t m i c r o s c o p e .D o u b l e i m m u n o -s t a i n i n g o f m i c r o t u b u l e -a s s o c i a t e d p r o t e i n 2(M A P 2)a n d k a r y o n w e r e a p p l i e d t o a s s e s s t h e c u l t u r e p u r i t y .E v a l u a t i o n o f s y n a p s e f o r m a t i o n w a s p r o c e s s e d b y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s u s i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h p r e -a n d p o s t s y n a p t i c p r o t e i n m a r k e r s .R e s u l t s :T h e i m p r o v e d m e t h o d c o u l dr e -m a r k a b l y i n c r e a s e t h e c e l l n u m b e r a n d r e d u c e n e u r o n a l d a m n i f i c a t i o n .T h e p r i m a r y c u l t u r e w a s c h a r a c t e -r i z e d b y h i g h u n i f o r m i t y ,p u r i t y ,n o r m a l s y n a p s e f o r m a t i o n a n d l o n g t i m e l i v a b i l i t y .C o n c l u s i o n :T h i s i s a s i m p l e a n d r e l i a b l e t e c h n i q u e f o r t h e i n v i t r o p r i m a r y c u l t u r e o f r a t c o r t i c a l n e u r o n s .K E Y WO R D S C e r e b r a l c o r t e x ;N e u r o n s ;C e l l ,c u l t u r e d ;P a p a i n ;I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270448、30470555、30870865)S u p p o r t e db yN a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (30270448,30470555,30870865)■C o r r e s p o n d i n ga u t h o r 's e -m a i l ,j i a n g y w @263.n e t 神经细胞是构成神经系统的基本结构和功能单位。
新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定
新生大鼠视皮层神经元的原代培养及鉴定宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【摘要】目的探讨新生大鼠视皮层神经元的原代培养方法,以获取数量多、纯度高的视皮层神经元.方法取新生1d内的SD大鼠视皮层,通过胰酶消化法获取单细胞悬液,倒置相差显微镜下计数后种植于6孔培养板内培养.培养24 h后用终浓度10μmol·L-1阿糖胞苷处理,抑制非神经元的生长,作用24h后半量换液,以后每隔1d半量换液1次.每天倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况和形态变化,Nissl染色法进行视皮层神经元鉴定,免疫荧光显示神经元特异性烯醇化酶鉴定培养视皮层神经元的纯度.结果接种4h后,大部分细胞已贴壁,细胞立体感较强；接种后24h,大部分细胞长出短的突起,细胞形态发生变化,胞体呈多边形或三角形,细胞周围有或多或少的光晕；培养4d后,细胞突起伸长、增粗；培养6～8d后,细胞状态较佳,细胞胞体饱满,光晕明显,突起进一步伸长、增粗,且分支多,突起交织成网状,非神经元细胞减少,为实验的最佳时间；培养14 d后,细胞开始退化.培养6d行焦油紫染后,倒置相差显微镜下观察,可见细胞内的尼氏体呈蓝紫色的颗粒或斑块.免疫荧光染色结果显示,原代培养的细胞中,大部分细胞为绿染细胞,形态良好,核大而清晰,神经元所占比例高.结论本研究获得视皮层神经元的方法简单经济,通过形态学观察、Nissl 染色及免疫荧光染色可以对体外培养的视皮层神经元细胞进行准确鉴定.【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2013(033)008【总页数】3页(P733-735)【关键词】视皮层;神经元;原代培养;大鼠【作者】宋海岩;邓晓慧;赵超;连辉【作者单位】453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室;453000 河南省新乡市,解放军371医院;453003 河南省新乡市,新乡医学院基础医学院解剖学教研室【正文语种】中文视皮层是视觉系统的高级中枢，培养观察视皮层神经元对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的基础研究具有重要的意义。
新生鼠海马、皮层神经元原代培养
新生鼠海马、皮层神经元原代培养实验材料1. 实验动物新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。
2. 试剂Hibernate ANeurobasal AB27 serum-free supplementsPapin （木瓜蛋白酶）DNAase IOptiPrep Density Gradient MediumPoly-L-lysine （多聚赖氨酸）L-glutamine （L-谷氨酰胺）Penicillin （青霉素）Streptomycin （链霉素）D-Hank’s solutiondd H2O3. 溶液配制1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。
（可配成25×）2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。
3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。
在使用前3h内配制。
4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。
可一次配好，-20°C保存，每次取用。
4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。
现用现配，37°C保存备用。
5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。
5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。
现用现配，37°C保存备用。
4．实验方法1. 包被培养皿使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。
原代神经元培养
神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。
一、培养前准备1.器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。
由于湿热消毒对手术器械容易可用70 - 80%酒精浸泡1小时以上消毒。
器皿：1）玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。
2）培养瓶、盖玻片培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。
凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。
3）移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。
4）塑料培养皿（35mm ）塑料培养板（6、24、96孔I辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。
2.培养基和培养用液的配制1）培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。
本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。
2）平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。
各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。
3）培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。
神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6§儿。
目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。
4）血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。
分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟工5）胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。
先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。
用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月一、试剂1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2)DMEM（Invitrogen,11995-065）3)FBS（Invitroge,10099-141）4)Neurobasal（Invitrogen, 21103-049）5)B27（Invitrogen ,17504-044）6)GlutaMAX （Invitrogen ,35050-061）7)HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）8)0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）10)dd H2O11)10％水合氯醛12)75％酒精二、器械1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12)200 ml小烧杯（盛放胎鼠）3)200目不锈钢筛4)细胞计数器（求精）5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）8)3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）9)过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）10)注射器：50ml、5ml各 111)Pipette and pipette tips12)冰袋、手套、棉球、棉签Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
原代神经细胞培养
原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。
2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。
3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。
包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。
4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。
取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。
2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。
3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。
4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。
注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。
5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。
6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。
7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。
8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。
9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。
大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定
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（ ．沈 阳医 学 院 教 务 处 ，辽 宁 沈 阳 １０ ３ １ １０ ４；２ 基 础 医学 院组 织 与 胚 胎 学 教 研 室 ） ．
［ 摘要 ］目的 ：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有 效的鉴定其 纯度 。方法 ：分 离 Ｗｉａ大鼠胚胎 并 ｓ ｔ 取海马组织 ，比较 两种 常用酶 ，胰 酶和木瓜 酶消化效果对海马神经元产量的影响及 两种不 同培养方法对海马神 经元纯度 的
原代海马及皮质神经元培养方法
原代海马及皮质神经元培养实验材料：18-20天孕鼠一只,细胞培养板若干实验试剂：细胞培养基（DMEM+10%FBS+1%HEPES+0.2%PSA）,FBS,HBSS,胰酶，10ug/ml Poly-D-Lysine，灭菌超纯水实验器械：显微手术器械一套（直镊，弯镊和显微剪各一把），动物手术器械（中号镊子2把，直剪两把），小号细菌培养皿两个，250ml灭菌烧杯两个，灭菌玻璃吸管，胶头，5ml或10ml灭菌EP管实验步骤：1、实验准备：灭菌消毒，将实验所需手术器械浸泡70%酒精30min，高压灭菌超纯水与250ml烧杯。
2、Poly-D-Lysine铺板，铺板时间5-30min，然后灭菌超纯水洗两次。
3、麻醉18-20天孕鼠（10%水合氯醛腹腔注射3-4ml/kg,一般注射1.5ml），取胚胎，置于灭菌烧杯，以薄膜手套封盖，送至细胞房。
4、剪头，取脑，置于盛有HBSS的细菌培养皿。
5、剥离海马及皮质，置于HBSS中。
6、剥去血管，用镊子撕碎，吸至5mlEP管。
7、加HBSS冲洗干净后，加胰酶（胰酶体积视细胞量而定，一般10X胰酶比例为1：10），置37℃ CO2培养箱消化10min（8min）。
8、吸去胰酶，加FBS（约为总体积的20%）终止消化反应1.5-2min。
9、吸去FBS，加HBSS，反复吹打直至细胞分散均匀（无明显团块及组织碎块，以吹至成乳白色混悬液为宜）。
10、吹打均匀后细胞计数。
11、低速离心机800r/min离心10min。
12、吸去上清，加细胞培养基，吹散均匀，种于细胞培养板（一般6孔板种1*106/孔，依此类推，若需转染则适当加大细胞量）。
13、置于CO2培养箱孵育。
胚胎大鼠皮质神经元培养中细胞消化及重悬改进-细胞生物学论文-生物学论文
胚胎大鼠皮质神经元培养中细胞消化及重悬改进-细胞生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——随着现代神经科学及分子生物学的发展，在多个研究领域中原代大鼠大脑皮层神经细胞的培养日益被广泛应用，不仅促进了对神经元结构和功能的进一步了解，还为大脑神经系统疾病发病机制研究及药物的作用机制研究提供了一个平台。
但在具体的实验操作中，胎鼠大脑皮层神经元的分离和体外培养方面仍然存在一系列问题，如胎鼠胎龄难以控制，新生鼠进行神经元培养时细胞存活率较低，细胞数量少、细胞损伤大及神经元纯度欠佳等，严重限制了后续研究的进行。
因此，本研究在参照相关文献[1-5]及反复实验的基础上，对细胞消化及重悬细胞等步骤进行了适当改进，得到了较理想的培养结果。
详情如下。
1 材料与方法1.1材料1.1.1实验动物将适龄的Wistar大鼠（吉大医学部实验动物中心提供）雌雄各一只合笼过夜，次日观察，以见到阴栓开始将该雌鼠单独饲养并计算时间。
以24h为1d,至第16d时可用于实验。
1.1.2实验试剂及溶液的配制多聚赖氨酸（分子量70,000-150,000）购自美国Sigma公司。
L-谷氨酰胺（200mM 100X）、DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司。
细胞爬片（24孔）购自alafa公司。
胎牛血清购自四季青公司。
B27、Neurobasal神经元专用培养液、兔抗大鼠一抗、山羊抗兔荧光二抗购自美国life公司。
PBS缓冲液pH调至7.3-7.4,高压灭菌，4℃保存。
PDL包被液：用三蒸水配制1mg/ml的PDL储液，微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
含血清培养液：87%Neurobasal+2%B27（50）+1%L-glutamine（200mmol/L）+10%胎牛血清，混匀，4℃保存。
无血清培养液：97%Neurobasal+2%B27（50）+1%L-glutamine（200mmol/L）,混匀，4℃保存备用。
神经元培养步骤
神经元培养步骤新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定11 21 1 培养器皿的预处理: 包被D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入24孔聚乙烯培养板( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿( Falcon) 内, 在培养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸50Ll/ cm2 包被血盖片及培养皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。
临用前吸弃D- 多聚赖氨酸液, HBSS液清洗2 次即可使用。
1.大鼠大脑皮质神经元的分离及培养2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相差显微镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。
台盼蓝染色计数活细胞取0.1 mL 的体积分数为0.4% 台盼蓝加到0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞) 及染色的细胞数(死细胞)。
用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。
计算公式: 每mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数/4 X 104X稀释倍数。
3-1神经元的免疫细胞化学鉴定Dapi + NF3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)将细胞爬片的小玻片用0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数30 个视野( 目镜10 @ , 物镜20 @ , 框面积0. 3 mm2) 内的神经细胞数。
连续观察10 d, 并拍照记录。
神经元比例( % ) = NF阳性细胞数/DAPI(+) 星形胶质细胞比例( % ) = GFAP阳性细胞数/DAPI(+)鉴定②NF 荧光免疫细胞化学染色 : 神经丝( neurofilaments, NF) 蛋白是构成神经轴突和树突的主要结构成分 , 在中枢和外周神经系统的神经元细胞核周、特别是轴突有表达, 也是神经元特异性标志物之一。
神经元细胞原代培养完美版说明(重医舟之行)
神经元细胞原代培养完美版说明1.材料选择。
一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献的材料一致。
胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。
因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如NMDA 受体。
和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。
很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞错了实验对象，请确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。
2.培养基选择(neurbasal/neurobasal-a,invitrogen Co.ltd)。
我强烈不建议用血清培养。
原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂，最后非常影响神经元产量;其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。
严重的毒性会影响许多灵敏实验;再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。
Invitrogen/GIBCO 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准，最好的培养基。
需要的添加剂为B27和谷氨酰胺。
培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。
其中，neurobasal是胎鼠培养基，而-A 为新生鼠培养基。
不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。
很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。
由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。
注意!由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的B27(也有用N2的，但是推荐B27，只差10美金)，血清有复杂的解毒作用而B27没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。
所以，如果你在neurobasal里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。
另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用时候要现配现加。
大概是0.5-2mmol/l大部分人用0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上遇冷。
新生大鼠大脑皮层神经细胞培养及影响因素
实用医药杂志!""#年$"月第!!卷第$"期%&’()*+,-%.’&/0123!!4!""#5$"620$"神经细胞是近代神经学科中研究重点之一，在体外特定环境中，通过培养可以连续地直接观察神经细胞或神经胶质细胞的形态、生长、分化、迁移、突触形成、理化改变以及对环境的反应。
本文结合新生大鼠大脑皮层神经细胞的培养，对影响神经细胞培养的诸因素及其作用做了初步探讨。
$材料和方法$0$材料新生789:’&大鼠、高糖;*<*、新生马血清、=’>?’9液（@ABCDBEF）、混合GB血清、胎牛血清H杭州四季春I、胰岛素、F5多聚赖氨酸HJ8K/’I、阿糖胞苷、青霉素、!L孔培养板HMGFCD6产品I。
$0!方法$0!0$培养孔的准备N$O取无菌!L孔培养板，各加入$""!3 F5多聚赖氨酸使其铺满孔底N!O，静止$#/8>后弃去，培养孔内加入;*<*培养液，PQR、#SCD!孵箱放置$.后备用。
$0!0!新生大鼠脑细胞悬液的制备NPO在无菌条件下取出新生大鼠的大脑，用含$"""T U/3青霉素的=’>?’9液漂洗P 遍，尽量去除脑膜、血管和血细胞，放入无菌青霉素小瓶内，用眼科剪将脑组织剪碎块，加入$/3"0$!#S胰蛋白酶PQR 孵箱!"/8>，$"""&U/8>离心P/8>，弃上清，用含马血清的;*<*重悬沉淀物，自然沉淀后取上清液调节细胞数至!V $"W个U/3备用。
$0!0P神经细胞培养将制备好的细胞悬液接种于培养孔中，按试验设计方案PQR、#SCD!孵箱进行培养。
!结果在笔者施加的各种处理因素下，初接种的神经细胞都呈圆形，多无突起。
神经细胞图片集锦（高清）
神经细胞培养精美图片一、细胞种类：原代培养大鼠脑皮质神经元细胞培养天数：8天放大倍数：倒置相差显微镜放大200倍细胞状态说明：细胞之间形成明显的神经网络，神经元胞体呈圆形或椭圆形，突起细长多为2到3个。
二、【原创图片】神经细胞1. 细胞种类：胎鼠（16天）皮层神经元2. 培养的天数：5天3. 放大倍数：数码相机套在倒置显微镜镜头上拍的，倍数不确切。
4. 培养基种类：Neurobasal＋B27＋L-glutamine5. 细胞状态与特征简述：贴壁生长，胞体类圆形，见丝状突起连成网络状。
三、1、细胞种类：大鼠脑皮质神经元2、培养的天数：8天3.放大倍数：倒置荧光显微镜×1004. 培养基种类：高糖DMEM培养基＋10％胎牛血清5.细胞状态与特征简述：MAP-2染色阳性的神经元，染色主要集中在神经元的树突和胞体。
四、1、细胞来源：大鼠脑灰质2、细胞种类：活化的小胶质细胞3、培养的天数：8天4、放大倍数：倒置显微镜×4005、培养基种类：高糖DMEM培养基＋10％胎牛血清6、细胞状态与特征简述：小胶质细胞是脑内的免疫细胞，正常静息状态下呈分支状，本照片为脑损伤后CD68鉴定的染成红色的活化的圆形小胶质细胞。
五．【原创】原代海马神经元细胞1.细胞种类：原代海马神经元细胞；2.Wistar新生24小时大鼠3.培养的天数：原代第7天；4.放大倍数：倒置显微镜 X400；5.培养基种类：DMEM/F12加10%胎牛血清和2%B27（换液用的是无血清培养基）；6.细胞状态与特征简述：神经细胞形态典型，胞体粗大，轴突相互交叉，突起成网络。
六、【原创】1.细胞种类：S-D大鼠原代海马神经元2.培养的天数：第七天3.放大倍速：倒置显微镜放大倍数：100倍4.培养基种类：DMEM+5%马血清＋NT-35.细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长，呈锥形或圆形，3－4个突起，透光度很好。
底层有很多扁平的细胞，胞体紧挨着，大部分没有突起，培养第五天时底层以铺满。
新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立
新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立目的建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞原代培养方法并建立糖-氧剥夺细胞损伤模型。
方法取新生的大鼠（24 h）大脑皮层组织，消化后种植在多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养皿上，用含10%胎牛血清DEME-HG液种植，4~8 h 后换再用含有B27的Neurobasal培养基维持饲养。
于不同时间点在倒置相差显微镜下观察形态变化，用免疫组化方法对神经元特异性标记物NSE染色鉴定。
选取培养第7 d的神经元随机分为不作处理的对照组和过糖-氧剥夺建立细胞损伤模型组，Western blotting检测NSE蛋白表达。
结果2~8 h神经元细胞贴壁，随着时间的延长，形态呈多变，突起逐渐增多，神经元突起间相互接触形成网络，培养7~10 d时神经元胞体最为丰满，通过免疫组化验证证明所分离培养的是神经元细胞。
糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组NSE蛋白表达量明显降低。
结论该神经元方法简单易行，神经元纯度较高，并成功的建立糖-氧剥夺神经元损伤模型。
标签：神经元；原代培养；neurobasal培养基；B27；糖-氧剥夺；细胞模型神经元细胞培养技术是一种常用的技术，广泛用于神经系统疾病的细胞模型[1]，可为神经系统的发病机制和神经保护性药物的筛选提供良好的平台。
在以往关于缺血/缺氧脑损伤的研究中，主要集中在动物体内研究，虽然在体试验更接近动物的实际状态，但易受到其他因素影响。
体外原代培养神经元细胞，可以得到比较均一的细胞，可根据实验要求控制神经元细胞的生成，有利于动态观察神经元细胞的形态学变化，从而避免了体内研究的许多复杂因素的影响[2]。
1资料与方法1.1一般资料出生后新24 h内的SD大鼠，购于新疆医科大学实验动物中心；Neurobasal培养液、B27培养基添加剂、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培养基（Hyclone）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（abcam公司）；多聚-L-赖氨酸、SP免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。
原代丘脑皮质神经元分离方法
原代丘脑皮质神经元分离方法原代丘脑皮质神经元的分离方法通常涉及以下步骤：
1. 动物准备，首先需要选择合适的实验动物，通常选择小鼠或
大鼠。
然后按照实验室的动物伦理规定进行动物实验的准备工作，
包括动物麻醉、解剖等。
2. 大脑解剖，将动物的大脑迅速取出，并将其放置在含有冰冷
的灌流液的培养皿中，以保持组织的完整性和新鲜度。
3. 组织切割，使用显微镜和细长的切割刀，将原代丘脑皮质区
域切割下来。
这个过程需要非常小心和精细的操作，以确保获得高
质量的神经元。
4. 细胞分离，将切割下来的组织置于含有特定酶类的酶解液中，进行酶解过程。
酶解的时间和酶解液的配方需要根据具体实验的要
求进行调整。
5. 细胞收集，经过酶解后，使用各种技术（如过筛、离心等）
将神经元从其他细胞和组织碎片中分离出来。
6. 细胞培养，将分离得到的原代丘脑皮质神经元进行培养，提供适当的培养基和培养条件，以促进神经元的生长和存活。
需要注意的是，以上步骤中的具体操作和条件可能会因实验目的、实验室设备和实验者经验等因素而有所不同。
在进行原代丘脑皮质神经元分离实验时，需要严格遵守实验室的安全操作规程和动物实验伦理规定，以确保实验的科学性和合法性。
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大鼠大脑皮层神经元细胞原代培养
南京军区总院神经内科实验室许丽丽2012年10月
一、试剂
1)Poly-L-lysine（Sigma,P2636）
2)DMEM（Invitrogen,11995-065）
3)FBS（Invitroge,10099-141）
4)Neurobasal（Invitrogen,21103-049）
5)B27（Invitrogen,17504-044）
6)GlutaMAX（Invitrogen,35050-061）
7)HBSS,noCalcium,noMagnesium（Invitrogen,14170-112）
8)0.25%Trypsin-EDTA（Invitrogen,25200-056）
9)DPBS（HyClone，SH30028.01B）
10)ddH2O
11)10％水合氯醛
12)75％酒精
二、器械
1)手术器械：组织剪x2、组织镊x1、直弯镊各x1、眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，
WA3050）、显微剪x1
2)200ml小烧杯（盛放胎鼠）
3)200目不锈钢筛
4)细胞计数器（求精）
5)50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）
6)6孔板（Corning，3516）或24孔板（Corning，3524）96孔板（cosrer,3599）
7)直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）
8)3ml移液管（Biologix,30-0138A1）
9)过滤器（Millex-GP,SLGP033RB）
10)注射器：50ml、5ml各1
11)Pipetteandpipettetips
12)冰袋、手套、棉球、棉签
Day1
1、消毒
1.1将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。
1.2打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、包被培养板
2.1戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
2.2取PLL，用DPBS将其稀释至100μg/ml。
2.3以PLL包被培养板，量以覆盖培养板底面为宜。
6孔板：1mlperwell；24孔板：0.5ml
perwell；96孔板：0.1mlperwell。
过夜。
3、配置培养基、消化酶
3.1 DMEMwith10%FBS
FBS：DMEM=1：10
取FBS4ml、DMEM40ml加入50ml离心管中混合。
3.2Neurobasal-B27-GlutamineMedium
Neurobasal：B27=50:1
Neurobasal：GlutaMAX=100:1
取Neurobasal50ml、B271ml、GlutaMAX0.5ml，加入50ml离心管中混合。
3.30.125％胰酶
取0.25％Trypsin-EDTA5ml,用HBSS稀释至10ml。
将配置好的培养基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。
4、消毒
操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。
Day2
1、消毒
打开操作台紫外线灯消毒30分钟。
2、洗板
用ddH2O洗涤3x5min，放入培养箱中晾干。
3、解剖孕鼠
3.1将已消过毒的解剖工具和已乘HBSS的小烧杯端入动物房。
3.2麻醉：取10％水合氯醛5ml,腹腔注射麻醉孕鼠。
3.375％酒精消毒切口部位。
3.4开腹（尽量开口大一些，便于后面操作）
使用1把组织镊、1把组织剪。
3.5分离胎囊。
换用另一幅直/弯镊、组织剪。
3.6将分离出的胎囊放入HBSS中。
4、解剖胎鼠（所有操作在冰袋上进行）
4.1将盛放胎囊的烧杯放进操作台。
4.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。
4.3取3个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。
将胎鼠从胎囊中取出，剪去头，将胎头放入一个培养皿中。
4.5 用两支显微镊撕开脑膜，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有
的胎鼠都同样处理）。
4.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入
另一新的内乘HBSS的培养皿中。
4.7 将分离好的脑膜用虹膜剪剪碎脑组织，约1mm3。
5、接种细胞
5.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15ml离心管中。
5.2 每支离心管加入3ml0.125％胰酶，摇匀，37℃消化15分钟（为增加接触面积消化更充
分可将离心管平放，也可以用60mm培养皿消化。
）
5.3消化期间整理操作台。
5.4消化15分钟后，用移液管移去胰酶，每支离心管加入2ml10％FBS/DMEM终止消化。
5.5吹打：用1ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。
下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10％FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。
一共这样分次吹打3次。
3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。
（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。
吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。
）
5.6过筛网至60mm培养皿中。
5.7将培养皿中液体移入2支15ml离心管中。
5.8离心：800转5分钟。
5.9弃上清，沉淀的细胞加10％FBS/DMEM3ml重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细
胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。
5.10用细胞计数板计数：细胞浓度=(4个大格细胞总数/4)×104/ml
5.11调浓度，接种。
接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经
元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。
要左右平行翻转角度，然后前后
平行翻转角度）。
具体细胞接种数值：
培养液体积（ml/well）细胞密度（个/ml）总细胞数（个/well）
1.5ml 1x1061x106
6孔板
96孔板0.1ml1x1061x105
5.12两小时后全量换液，换用NB27（应提前放入37℃细胞培养箱中预热半小时）。
换液前
轻轻晃动培养板（细胞碎片贴壁很慢而且不牢固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎
片。
）
6、消毒
实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外
线灯消毒30分钟。
7、换液
细胞培养成功后每天观察细胞生长状态，每3天1/3量或半量换液。
注意：换液前要将NB27 放入37℃细胞培养箱中预热半小时。